이 프로토콜은 중합체 나노 입자를 제조하는 방법을 보여주기 때문에 중요하며, 하나의 간단한 단계에서 핵산을 캡슐화합니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 핵산 및 세포 유형에 적용 될 수 있기 때문에 다재 다능합니다. 입자 제제를 위한 간단한 절차의 사용, 예를 들어 위아래로 파이펫팅, 그리고 lyophilization에 의한 나노입자 및 드럼 조건의 안정성을 확장할 수 있는 가능성.
절차를 시연하는 것은 로라 올모, 산호 가르시아-페르난데스, 마리아 스탬파 로페즈-핀토, 마리아 나발론 로페즈, 우리 연구소의 박사 과정 학생, 마르타 디아즈 카바예로, 우리의 실험실에 대한 포스트 문서입니다. 폴리플렉스 형성을 위해, 이전에 준비된 폴리머, C6 펩티드, 폴리 베타 아미노 에스테르 및 용액을 해동한다. 폴리머 혼합물을 위아래로 배관한 후 아세테이트 나트륨으로 12.5 밀리머 용액을 준비합니다.
용액을 소용돌이쳐 10 분 동안 기다립니다. 다음으로, 밀리리터 당 0.5 밀리그램에서 mRNA를 준비하고 파이펫팅에 의해 혼합한다. 폴리머 용액을 다시 소용돌이시키고, 마이크로 원심분리기 튜브에서 일대일 비율로 폴리머 용액의 유전 물질 용액을 혼합하고 Thermoblock에서 30분 동안 25도에서 튜브를 배양한다.
배양 후 물을 포함하는 마이크로 원심분리기 튜브에 샘플을 추가하여 1-2 RNase 자유수분으로 혼합물을 침전한 다음, 부형제를 포함시키고, mRNA 및 폴리 베타 아미노 에스테르의 혼합물과 동일한 부피로 20 밀리머 힙과 4% 자당 용액을 첨가하고 파이프를 혼합하여 혼합한다. 1시간 동안 폴리플렉스 용액을 영하 80도에서 동결한 후, 1차 건조를 수행한 다음, 다시 수분을 피하기 위해 즉시 폴리플렉스를 영하 20도에 보관합니다. 폴리플렉스 리서스펜션의 경우, 영하 20도의 냉동고에서 리오필화된 나노 입자를 제거하고 고체를 재분산시키기 위해 상응하는 양의 깊은 수소화수를 빠르게 첨가하여 원하는 농도를 달성하였다.
파이펫은 총 재서스펜션이 용해되고 일단 용해될 때까지 부드럽게 피펫을 위아래로 피피하여 거품을 피합니다. 형광 현미경에 의한 질적 평가를 위한 24시간의 전환 후, 전감염된 헬라 세포를 함유한 96개의 웰 플레이트를 현미경에 배치하고 10배 의 목표를 사용하여 시각화를 시작합니다. 먼저 화이트 밸런스를 적용하여 소프트웨어에 대한 배경 참조를 만든 다음 분석 중에 형광 이미지로 오버레이하는 이미지를 얻습니다.
현미경 모드를 반사 모드로 변경하고 필터 휠을 파란색 레이저로 이동하여 EGFP를 시각화합니다. 그런 다음 동일한 노출 시간을 사용하는 모든 조건 이나 우물에 대 한 이미지를 수집 합니다. 유동 세포측정에 의한 정량적 평가를 위해, 웰당 100마이크로리터를 사용하여 96웰 플레이트에 감염된 헬라 세포를 세척한다.
PBS를 잘 당 25 마이크로리터의 트립신을 흡입한 후 5분간 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포가 분리되면 이전에 회수된 미디어를 추가하여 트립신을 비활성화한 다음, 31.25 마이크로리터를 우물당 10%의 포르말린을 추가하고 20분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 다음으로 흐름 사이토미터와 소프트웨어를 켜고 플레이트 샘플 볼륨 의 유형 및 샘플 간 흔들림 및 헹구기와 같은 기타 매개 변수를 포함하여 실험에 적합한 조건을 설정합니다.
분산된 광에 대한 유동 데이터를 먼저 보고, 세포와 파편을 구별하기 위해 양형세포의 백분율을 정량화하기 위한 적절한 파라미터를 설정한다. 그런 다음 진폭과 높이를 게이트와 비교하여 개별 세포를 차별하는 다른 산란플롯을 플로팅합니다. 1일 전, 10, 000 턱스 II 세포는 하룻밤 잠복식을 위한 96웰 플레이트에서 잘 한다.
다음 날 세포는 우물당 0.6 마이크로그램의 mRNA를 사용하여 37°C와 이산화탄소 5%의 건조한 공기 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 날, PBS의 25 마이크로 리터와 우물에 남아있는 세포를 씻어. 트립신의 25 마이크로 리터에서 PBS를 흡입하고 세포를 분리하기 위해 섭씨 37도에서 5 분 동안 접시를 배양한 후.
이전에 회수된 미디어를 특파원에게 잘 추가하여 트립신 반응을 중지하십시오. 그런 다음 플레이트를 원심분리하고, 미디어를 흡인시키고, PBS50 마이크로리터와 우물당 2.5%의 포르말린을 추가하여 세포를 고치고, 플레이트를 원심분리하는 4도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 PBS 50 마이크로리터와 우물 당 3%BSA를 추가하고 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이터를 넣습니다.
배양 원심분리 후 플레이트를 다시 한 번 넣은 다음, PBS에 마우스 ovalbumin 항체 50 마이크로리터와 섭씨 4도에서 30분 동안 30분 동안 인큐베이터를 추가합니다. 원심분리 단계를 반복한 다음 PBS 의 50 마이크로리터로 세포를 씻으세요. PBS를 흡입한 후, 이차 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양한다.
인큐베이션 후 원심분리 및 세척 단계를 반복하십시오. 그런 다음 혈류 세포 분석용 세포 및 100마이크로리터와 2.5%의 포식틴을 다시 중단한다. 나노 입자를 캡슐화 하는 신선 하 고 lyophilized GFP mRNA 캡슐화의 생리학적 특성 크기 및 poly 분산 지수에 유의 한 차이 표시.
폴리플렉스의 투과 전자 현미경 검사는 직경 약 50 나노미터의 구형 및 모노 분산 나노 입자의 형성을 확인합니다. 레고 펩티드 및 수정된 폴리 베타 아미노 에스테르 폴리플렉스의 캡슐화 효율 데이터는 GFP또는 ovalbumininmRNA의 종류에 따라 유의한 차이를 나타내지 않습니다. EGFP 발현의 질적 분석, 턱II 세포주에서 24시간 후 거래가 여기에 도시된다.
양적으로 부정적인 제어에 비해. 백분율 GFP 양성 세포는 고전적인 형질 시약으로 수행 된 긍정적 인 제어에 상당히 높고 비교됩니다. 상기 ovalbumin mRNA는 올리고펩티드 및 변형된 폴리 베타 아미노 에스테르 나노입자가 비감염된 세포에 비해 감염된 세포에서 CD11b 및 CD86 멤브레인 마커의 현저히 높은 발현에 의해 보인 바와 같이 수지상 세포를 활성화할 수 있다.
활성 원리로 mRNA의 사용에 기초한 우리의 예방 접종 플랫폼은, 우리의 독점적인 폴리머는 암 치료뿐만 아니라 예방에 사용될 수 있습니다. 우리는 우리의 기술을 사용하여 암 면역 요법에 그 기여를 강조 할 수 있습니다. 우리는 우리의 나노 입자에 종양 관련 항원을 캡슐화하고 암 처리에 있는 변화를 만들 수 있기 때문에.
