우리는 그라 이오 스탯을 사용하는 권한에 대해 프레드 허친슨 암 연구 센터의 조나단 쿠퍼 연구소 감사드립니다. 이 작품은 NIH와 WM 중사 님 재단에 의해 지원되었다. BM은 생명 과학 연구 재단의 고든 무어와 베티의 동료입니다. 우리는 우리와의 고정 프로토콜을 공유 다니엘 Gottschling에 감사하고 있습니다.

1. 효모 커뮤니티 해결 <ol><li> 막 필터 (, 그림 2A 예를 들어, Millipore MF 막 필터)에 효모 커뮤니티를 성장. 이 프로토콜은 6mm 지름의 멤브레인 필터에 미만 2x10 8 셀의 전형적인 지역 사회에 해당합니다. </li><li> 잘 1cm 지름 (그림 2B)의 하단을 충당하기 위해 워트 먼지 541 필터 종이를 사용합니다. 이 워트 먼지 용지는 나중에 단계에서 지역 사회를 전송하는 캐리어로 사용됩니다. 잘에 1 ML 100 % 메탄올을 추가하고 평형을 할 수있는 온도 -20에서 잘 ° C 둡니다. </li><li> dewar의 액체 N 2 놔. 액체에 적어도 15 초 동안 지역 사회를 찍어 N 2 트위터 (그림 2C)를 사용하여 액체 질소에 지역 사회를 멈춰 봐. </li><li> -20 ° C의 메탄올 (그림 2D)의 우물 냉동 사회를 전송합니다. 메탄올에 잠수 할 때 지역 사회가 수평 유지되어 있는지 확인합니다.20 분 동안 기다리십시오. MF 막 필터는 메탄올에서 분해하기 시작합니다. </li><li> 잘 메탄올의 증발 (그림 2E)에 -20 ° C에서 보관 감기에 페트리 접시에 메탄올의 커뮤니티 캐리어를 사용하여 워트 먼지 541 필터 종이를 전송합니다. 전송하면, 캐리어 워트 먼지 필터의 상단에있는 지역 사회를 유지하고 추위를 페트리 접시에 올려 놓기 전에 두꺼운 워트 먼지 용지의 다른 부분을 사용하여 메탄올의 추가 하락을 멀리립니다. 이 증발 시간이 샘플에서 샘플에 일관성이 있는지 확인합니다. </li><li> 캐리어 워트 먼지 필터가 건조해질 때까지 증발하는 데 4 ~ 6 시​​간 정도 기다립니다. 부족 증발 sectioning을 방해 잔류 메탄올을 남긴다. 지역 사회에 원인의 균열과 변형을 걸쳐 건조. </li><li> -20 ° C의 냉동고의 샘플을보세요. 커뮤니티에 포함되지 워트 먼지 541 필터 종이를 멀리 자른다. </li><li> 샘플은 적어도 ~ 2mm 여백에서이되도록 충분히 큰 사각형 입방 알루미늄 호일 컨테이너를 확인각면 (그림 2F). 알루미늄 호일 컨테이너의 바닥 표면에 커뮤니티를 놓고, 즉시 3 10월와 샘플 ~ 지역 사회의 높이 위의 4mm을 다룹니다. 중요한 경우, 샘플의 방향은 컨테이너의 측면과 관련하여이 단계에서 조정할 수 있습니다. 10 분 기다립니다. </li><li> 고정하는 드라이 아이스에 금속 접시에 월 임베디드 샘플을 놓습니다. -20 ° C 또는 -80 ° C의 냉동고에서 냉동 커뮤니티를 저장합니다. </li></ol> 2. 형광 이미징을위한 냉동 커뮤니티 Sectioning <ol><li> -25 ° C에 cryosection 챔버의 온도를 설정하고 그 온도가 챔버의 온도를 도달 할 때까지 챔버에서 샘플을 둡니다. </li><li> 마운트에 10월 한 방울를 적용한 후에 cryo-마운트에 샘플을 탑재합니다. 10월 두께 2-3 MM이야 수 있도록 노출 워트 먼지 필터 종이 (컨테이너의 하단)와 시료의 측면에 균일하게 10월을 알리십시오. SE 전에 그라 이오 스탯 챔버 내부 10월 동결하자ctioning. 샘플의 모든 측면에 2~3밀리미터의 10월 마진을 보장하는 것은 섹션의 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 10월 샘플 블록의 측면은 샘플을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플이 블레이드에 대해 정렬되지 않은 경우 sectioning은 샘플의 구석 또는 측면에서 시작됩니다. 블레이드는 샘플 블록의 완벽한 수직 (또는 수평)의 얼굴을 잘라 수 있도록 마운트를 조정합니다. </li><li> 효모 지역 사회를위한 일반적인 섹션 ~ 14 μm 두께입니다. 섹션을 절단 한 후, 천천히 컷 섹션으로 슬라이드를 접근하여 섹션을 수집 실온에서 보관 현미경 슬라이드를 사용합니다. 섹션은 녹기과 현미경 슬라이드에 전송합니다. 18 섹션으로 하나의 슬라이드에 전송 할 수 있습니다. </li><li> 바람직하게는 -20 차가운 온도, ° C, 이미징 전에에서 슬라이드를 저장합니다. 4 ° C.에 1 주일 동안 보관했을 때 신호의 손실을 최소화합니다 최대 형광 신호를 들어, 영상은 바람직 sectioning 후 즉시 이루어집니다. </li></ol>

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	<li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities.">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li><li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms:+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members."> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li><li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease.">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li><li>V&#225;chov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony:+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter.">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li><li>Min&#225;rikov&#225;, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies.">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li><li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations.">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li><li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities.">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , (2012).</li><li>Kiernan, J., ed, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).</li><li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rim101p/PacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies.">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 절차는 효모 지역 사회의 내부 구조를 검사 할 수있는 방법을 제공합니다. 메탄올 고정 단계 8 효모 식민지는 융통성하게하고 식민지의 무결성을 유지하지만, 또한 그 결과를 해석에 고려되어야 수축 8됩니다. 우리는 일반적으로 직접 구를 해결하지 않고 10월에 포함 된 식민지에 비해 효모 식민지의 높이에서 30 %의 수축을 참조하십시오. 수축을 방지하기 위해 cryosectioning에 대한 대안 접근 방식은 직접 10월에있는 커뮤니티를 포함하고이를 고정하는 것입니다. 형광은 직접 삽입에 따라 방법으로 보존하지만, 단점은 각 섹션 내에서 세포를 함께 구속하지 않는입니다. 그 결과, 거리에 섹션 부동, 그리고 섹션의 가장자리에있는 세포의 일부가 sectioning 과정에서 장애 (그림 4) 고통 가능성이 더 높습니다. 그는에 초점을 맞춘 아니지만다시, 효모 지역 사회의 크로스 섹션의 밝은 분야 이미지는 우리에게 지역 사회 구 내에서 세포의 상태에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다. 관심의 재산이 고정 단계의 영향을인지 아닌지는 사안별로 심사해야합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 100 % 메탄올 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 - 테크 10월 컴파운드 </td><td> Andwin 과학 </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 워트 먼지 학년 번호 541 수량 필터 종이 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF 막 필터 </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning yeast communities for examining fluorescence patterns

미생물은 일반적으로 지역 사회에 살고 있습니다. 지역 사회 내에서 세포의 공간적 조직은 지역 사회 (1)의 생존과 기능에 영향을 미칠 것으로되어 있습니다. 공 촛점과 두 광자 현미경 등의 광학 sectioning 기술, 박테리아 및 archaeal 지역 사회 2,3의 공간 조직을 관찰하는 데 유용 입증했습니다. 공 촛점 이미징 및 효모 식민지의 물리적 sectioning의 조합이 세포 4의 내부 조직을 밝혔다. 그러나, 공 촛점 또는 두 광자 현미경을 사용하여 직접 광학 sectioning는 효모 식민지에 깊은 몇 가지 세포 레이어에 도달 할 만 수있었습니다. 이 제한 때문에 효모 세포 4 빛의 강력한 분산의 가능성이 높습니다. 여기, 우리는 고정와 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회 내에서 형광 세포의 공간적 분포를 얻기 위해 cryosectioning에 따라 방법을 제시한다. 우리는 정착액 에이전트로 메탄올을 사용하여세포의 공간적 분포를 유지합니다. 고정 사회는 그라 이오 스탯에 10월 화합물, 냉동 및 cryosectioned으로 침투하고 있습니다. 섹션의 형광 이미징은 지역 사회의 형광 세포의 내부 조직을 드러내고있다. 빨간색과 녹색 형광 단백질을 표현 변종으로 구성된 효모 지역 사회의 예로는뿐만 아니라 효모 식민지 2,3에서 유전자 발현의 같은 형광 세포의 공간 분포를 표시하는 방법 cryosectioning 방법의 가능성을 보여줍니다. 우리의 초점을 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회에있다하더라도, 같은 방법은 잠재적으로 다른 미생물 커뮤니티를 검사하기 위해 적용 할 수 있습니다.

붉은 색과 녹색으로 태그 경쟁력 인구에게 6를 포함하는 효모 지역 사회의 수직 교차 부분의 형광 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 커뮤니티, 효모 및 공간 등의 공유 자원, 대한 경쟁의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 그들의 수직 교차 섹션에 표시 주상 패턴 7로 연결됩니다. 단일 셀 해상도 아래는 크로스 섹션에서 해결 할 수 있습니다. 그림 3은 그림 1의 프로토콜 다음과 같은 (아래)와 (위) 메탄올 - 고정하지 않고 얻은 복제 사회의 크로스 섹션을 비교합니다. 고정하지 않고 효모 커뮤니티를 cryosectioning를 들어, 프로토콜은 단계 1.8부터 시작을합니다. 형광 신호는 수정하지 않고 지역 사회의 섹션에 보존되어 있지만, 지역 사회의 무결성이 손상됩니다. 결과 : (1) 일부 셀 부분의 가장자리 주위에 거리에 떠 있으며, (2) 전체 순연령 (즉, 섹션의 일부 sectioning 절차의 유물에 의해 어리둥절)은 고정 된 사회에 비해 낮습니다. 도 4는 효모 지역 사회의 대표 밝은 분야와 형광 수직 교차 섹션을 보여줍니다. 지역 사회 양식 밝은 분야와 밝은 형광의 강력한 분산을 특징으로 다른 세포와 구별 표시 왕관의 꼭대기에서 셀. 이러한 패턴은 효모 식민지 4 차별화의보고 패턴과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1.과 (왼쪽)와 (오른쪽) 고정하지 않고 효모 커뮤니티를 cryosectioning위한 일반적인 절차의 흐름도. <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. </s효모 지역 사회의 고정과 동결에 참여 tron​​g&gt;을 단계가 설명되어 있습니다. (A) 효모 커뮤니티는 MF 멤브레인 필터의 6mm 지름 디스크의 상단에 성장하고 있습니다. (B) 워트 먼지 541 필터 종이는 캐리어로 사용되는 잘 함유 메탄올에 들어가게된다. (C) 커뮤니티는 일반적으로 ~ 15 초 동안 액체 질소에서 그들을 찍어하여 냉동 수 있습니다. (D) 냉동 커뮤니티는 캐리어 워트 먼지 필터의 상단에 메탄올을 잘 -20 ° C으로 전송됩니다. (E) 고정 후, 캐리어 워트 먼지 필터는 메탄올의 지역 사회를 꺼내 증발에 대한 차가운 요리로 전송하는 데 사용됩니다. (F) 증발 후 커뮤니티가 사각형 입방 알루미늄 호일 컨테이너로 이동하여 블록의 최종 동결에 대한 10월로 덮여 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig3.jpg" alt="그림 3"/> 담당자의 수직 단면의 그림 3. 대표 형광 이미지없이 (상단) 및 (아래) 메탄올 - 고정으로 표시됩니다 동일한 조건 하에서 성장 효모 커뮤니티를 licate. 커뮤니티 mCherry과 yEGFP 형광 단백질 7 태그 S. cerevisiae의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 있습니다. 고정하지 않으면 전지가 함께 구속되지 않고 sectioning 동안 멀리 떠 나 다시 정렬 할 수 있습니다. 메탄올 - 고정 함께 지역 사회의 세포를 유지하지만, 지역 사회 차원 (% 평균)의 차이에서 관찰로 수축이 발생합니다. <img src="/files/ftp_upload/50101/50101fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 대표 밝은 분야 (위)과 효모 지역 사회의 수직 단면의 형광 (아래) 이미지가 표시됩니다. 커뮤니티 dsRed와 YFP 형광 단백질 7 태그 S. cerevisiae의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 있습니다.

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Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.

형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K 조회수.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. 우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.

비디오: Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Demonstrated in this video are the techniques for flash freezing and sectioning embryonic brain tissue from mouse. Useful tips for using the cryostat are given, including troubleshooting methods that can be used while cutting to ensure that the resultant tissues sections are free of cracks and other distortions.

플래시 동결 E12.5 마우스 브레인 Cryosectioning

연구

생물학

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

자연과 실험실에서 미생물 커뮤니티 - 인터뷰

Biology of Microbial Communities  - Interview

미생물 커뮤니티의 생물학 - 인터뷰

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...