פרוטוקול זה הוא משמעותי כי הוא מדגים, כיצד להכין חלקיקים פולימריים, חומצות גרעין אנקפסולציה בצעד אחד פשוט. היתרונות העיקריים של טכניקה זו, הם צדדיות, כפי שהוא יכול להיות מיושם על חומצות גרעין וסוגי תאים שונים. השימוש בהליכים פשוטים להכנת חלקיקים, כגון צנרת למעלה ולמטה, ואת האפשרות להרחיב את היציבות של חלקיקים ותנאי תוף על ידי ליופיליזציה.
מי שידגימו את ההליך יהיו לורה אולמו, קורל גרסיה-פרננדז, מריה סטמפה לופז-פינטו ומריה נבאלון-לופז, דוקטורנטית במעבדה שלנו ומרתה דיאז-קבלרו, פוסט-דוקטורט במעבדה שלנו. להיווצרות פוליפלקסים, הפשירו את הפולימרים שהוכנו בעבר, פפטיד C6, אסטרים פולי בטא אמינו, ומערבולת הפתרון. לאחר צנרת תערובת הפולימר למעלה ולמטה, להכין פתרון 12.5 מילימולר נתרן אצטט.
מערבולת הפתרון ולחכות 10 דקות. לאחר מכן, להכין mRNA ב 0.5 מיליגרם למיליליטר מעורבב על ידי pipetting. מערבולת את הפתרון הפולימרי שוב, ואז לערבב את הפתרון החומרי הגנטי בתמיסת הפולימר ביחס של אחד לאחד בצינור צנטריפוגה מיקרו ודגורת הצינור ב 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתרמובלוק.
לאחר הדגירה לזרז את התערובת עם אחד עד שני מים חינם RNase על ידי הוספת המדגם צינור צנטריפוגה מיקרו המכיל את המים, ולאחר מכן לכלול את excipients, להוסיף ערימות 20 מילימולר 4% תמיסת סוכרוז באותו נפח כמו תערובת של אסטרים אמינו mRNA ופולי בטא, מעורבב על ידי pipetting. עבור Lyophilization לאחר הקפאת פתרון polyplex במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, לבצע את הייבוש העיקרי, ולאחר מכן מיד לאחסן את polyplexes במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי למנוע התייבשות. עבור resuspension polyplex, להסיר את ננו-חלקיקים ליופילי ממקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס ולהוסיף במהירות את הכמות המתאימה של מים מוקשים עמוקים כדי לפזר מחדש את המוצק והשיג את הריכוז הרצוי.
פיפטה בעדינות עד לחידוש מוחלט ופעם מומסת, פיפטה למעלה ולמטה במרץ הימנעות בועות. לאחר 24 שעות של טרנספקטציה להערכה איכותית על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הנח את צלחת 96 הבאר המכילה את תאי הלה שהודבקו על המיקרוסקופ והתחל לדמיין באמצעות המטרה 10 פעמים. ראשית, להחיל איזון לבן כדי ליצור הפניית רקע עבור התוכנה, ולאחר מכן לרכוש תמונה כדי לכסות אותו עם תמונת פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.
שנה את מצב המיקרוסקופ למצב השתקפות והזז את גלגל המסנן ללייזר הכחול כדי לדמיין EGFP. לאחר מכן לרכוש תמונות עבור כל התנאים או בארות המעסיקים את אותו זמן חשיפה. להערכה כמותית על ידי ציטומטריית זרימה, לשטוף את תאי Hela transfected בצלחת 96 היטב באמצעות 100 microliters של PBS לבאר.
לאחר שאיפה PBS ב 25 microliters של טריפסין לבאר ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר שהתאים מנותקים, הוסף את המדיה ששוחזרה בעבר כדי לנטרל את טריפסין, ולאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 31.25 microliters של 10% פורמלין לבאר ודגרה במשך 20 דקות. הבא להפעיל את cytometer הזרימה ואת התוכנה, ולאחר מכן להגדיר את התנאים המתאימים עבור הניסוי, כולל סוג של נפח דגימת צלחת ופרמטרים אחרים כגון רועד ושטיפה בין דגימות.
הגדר את הפרמטרים המתאימים כדי לכמת את אחוז התאים שהועברו באופן חיובי על-ידי הצגת נתוני הזרימה באור מפוזר קדימה לעומת אור מפוזר בצד כדי להבחין בין התאים לבין הפסולת. ואז מתווים עוד פיזור, משווים את המשרעת לעומת הגובה לשער ומפלים תאים בודדים. יום אחד לפני ההדבקה, צלחת 10, 000 תאי JAWS II לבאר בצלחת 96 באר לדגירה בין לילה.
למחרת להדביק את התאים עם 0.6 מיקרוגרם mRNA לבאר ולדגירה את הצלחת במשך 24 שעות בחממה אוויר יבש ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, לשטוף את התאים שנותרו בבאר עם 25 microliters של PBS. לאחר שאיפה PBS ב 25 microliters של טריפסין ודגורת הצלחת במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס לנתק את התאים.
הפסק את תגובת טריפסין על-ידי הוספת המדיה שנמצאה בעבר לבאר הכתב. לאחר מכן צנטריפוגה הצלחת, לשאוף את התקשורת, ולתקן את התאים על ידי הוספת 50 microliters של PBS ו 2.5% פורמלין לבאר ואחריו דגירה הלוח בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, צנטריפוגה הצלחת. לאחר מכן להוסיף 50 microliters של PBS ו 3%BSA לבאר אינקובטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר דגירה צנטריפוגה הצלחת שוב, ולאחר מכן להוסיף 50 microliters של נוגדן אליבבומין העכבר PBS ו 3%BSA אינקובטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שלב צנטריפוגה, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 50 microliters של PBS. לאחר שאיפה PBS, להוסיף את הנוגדנים המשניים ודגרה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, חזור על צנטריפוגה וצעדי כביסה. לאחר מכן respend התאים ו 100 microliters של PBS ו 2.5% פורמלין לניתוח ציטומטריית זרימה. אפיון פיזיוכימי של חלקיקי GFP mRNA טריים וליופיליים אינו מראה הבדלים משמעותיים בגודל ובמדד פיזור פולי.
מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור של polyplexes מאשר היווצרות של חלקיקים כדוריים ומונו מפוזרים בקוטר של כ -50 ננומטר. נתוני יעילות אנקפסולציה של פפטיד לגו ופוליפלקסים פולי בטא אמינו שונה תמצית GFP, או אליבאמין להראות הבדלים משמעותיים בהתאם לסוג של mRNA. ניתוח איכותי של ביטוי EGFP, 24 שעות לאחר העסקה בקו התא JAWS II מוצג כאן.
כמותית בהשוואה לפקד השלילי. אחוז התאים החיוביים של GFP גבוה משמעותית ודומה לשליטה חיובית המבוצעת עם ריאגנט טרנס-זיהום קלאסי. אליקופפטיד טעון ovalbumin mRNA ו poly beta אמינו אסטר חלקיקים שונה יכול להפעיל תאים דנדריטי כפי שניתן לראות על ידי הביטוי גבוה משמעותית של CD11b וסמני ממברנה CD86 בתאים שעברו טרנספקט בהשוואה לתאים שאינם שעברו טרנס-זיהום.
פלטפורמת החיסונים שלנו המבוססת על השימוש ב- mRNA כעיקרון הפעיל, כמו גם ניתן להתאים את הפולימרים הקנייניים שלנו לשימוש במניעה כמו גם לטיפול בסרטן. אנו יכולים להשתמש בטכנולוגיה שלנו כדי להדגיש את התרומה הזו באימונותרפיה של סרטן. מאז אנחנו יכולים לתמצת אנטיגנים הקשורים לגידול בננו-חלקיקים שלנו ולעשות שינוי בטיפולים בסרטן.
