이 자료는 해군 연구 사무실 보너스 번호 N00014-13-1-0074 (V.N.)를 지 원하는 작업을 기반으로, 인간 프론티어 과학 프로그램 부여 번호 RGP0037/2015 (V.N.), 그리고 한국군 과학 재단 부여 2014400 (V.N.).

<ol>
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S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies:+tubes,+rings,+and+doughnuts.">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins.">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li><li>Sun, Z. 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저자 선언 다음 경쟁 금융 interest(s): Noireaux 실험실 MYcroarray, MYtxtl 셀 무료 단백질 식 키트의 대리점에서에서 연구 자금을 받습니다.

첸, 그 외 에 기술에 따라 SPMC에 대 한 14 , superinfection 적절 한 조건을 결정할 때 중요 한 단계에 도달입니다. 가장 가깝게 superinfection 견딜 호스트 스트레인의 능력을 제어 하는 매개 변수 자주 감염 살 균 소의 초기 농도 이다. 호스트 세포는 살 균 소의 아주 작은 금액을 초기 감염 전에 대 수 성장 단계에 있어야 합니다. 결국, 페이지 또한 로그 성장을 도달 하 고 목표 살 균 소 숫자 빠르게 셀 카운트, 각 호스트 셀에 페이지의 여러 복사본에 대 한 허용을 능가 하는. 이렇게 하면 어디 그것은 세포의 용 해를 받게 될 것 이다 준 안정 상태로 셀. 이 상태에 도달 하지 경우 셀 연계, confluent 세포를 받아야 하 고 그들의 바이러스 부하를 풀어 것입니다. Superinfection 위의 초기 바이러스 농도 사용 하 여 연결할 수 없습니다, 후속 시도 하기 전에 10의 요인에 의해 감염의 초기 다양성을 낮은. 수확을 하기 전에 호스트 셀 lyse 할 superinfection에 도달 하지 경우에, 즉시 별도 정화 절차 진행. DNase를 추가 나 5 µ g/mL를 500 µ L CHCl3 모든 세포 세포의 용 해를 마무리 하. 계속 해 서 추가 5 분 소용돌이 다음 세포 파편을 제거 하려면 10000 x g에서 원심. 가만히 따르다와 작은 페이지를 하룻밤 4 ° C에서 1 mL 전체 1 x TM 버퍼에 동요 하지 않고 resuspend 1-2 h에 대 한 75000 x g에서 상쾌한 원심. Superinfection 셀의 작은 볼륨을 사용 하 여에 대 한 테스트, 얼마나 가까운 세포에 의해 얼마나 빨리 그들은 때를 lyse 세포에 노출 되는 추가 된 클로 프롬을 측정 가능 하다. 세포를 lyse 해결책 거의 즉시 명확히 하는 경우에, 세포 벽은 매우 불안정 하 고 셀 대규모 캐스케이드 세포의 용 해를 방지 하기 위해 즉시 수확 해야 한다. 테스트 1-3 분 이내 lyses, 큰 볼륨 사용에 대장균 의 로컬 변형에 따라 최대 2 h에 대 한 superinfect을 계속 수 있습니다. 셀 5 분 이내 lyse 하지 않습니다, 경우 살 균 소 성장 하지 잡 았 있다 E. 콜라이 성장 하 고 기본 보육 계속 해야 합니다. 30-60 분에 테스트를 다시 수행 합니다.
준비 된 자당 기온 변화도에 살 균 소 정화, 페이지 1/3와 튜브 아래 방법의 2/3 사이 매우 두꺼운, 진주빛 밴드로 표시 됩니다. 비교적 성공적인 세포 및 세포 잔해 정화 단계 가정, 거기 그러나 비슷한 밀도 또는 크기의 아무도 다른, 밴드 있을 수 있습니다. 큰, 불투명 밴드 페이지를 포함 하 고 멸 균 주사기와 무딘 정 솔루션에서 제거 하는 것입니다.
프로토콜, 셀 무료 반응 및 살 균 소 titer의 세 번째 섹션을 시작 하는 때 (3.5 단계)에서 호스트 박테리아 플레이트 및 배양 배지 (3.21 단계)에서 titer 분석에 사용 신선한 배양 배지 (미만 1 주 이전)를 사용 하 여 최상 이다. 이 호스트 박테리아 세포 및 살 균 소 titer에 대 한 더 높은 감염 효율의 강한 성장을 촉진 합니다. 살 균 소 배양 배지 살 균 소 titer 부분의 프로토콜을 시작 하기 전에 1 h의 최소 37 ° C에서 미리 incubated 해야 합니다. 살 균 소 문화 접시의 사전 인큐베이션 없이 가기-agar 솔루션 (합성된 살 균 소 및 호스트 세포 배양 포함) 균질 문화 접시의 표면에 걸쳐 배포 하지 것 이다. 대신, 상단 한 솔루션 것입니다 (그림 2b) 표면에 공고히 균질. 이 셀 무료 반응에서 살 균 소의 과소 평가 일으킬 수 있는 여러 페이지에 같은 자리, 지역화의 확률을 증가 시킵니다.
각 패 1 합성된 살 균 소 주인 세포 내에서 복제 하 고 호스트 세포를 lysing 주인 세포를 감염의 이벤트를 나타냅니다. 플 라크는 자손 살 균 소 감염 이웃 호스트 세포에서 초기 감염 이벤트에서 잠복기 동안 크기에서 성장 한다. 아무 플 라크, 관찰 하는 경우 프로토콜 섹션 4.6에서 희석 요인이 너무 높은 어떤 합성된 살 균 소 주인 세포를 감염 하는 낮은 확률의 결과 가능 하다. 이 문제를 해결 하려면 3-4 배나 (또는 필요에 따라) 희석 비율을 감소 하 고 titer 실험을 반복 합니다. 반대로, 희석 비율 너무 높은 패 문화 접시의 전체 표면에 걸쳐, 살 균 소 수율 계산 불가능에 결과 수 있습니다. 이 경우에, 3-4 배나 (또는 필요에 따라) 희석 비율을 증가. 특징이 잘 페이지에 대 한 셀 무료 반응의 수확량은 알려질 것 이다 하 고 반응 포인트 당 하나만 희석 요소 titer 실험에 필요한 됩니다. 새로운 살 균 소 특성화 때 반응 포인트, 하나는 희석 수 패를 얻을 것입니다 보장 당 2-3 다른 희석 요소를 포함 하도록 최상 이다 (참조 그림 3 패의 수 및 셀 번호 간의 차이 대 한 플레이트)입니다.
아니 패 살 균 소 titer의 희석 비율을 수정한 후 관찰 되는 경우이 셀 무료 반응 되지 않았음을 성공적인 유전자 발현 발생 하지 않은 나타낼 수 있습니다. 이 대 한 가능한 설명 시 약/살 균 소 DNA 때문에 vortexing에 의해 셀 무료 반응의 균질의 구조적 손상 될 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 반응을 반복 하 고 부드럽게 반응 관 5 ~ 7 배를 손가락으로 두 드려서 또는 천천히 5 ~ 7 배는 피 펫과 함께 반응 혼합 하 여 균질.
셀 무료 반응 시스템 대장균 에서 유래 하 고 endogenously 모두 대장균 RNA 중 합 효소 및 포함 기본 시그마 요인, 시그마 70, 주요 발기인 합의 인식 하는 데 필요한 holoenzyme를 결합 하는 대장균 유전자의 시퀀스입니다. 또한, 셀 무료 반응 시스템 것 시그마 70의 발기인 합의 순서에서 다른 6 개의 대장균 시그마 요인 유전자를 제공 하 여 전체 시그마 요인 녹음 방송 체계를 정리 수 있습니다. 이 모든 살 균 소의 유전자는 대장균의 전사/번역 기계와 호환을 합성 하는 기능을 수 있습니다. 이 공부 하거나 셀 무료 반응 시스템 활용 여기와 합성 수 없는 살 균 소의 하위 집합에 밖으로 나뭇잎.
셀 무료 전사/번역 플랫폼 제어의 인상적인 수준과 vivo에서 학문의 방법에 비해 반응 조건의 유연성에 대 한 수 있습니다. 우리 살 균 소 반응의 많은 생화학 및 유전 구성 요소를 정밀 하 게 조정 하 고 분자 크롤 링에 대 한 그림 4 와 같이 24 시간 미만에 효과 직접 관찰할 수 있습니다. 말뚝에 같은 분자 되어 효과 자기 조립 고분자 복합물의 되어 이론적으로 설명 하 고 검증 된 시험관에18,,1920. 분자 크롤 링 하는 것은 큰 바이오 구조 협회 상수를 증가 시키는 메커니즘을 구동 하는 엔트로피 이다. 셀-무료 접근 연구원을 살 균 소, vivo에서 작품의 본질적인 제한 없이 같은 모델 시스템으로 자기 조립의 물리학 같은 복잡 한 생물 학적 과정을 수 있습니다.
이 플랫폼은 또한 적용된 분야에 페이지의 유틸리티의 조사에 대 한 수 있습니다. 살 균 소 게놈의 구성 요소 다른 용도로 고 소설 nanostructures 결과 통합의 목표와 셀 무료 반응 시스템에 신속 하 게 테스트 될 수 있습니다. 살 균 소는 호스트 세포 감염, 항생제 내성 박테리아에 대 한 대 안으로 살 균 소 치료의 유틸리티를 홍보 것의 선택도 증가 시키기 위해 수정할 수 있습니다.

지난 10 년간, 셀 무료 식 기술 긴급 종합 연구 분야 관련 합성 및 양적 생물학에서 주소 새로운 응용 프로그램을 설계 되었습니다. 원래 독립적인 생명체의 단백질을 표현 하는 데 사용, 새로운 셀 무료 TXTL 시스템 모두 기초 및 응용 과학1,2, 상당히이 기술의 범위 확대에 대 한 개발 되었습니다. TXTL 플랫폼의 새로운 세대는 사용자 친화적인, 수 있도록 설계 되었습니다 더 효율적 (도달 배치 모드3에서 단백질 합성의 2 mg/mL), 더 전사4의 수준에서 다양 하 고 게로 이렇게 모듈형 쉽게 통합 자연 소설 또는 기존 생물 학적 시스템5,6의 기능을 확장 하는 합성 함수. 특히, TXTL 시스템 셀 무료 되 규제 요소 등 작은 유전자 회로7,,89, 유전 프로그램의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리한 디자인-빌드-테스트를 줄여 몇 일을 주기. 놀랍게도, 새로운 TXTL 시스템은 또한 큰 DNA coliphages10,11, 강한 활성 게놈의 재구성을 지원 하기 위해 충분 한 성과 보여주는 완벽 한 종합 프로그램을 처리할 수 DNA는 생활 엔티티 인코딩됩니다.
TXTL 시스템 전통적인 생체 외에서 건설적인 생 화 확 적인 분석 실험에 비해 많은 기술적인 장점을 제시. 셀-무료 TXTL 살아있는 세포의 복잡 한 세포질 반대로 감소 하 고 오픈 환경에서 최종 제품에 유전자 발현의 과정을 연결합니다. TXTL DNA를 사용 하 여, 현대 DNA 조립 기술,는 저렴 하 고 빠른 까다로운 단백질 정화 단계를 요구 하지 않는 뿐만 아니라 생화학 시스템에 생체 외에서재구성. 셀-무료 식 대부분의 생 화 확 적인 반응, 따라서12분자 상호 작용 깊은 해 부를 수 있도록 구성 요소에 대 한 직접 액세스를 제공 합니다. TXTL 반응에서 거의 불가능 한 살아있는 세포에 자유로이 생화학 및 생물 설정을 변경할 수 하나. 이러한 장점과 최근 개선을 감안할 때, TXTL 기술 합성 및 양적 생물학에 대 한 대체 플랫폼으로 더 많은 인기 되고있다. TXTL를 사용 하 여 연구 커뮤니티는 빠르게 성장 하는 동안 TXTL 바이오에 표준 기술 되 고, 그것은 TXTL 반응의와 실행에 관련 된 적절 한 전략을 개발할 수 있도록 같은 플랫폼을 사용 하는 방법을 이해 필수적입니다는 결과의 해석입니다.
이 문서에서는, 우리 모든 대장균 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈11, MS2 같은 살 균 소를 한 냄비 반응에서 합성 하는 방법을 설명 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), 및 T7 (dsDNA, 40 kb). 우리는 페이지의 금액 반응 (마그네슘과 칼륨 농도)의 생 화 확 적인 설정의 일부에 관하여 변화를 합성 하는 방법을 보여줍니다. 말뚝의 범위 8000 농도 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, 여러 자릿수로 이상 살 균 소 합성에 극적인 효과가. 동시에 전사, 번역의 과정을 정리 하 고 자기 조립, 생물학 및 물리학에 관련 된 기본적인 질문을 해결 하기 위한 흥미롭습니다 단일 테스트 튜브 반응에서 이러한 큰 생화학 시스템의 실현 10 (유전자 규칙, 자기 조립), 뿐만 아니라 새로운 nanostructures13구축 페이지 기능을 재사용 하는 등 응용 프로그램 개발에. TXTL에는 실용적, 뿐만 아니라 우리 패 분석 실험에 의해 살 균 소 증폭, 게놈 추출 및 정화, 살 균 소 정량화 방법 제공합니다. 이 원고에 표시 메서드에 대장균 추출 기반 셀 자유로운 시스템을 사용 하 고 살 균 소에 관심이 연구원에 적합 합니다.
이 작품에서 제시 하는 프로토콜은 다음과 같이 요약 될 수 있다: 1) 살 균 소 확대 (주 1: 접종 준비 세포, 주 2: 플 라크, 여러 살 균 소 성장, 고 농도, 및 3 일: 살 균 소의 정화), 2) 더블-좌초 게놈 DNA 추출 (페 놀/클로 프롬 추출), 3) 셀 무료 살 균 소 반응과 titer 실험 (주 1: 호스트 셀 접시 고 한 천 배지, 주 2: 셀 무료 반응 하 고 호스트 세포 사전 문화, 그리고 하루 3: 호스트 셀 문화 및 살 균 소 titer).

<table width="899">
	<colgroup>
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:168pt" width="224" />
		<col style="width:219pt" width="292" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Ultracentrifugation tubes</td>
			<td class="xl21" style="width:168pt" width="224">Beckman Coulter</td>
			<td class="xl21" style="width:219pt" width="292">344057</td>
			<td class="xl20" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Conical tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Falcon</td>
			<td class="xl21">352070</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Gradient maker</td>
			<td class="xl21">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Syringe and Blunt Cannula</td>
			<td class="xl21">Monoject</td>
			<td class="xl21">8881513918 and 888202017</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Wide-bore pipette tips</td>
			<td class="xl21">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">02-707-134</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Plaque counter</td>
			<td class="xl21">New Brunswik Scientific</td>
			<td class="xl21">Colony Counter Model C-110</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Culture tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">14-961-33</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Cell-free system</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Mycroarray Inc</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">Mytxtl</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl17" style="width:168pt" width="224">BioComp Instruments</td>
			<td class="xl17" style="width:219pt" width="292">Model 105ME</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">LB agar plate recipe</td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl24" style="width:512pt" width="683">25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system

셀 무료 전사-번역 (TXTL) 시스템, 더 큰 다양성 및 모듈화, 테스트 튜브 반응에서 기초 및 응용 과학을 수행 하기 위해 새로운 기능을 제공 하기 위해 설계 된의 새로운 세대. 지난 10 년간, TXTL 셀 무료 소설 종합 연구 분야 관련된 양적 및 합성 생물학의 광범위 한 범위에 대 한 강력한 기술 되고있다. 새로운 TXTL 플랫폼은 생성 하 고 합성 또는 자연 유전자 회로 실행을 통해 생화학 시스템 심문 특히 유용 합니다. 생체 외에서 TXTL 입증 정리로 빠르게 프로토 타입 규제 요소와 뿐만 아니라 생물 네트워크에 편리한 메커니즘 생활 시스템에서 발견 하는 자기 조립 분자. 이 문서에서 설명 하는 어떻게 전염 성 살 균 소, 등 MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), 그리고 T7 (dsDNA), 전적으로 모든 대장균, 셀 프리 TXTL 시스템을 사용 하 여 한 냄비 반응에 그들의 게놈에서 합성 됩니다. 3 coliphages의 합성 상 패 분석 결과 사용 하 여 정량 이다. 우리는 합성된 살 균 소의 수확량 반응의 생 화 확 적인 설정에 따라 결정 하는 방법을 보여줍니다. 던지다 8000의 제어 집중을 통해 에뮬레이션 분자 크롤 링, magnitudes의 명령에 의해 합성된 페이지의 금액에 영향을 줍니다. 우리는 또한는 페이지를 증폭 하는 방법 및 그들의 게놈을 정화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 및이 작품에서 제시 하는 결과 집합이 셀 무료 합성 생물학 및 생명 공학에 종합 연구 참여에 대 한 관심의 이어야 한다.

우리는 4 개의 대표적인 결과 보여줍니다. 그림 1에서는 셀 무료 TXTL 시스템 및 살 균 소 DNA 주식 생활 오염 되지 되도록 부정적인 컨트롤 집합 소개 대장균 세포. 우리 셀 무료 TXTL 시스템은 그대로 대장균 의 무료 확인 모두 비 인 큐베이 팅 및 incubated 반응 솔루션 genomic DNA (그림 1A 와 그림 1B)의 무효를 도금 하 여 오염 셀. 경우 셀 무료 TXTL 시스템 대장균 세포 오염 되었다, 성장 접시에 관찰 될 것 이다. 또한, 우리 확인 셀 무료 반응 그리고 그러므로 어떤 가능한 오염 물질 셀, 살 균 소의 합성에 대 한 책임 도금 살 균 소 게놈 (그림 1C 와 와 비 인 큐베이 팅 및 incubated 반응 하 여 그림 1D). 플레이트 비 incubated 반응 (그림 1C) 표시 제로 플 라크 incubated 반응 (그림 1D) 플레이트 표시 셀 무료 TXTL 시스템은 살 균 소에 대 한 책임을 나타내는 패 합성입니다.
그림 2에서 우리는 균질 휘도가 패 분석 결과 대 비교합니다. 그림 2 B 그림 2A에서 접시의 균질 플 라크 밀도 비해 최적의 문화 접시에 걸쳐 패 밀도의 그라데이션을 보여 줍니다. 이 소스 관찰 결과 최고 천, 샘플 및 호스트 세균성 세포의 실험의 살 균 소 titer 부분 문화 접시에 적절 하 게 때 마스터 믹스의 급속 한 냉각에서. 살 균 소 패의 휘도가 확산을 피하기 위해, 배양 배지는 살 균 소 titer 실험을 시작 하기 전에 37 ° C에 equilibrated 확인 합니다.
플레이트 (그림 3) 당 50 그리고 200 패 사이 충분히 살 균 소 솔루션을 희석을 제대로 페이지를 계산 하는 중요 한 단계가입니다. 이 범위 아래의 어려운 사실 통계를 확인 하 고 이상이 범위는 플 라크 중복, 정확한 조사를 방지. 페이지 TXTL에 합성 수는 소금 (칼륨과 마그네슘), 분자 되어의 그리고 게놈의 농도 같은 생 화 확 적인 설정에 따라 다릅니다. 그림 4에서 우리는 T7, ΦΧ174 페이지에 대 한 테스트의 몇 가지 예를 보여줍니다. T7, 등의 DNA를 복제 하는 살 균 소에 대 한 우리 셀 무료 반응에서 살 균 소 종합의 높은 효율을 관찰: 반응에서 게놈 분자 당 3 개의 전염 성 페이지 합성 됩니다. 하나는 ΦΧ174 등의 DNA를 복제 하지 않는 페이지에 대 한 반응의 낮은 효율을 기대할 수 있습니다: 합성된 전염 성 살 균 소 게놈 분자의 비율은 1:5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig1.jpg"> 
그림 1: 패 분석 결과 컨트롤 및 셀 무료 반응 (CFR) 시스템을 사용 하 여 성공적인 전염 성 살 균 소 생산. (A) 아무 게놈 추가 되었습니다 하 고 CFR의 아무 보육 (보육 시간 0 분) 수행 되었다. 반응 다음 호스트 대장균없이 도금 했다. 결과 CFR의 셀 오염 없음 가능한 호스트를 보여줍니다. (B) 아무 게놈 추가 되었고 CFR 29 ° C에 12 h incubated 호스트 대장균없이 도금. 결과 셀 오염 CFR, 부 화 후에 아무 가능한 호스트를 보여줍니다. (C) 1 nM 게놈 CFR (보육 시간 0 분)의 아무 인큐베이션에 포함 된 및 호스트 대장균으로 도금. 결과 게놈 솔루션의 살 균 소 오염을 없이 보여줍니다. (D) 1 nM 게놈 포함 및 CFR incubated 29 ° c.에 12 h 그리고 호스트 대장균도금. 결과 CFR에 성공적인 전염 성 살 균 소 복제를 보여줍니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56144/56144fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig2.jpg"> 
그림 2 : 균질 titer 실험 기간 동안 살 균 소 반응의 휘도가 확산 대. 37 ° C의 온도에 equilibrated 하지 문화 접시에 살 균 소 titer를 수행의 효과 가능한 문화 접시에 걸쳐 살 균 소 반응의 휘도가 확산 이다. 살 균 소 반응의 균질 확산을 표시 하는 좋은 결과 (A)에 표시 되는 플 라크는 격판덮개의 표면에 걸쳐 고르게 배포 됩니다. 최적의 결과 (B)에 표시 되는 플 라크 문화 접시의 왼쪽 아래 부분에 집중 된다. 이 상단-한 천, 살 균 소 반응, 그리고 호스트 셀 마스터 믹스는 37 ° c.의 온도 문화 접시에 적절 하 고 발생할 수 있습니다. 믹스 마스터의 대부분 왼쪽 지역에서 굳은 그리고 균질 확산은 불가능 하다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56144/56144fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig3.jpg"> 
그림 3 : 셀 무료 살 균 소 반응의 titers에 대 한 적절 한 희석 요소가 설정. (A)이이 판 플 라크의 합리적으로 셀 수 있는 숫자를 표시 합니다. 실험의 titer 부분에 사용 되는 희석 요소 희석 접시에 plaques의 수 수를 두고 충분히 살 균 소 반응의 수확량. 반대로 (B) 희석 요소 합성된 살 균 소의 수확량에 관하여 너무 낮은 그리고 조정 될 필요가 있다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56144/56144fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56144/56144fig4.jpg"> 
그림 4 : 페이지의 셀 무료 합성의 특성 ΦΧ174 및 t 7. (A) 합성된 ΦΧ174 T7 페이지의 번호 (PFU/mL: plaque 밀리 리터 당 형성 단위)의 함수 던지다 셀 무료 반응에서 8000 농도 측정 후 16 h 29 ° c.에 외피의 셀 무료 반응에서 마그네슘 조미료 농도의 기능으로 합성된 ΦΧ174 T7 페이지의 (B) 수 16 h 29 ° c.에 외피의 후 측정 ΦΧ174 셀 무료 반응에서 DNA 게놈 농도의 기능으로 합성된 ΦΧ174 살 균 소의 (C) 수 16 h 29 ° c.에 외피의 후 측정 (D) 수 셀 무료 반응에서 T7 DNA 게놈 농도의 기능으로 합성된 T7 페이지의 29 ° c.에 외피의 16 h 후 측정 모든 오차 막대 표시는 3 개의 반복된 실험의 표준 편차입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56144/56144fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56144/56144table1.jpg"> 
표 1: 반응 구성. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56144/56144table1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

synthesis-infectious-bacteriophages-an-e-coli-based-cell-free

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

14.5K 조회수.  University of Minnesota. 셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

연구

생체공학

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A general protocol is described for the preparation of V. natriegens crude cell extracts using common laboratory equipment. This high yielding protocol has been specifically optimized for user accessibility and reduced cost. Cell-free protein synthesis (CFPS) can be carried out in small scale 10 &#956;L batch reactions in either a 96- or 384-well format and reproducibly yields concentrations of &#62; 260 &#956;g/mL super folder GFP (sfGFP) within 3 h. Overall, crude cell extract preparation and CFPS can be achieved in 1&#8722;2 full days by a single user. This protocol can be easily integrated into existing protein synthesis pipelines to facilitate advances in bio-production and synthetic biology applications.

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free expression systems are powerful and cost-efficient tools for the high-throughput synthesis and screening of important proteins. Here, we describe the preparation of cell-free protein expression system using Vibrio natriegens for the rapid protein production using plasmid DNA, linear DNA, and mRNA template.

셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is catheter-directed thrombolytics (CDT). To mitigate caustic side effects and the long treatment time associated with CDT, adjuvant and alternative approaches are under development. One such approach is histotripsy, a focused ultrasound therapy to ablate tissue via bubble cloud nucleation. Pre-clinical studies have demonstrated strong synergy between histotripsy and thrombolytics for clot degradation. This report outlines a benchtop method to assess the efficacy of histotripsy-aided thrombolytic therapy, or lysotripsy.
Clots manufactured from fresh human venous blood were introduced into a flow channel whose dimensions and acousto-mechanical properties mimic an iliofemoral vein. The channel was perfused with plasma and the lytic&#160;recombinant tissue-type plasminogen activator. Bubble clouds were generated in the clot with a focused ultrasound source designed for the treatment of femoral venous clots. Motorized positioners were used to translate the source focus along the clot length. At each insonation location, acoustic emissions from the bubble cloud were passively recorded, and beamformed to generate passive cavitation images. Metrics to gauge treatment efficacy included clot mass loss (overall treatment efficacy), and the concentrations of D-dimer (fibrinolysis) and hemoglobin (hemolysis) in the perfusate. There are limitations to this in vitro design, including lack of means to assess in vivo side effects or dynamic changes in flow rate as the clot lyses. Overall, the setup provides an effective method to assess the efficacy of histotripsy-based strategies to treat DVT.

Histotripsy-aided lytic delivery or lysotripsy is under development for the treatment of deep vein thrombosis. An in vitro procedure is presented here to assess the efficacy of this combination therapy. Key protocols for the clot model, image guidance, and assessment of treatment efficacy are discussed.

히스토트립시 및 리틱 약물의 혈전용 효능을 측정하는 체외 시스템

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

OnePot PURE Cell-Free System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic biology. Unfortunately, commercially available systems are costly, and their tunability is limited. In comparison, a home-made approach can be customized based on user needs. However, the preparation of home-made systems is time-consuming and arduous due to the need for ribosomes as well as 36 medium scale protein purifications. Streamlining protein purification by coculturing and co-purification allows for minimizing time and labor requirements. Here, we present an easy, adjustable, time- and cost-effective method to produce all PURE system components within 1 week, using standard laboratory equipment. Moreover, the performance of the OnePot PURE is comparable to commercially available systems. The OnePot PURE preparation method expands the accessibility of the PURE system to more laboratories due to its simplicity and cost-effectiveness.

We present a fast and cost-effective method to produce the recombinant PURE cell-free TX-TL system using standard laboratory equipment.

원팟 퓨어 셀 프리 시스템

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the fine-tuning of genetic circuits, such that their function results in predictable outcomes. With the growth of synthetic biology as a field, there has been an explosion of genetic circuits that have been implemented in microbes to execute functions pertaining to sensing, metabolic alteration, and cellular computing. Here, we show a rapid and cost-effective method for characterizing genetic parts. Our method utilizes cell-free lysate, prepared in-house as a medium to evaluate parts via the expression of a reporter protein. Template DNA is prepared by PCR amplification using inexpensive primers to add variant parts to the reporter gene, and the template is added to the reaction as linear DNA without cloning. Parts that can be added in this way include promoters, operators, ribosome binding sites, insulators, and terminators. This approach, combined with the incorporation of an acoustic liquid handler and 384-well plates, allows the user to carry out high-throughput evaluations of genetic parts in a single day. By comparison, cell-based screening approaches require time-consuming cloning and have longer testing times due to overnight culture and culture density normalization steps. Further, working in cell-free lysate allows the user to exact tighter control over the expression conditions through the addition of exogenous components and DNA at precise concentrations. Results obtained from cell-free screening can be used directly in applications of cell-free systems or, in some cases, as a way to predict function in whole cells.

Well-characterized genetic parts are necessary for the design of novel genetic circuits. Here we describe a cost-effective, high-throughput method for rapidly characterizing genetic parts. Our method reduces cost and time by combining cell-free lysates, linear DNA to avoid cloning, and acoustic liquid handling to increase throughput and reduce reaction volumes.

무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성 분석

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.