هذا البروتوكول مهم لأنه يوضح، كيفية إعداد الجسيمات النانوية البوليمرية، والأحماض النووية المغلفة في خطوة واحدة بسيطة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية، هي براعة، كما يمكن تطبيقها على الأحماض النووية المختلفة وأنواع الخلايا. استخدام إجراءات بسيطة لإعداد الجسيمات، مثل الأنابيب صعودا وهبوطا، وإمكانية توسيع استقرار الجسيمات النانوية وظروف الطبل عن طريق الليسوفيليا.
وسيكون من بين البينات العملية لورا أولمو، وكورال غارسيا فرنانديز، وماريا ستامبا لوبيز بينتو، وماريا نافالون لوبيز، طالبة الدكتوراه في مختبرنا، ومارتا دياز كاباليرو، وهي وثيقة بريد لمختبرنا. لتشكيل polyplexes، إذابة البوليمرات المعدة سابقا، C6 الببتيد، استرات بولي بيتا الأمينية، ودوامة الحل. بعد pipetting مزيج البوليمر صعودا وهبوطا، وإعداد محلول 12.5 ملليمولار في خلات الصوديوم.
دوامة الحل والانتظار لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، إعداد مرنا في 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر ومختلطة عن طريق pipetting. دوامة حل البوليمر مرة أخرى، ثم خلط محلول المواد الوراثية في محلول البوليمر في نسبة واحد إلى واحد في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة واحتضان الأنبوب في 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في Thermoblock.
بعد الحضانة يعجل الخليط مع واحد إلى اثنين من المياه الحرة RNase بإضافة العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على الماء، ثم لتشمل الإكسيبات، إضافة أكوام 20 ملليمولار و 4٪ محلول السكروز في نفس حجم خليط من الحمض النووي الريبي وبولي بيتا استرات الأمينية، ومختلطة عن طريق الأنابيب. للlyophilization بعد تجميد محلول polyplex في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، وإجراء التجفيف الأولي، ثم تخزين على الفور polyplexes في ناقص 20 درجة مئوية لتجنب الإماهة. لإعادة الإنفاق polyplex، وإزالة جزيئات نانو lyophilized من الفريزر ناقص 20 درجة مئوية وإضافة بسرعة الكمية المقابلة من المياه المهدرجة العميقة لإعادة تفريق الصلبة وحققت التركيز المطلوب.
ماصة بلطف حتى إعادة الإنفاق الكلي ومرة واحدة إذابة، ماصة صعودا وهبوطا تجنب بقوة فقاعات. بعد 24 ساعة من العدوى لإجراء تقييم نوعي عن طريق المجهر الفلوري ، ضع لوحة البئر ال 96 التي تحتوي على خلايا هيلا المصابة على المجهر وابدأ في تصور باستخدام هدف 10 مرات. أولا، تطبيق توازن اللون الأبيض لإنشاء مرجع خلفية للبرنامج، ثم الحصول على صورة لتراكب مع صورة مضان أثناء التحليل.
تغيير وضع المجهر إلى وضع انعكاس ونقل عجلة التصفية إلى الليزر الأزرق لتصور EGFP. ثم الحصول على صور لجميع الشروط أو الآبار التي تستخدم نفس الوقت التعرض. للتقييم الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي، اغسل خلايا هيلا المصابة في صفيحة بئر 96 باستخدام 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
بعد أسبيراتينغ برنامج تلفزيوني في 25 ميكرولتر من التريبسين لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بمجرد فصل الخلايا، أضف الوسائط التي تم استردادها سابقا لتثبيط التريبسين، ثم قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 31.25 ميكرولتر من 10٪ من الفورمالين لكل بئر واحتضانها لمدة 20 دقيقة. بدوره المقبل على تدفق الخلايا والبرمجيات، ثم إعداد الظروف المناسبة للتجربة، بما في ذلك نوع من حجم عينة لوحة والمعلمات الأخرى مثل اهتزاز والشطف بين العينات.
إعداد المعلمات المناسبة لتحديد نسبة الخلايا المصابة بشكل إيجابي من خلال عرض بيانات التدفق أولا على الضوء المتناثر الأمامي مقابل الضوء المتناثر الجانبي لتمييز الخلايا عن الحطام. ومن ثم رسم مؤامرة مبعثر أخرى، ومقارنة السعة مقابل الارتفاع إلى البوابة والتمييز بين الخلايا الفردية. قبل يوم واحد من العدوى، لوحة 10،000 JAWS الثاني الخلايا لكل بئر في لوحة بئر 96 لاحتضان بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي تجتاز الخلايا مع 0.6 ميكروغرام مرنا لكل بئر واحتضان لوحة لمدة 24 ساعة في حاضنة الهواء الجاف في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، اغسل الخلايا المتبقية في البئر مع 25 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد أسبيراتينغ برنامج تلفزيوني في 25 ميكرولتر من التريبسين واحتضان لوحة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
وقف رد فعل تريبسين عن طريق إضافة وسائل الإعلام التي تم استردادها سابقا على المراسل بشكل جيد. ثم الطرد المركزي لوحة، يستنشق وسائل الإعلام، وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 2.5٪ الفورمالين لكل بئر تليها احتضان لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، والطرد المركزي لوحة. ثم أضف 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 3٪ BSA لكل بئر وحاضنة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.
بعد حضانة الطرد المركزي لوحة مرة أخرى، ثم إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة ovalbumin الماوس في برنامج تلفزيوني و 3٪ BSA وحاضنة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. كرر خطوة الطرد المركزي، ثم غسل الخلايا مع 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد التجسس على برنامج تلفزيوني، إضافة الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة، كرر خطوات الطرد المركزي والغسيل. ثم إعادة إنفاق الخلايا و 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 2.5٪ شكلي لتحليل تدفق قياس الخلايا. الوصف الفيزيائي الكيميائي للجسيمات النانوية GFP الطازجة والليوفيليا التي تغلف الجسيمات النانوية لا تظهر اختلافات كبيرة في الحجم ومؤشر تشتت البولي.
يؤكد المجهر الإلكتروني الإرسال من polyplexes تشكيل الجسيمات النانوية الكروية وأحادية مشتتة من حوالي 50 نانومتر في القطر. بيانات كفاءة التغليف من الببتيد ليغو وتعديل بولي بيتا الأمينية استر polyplexes تغليف GFP، أو ovalbumin تظهر أي اختلافات كبيرة اعتمادا على نوع من الحمض النووي الريبي. تحليل نوعي للتعبير EGFP ، 24 ساعة بعد المعاملة في خط الخلية JAWS II يظهر هنا.
كميا مقارنة بالسيطرة السلبية. النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP أعلى بكثير وقابلة للمقارنة مع عنصر تحكم إيجابي يتم إجراؤه باستخدام كاشف نقل كلاسيكي. وdolybumin مرنا تحميل oligopeptide وتعديل بولي بيتا الأمينية استير الجسيمات النانوية يمكن تنشيط الخلايا التغصنية كما يتضح من التعبير أعلى بكثير من CD11b وCD86 علامات الغشاء في الخلايا المصابة مقارنة مع الخلايا غير المصابة.
منصة التطعيم لدينا على أساس استخدام الحمض النووي الريبي كمبدأ نشط، فضلا عن البوليمرات الملكية لدينا يمكن تكييفها لاستخدامها في الوقاية وكذلك لعلاج السرطان. يمكننا استخدام التكنولوجيا لدينا لتسليط الضوء على أن المساهمة في العلاج المناعي للسرطان. منذ أن يمكننا تغليف المستضدات المرتبطة بالورم في جسيماتنا النانوية وإجراء تحول في علاجات السرطان.
