일반적으로 PURE 시스템으로 알려진 재조합 세포 없는 단백질 발현 시스템을 위한 이 프로토콜은 세포 배양 및 세포 정화를 활용하여 필요한 단백질 정제를 간소화합니다. 이를 통해 시간과 노동 요구 사항을 크게 최소화할 수 있습니다. OnePot 방법은 비용 효율적일 뿐만 아니라 시간 효율적일 뿐만 아니라 시간 효율적입니다.
준비 시간을 몇 주에서 3영업일로 줄입니다. 이것은 전 세계적으로 더 많은 실험실에 접근 하고 합성 세포 없는 생물학을 위한 이 정말 강력한 플랫폼을 구현하는 것을 돕습니다 PURE 세포 없는 플랫폼을 만듭니다. 시작하기 전에, 위에 있는 모든 긴장이 그들의 각각의 단백질을 잘 표현하도록 하십시오.
먼저, 세파로즈 수지의 2밀리리터를 사용하여 텍스트 원고에 설명된 대로 OnePot 단백질 정제에 대한 컬럼을 준비하고 니켈 황산염으로 컬럼을 충전한다. LB 미디어의 20 밀리리터와 20개의 암피실린 마이크로리터를 결합하여 스타터 배양을 준비하십시오. 300 마이크로리터의 마이크로리터를 멸균 96개의 딥 웰 플레이트의 35개 웰에 넣습니다.
신장 인자 열 불안정, 또는 EFTU를 제외하고 각각의 변형률을 접종하고 통기성 멤브레인으로 플레이트를 밀봉합니다. EFTU 배양을 위해 스냅 캡이 있는 14 밀리리터 배양 튜브에 LB 배지를 함유한 암피실린 3밀리리터를 접종합니다. EFTU 배양의 약 3밀리리터는 OnePot 식 문화 1개에 충분합니다.
하룻밤 사이에 분당 260 회전에서 흔들면서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 다음 날, LB 미디어의 500 밀리리터와 500 개의 암피실린 마이크로 리터를 멸균 당황 플라스크로 옮기습니다. EFTU 배양의 1, 675 마이크로리터와 깊은 우물 판에서 각 배양의 55 마이크로리터로 OnePot PURE 배양을 접종하십시오.
분당 260회전으로 37도에서 2시간 동안 배양하거나 배양의 광학 밀도가 0.2~0.3에 도달할 때까지 배양한다. 0.1 밀리머 IPTG의 500 마이크로리터로 배양을 유도하고 추가 3 시간 동안 성장한다. 세포를 섭씨 4도, 3, 220회 G에서 10분간 수확하고, 세포 펠릿을 영하 80도에서 추가 사용까지 보관한다.
셋째 날에는 정제에 필요한 버퍼양을 측정하고 텍스트에 표시된 대로 모든 버퍼에 TCEP를 추가합니다. 향후 정화를 위해 TCEP 없이 나머지 버퍼를 섭씨 4도에 저장합니다. 완충 A의 30 밀리리터로 충전된 열을 평형화합니다.버퍼 A의 25 밀리리터가 통과한 후 아래쪽에서 열을 닫습니다.
세포를 해동하고 130와트 프로브를 사용하여 세포에 완충A.Lyse의 7.5 밀리리터에서 세포 펠릿을 재보페하기 위해 서학적 파이펫을 사용합니다. 초음파 처리가 성공하면 솔루션이 어두워집니다. 세포를 얼음 위에 유지하고 튜브를 건드리지 않고 프로브를 충분히 깊게 배치하십시오.
세포 잔해를 21, 섭씨 4도에서 20분 동안 130회 G로 제거하고 얼음에 용해를 유지합니다. 상체를 평형 열에 추가합니다. 상단에서 열을 닫고 누출이 없는지 확인합니다.
튜브 회전기사용으로 회전 시 섭씨 4도에서 3시간 동안 컬럼을 배양합니다. 기둥에서 풀이 없는 성분을 25밀리리터의 버퍼 A.Wash로 세척하여 25밀리머 이미다졸 버퍼25밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 450 밀리머 이미다졸 완충제의 5 밀리리터로 단백질을 엘테우고 항상 얼음에 용출 된 단백질을 유지합니다.
HT 버퍼 25밀리리터로 용액을 희석시키고 혼합물을 얼음 위에 보관합니다. 15 밀리리터 원심 필터에 15 밀리리터를 추가하고 1.5 밀리리터의 부피에 농축합니다. 농축 된 용액을 사용하여 나머지 15 밀리리터를 필터에 추가하고 다시 한 번 1.5 밀리리터에 농축하십시오.
집중된 샘플에 HT 버퍼 10 밀리리터를 추가하고 1 밀리리터에 농축합니다. 농축 된 샘플을 복구하고 동일한 양의 스톡 버퍼 B를 추가하고 추가 사용까지 영하 80도에서 저장하십시오. 버퍼 교환 중에 텍스트에 지정된 대로 열을 복원합니다.
4일째에, 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 3킬로달톤 컷오프 원심 필터의 0.5 밀리리터를 밀리리터당 20밀리그램으로 농축합니다. SDS 페이지를 사용하여 OnePot PURE 단백질 조성물을 확인합니다.
2개의 X Laemmli 완충제의 10 마이크로리터와 혼합된 물의 7.5 마이크로리터로 샘플의 2.5 마이크로리터를 희석한 다음 젤에 5개의 마이크로리터와 2.5 마이크로리터를 적재합니다. 텍스트에 지정된 대로 SDS 페이지를 실행합니다. 반응에 대한 DNA의 2~10나노몰러를 사용하여 스프레드시트내의 해당 황세포에서 DNA의 농도 와 길이를 채웁니다.
마이크로리터에서 원하는 총 반응 량을 채웁니다. 냉동고에서 필요한 시약을 제거하고 얼음에 해동하십시오. 이어서, 계산된 양의 물, DNA 및 에너지 용액을 PCR 튜브의 한쪽 또는 384 웰 플레이트상에 우물의 한 쪽 구석에 파이펫을 한다.
피펫은 PCR 튜브의 반대편에 단백질과 리보솜 용액의 계산된 양을 피펫 384 웰 플레이트의 반대 쪽 모서리. 약 30초 동안 회전하여 반응 구성 요소를 병합합니다. 플레이트 판독기 실험 중 증발을 방지하려면 35마이크로리터의 액체 왁스를 추가하고 투명 실란트로 플레이트를 밀봉합니다.
섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 배양하세요. 플레이트 판독기의 판독을 위해 2분마다 필요한 파장에서 플로레시엔스 강도를 측정합니다. OnePot 단백질 제제에 대해 이후에 사용되는 모든 개별 균주에서 발현에 성공하여 여기에 나타난다.
최종 OnePot PURE 단백질 용액의 전체 조성물은 SDS 페이지에 의해 분석되었다. EFTU가 예상대로 다른 단백질에 비해 더 높은 농도로 존재하는 것이 두드러지 다. OnePot 단백질 용액의 합성 수율은 시간이 지남에 따라 eGFP 형광을 모니터링하여 그의 태그또는 태그가 없는 리보솜과 결합된 것으로 분석되었다.
체외 라벨링 시스템 또는 쿠마티 염색시스템에서 녹색 목록 tRNA를 사용하여 표지된 3가지 다른 단백질의 발현 수준을 SDS 페이지 젤상에서 분석되었다. 기능적인 PURE 시스템의 경우 모든 균주가 각자의 단백질을 잘 표현하는 것이 절대적으로 중요합니다. 이 기술은 새로운 유전 네트워크, 분자 진단, 치료 및 교육 키트의 개발을 가능하게, 생물학적 시스템 엔지니어링에 PURE 시스템의 구현을 용이하게한다.
