Этот протокол для рекомбинантной бесклеточной системы экспрессии белка, широко известной как система PURE, использует культивирование клеток и очистку клеток для оптимизации требуемых белковых очистк. Это значительно минимизирует временные и трудовые требования. Метод OnePot оказался не только экономичным, но и эффективным по времени.
Это сокращает время подготовки с нескольких недель до трех рабочих дней. Это делает бесклеточную платформу PURE доступной для большего количества лабораторий по всему миру и помогает реализовать эту действительно мощную платформу для синтетической бесклеточной биологии. Прежде чем начать, убедитесь, что все штаммы хорошо экспрессуют свой соответствующий белок.
Для начала подготовьте колонку для очистки белка OnePot, как описано в текстовой рукописи, используя два миллилитра смолы сефарозы, а затем зарядите колонку сульфатом никеля. Подготовьте закваски, соединив 20 миллилитров среды LB с 20 микролитрами ампициллина. Добавьте 300 микролитров среды в 35 лунок стерильной плиты глубиной 96 лунок.
Инокулируйте каждый из них соответствующей деформацией, за исключением термостабильного коэффициента удлинения, или EFTU, и запечатайте пластину дышащей мембраной. Для культуры EFTU привите три миллилитра ампициллина, содержащего LB-носок, в 14-миллилитровой культурной трубке с защелкиванием. Около трех миллилитров культуры EFTU достаточно для одной культуры выражения OnePot.
Высиживая его при 37 градусах Цельсия, встряхивая со скоростью 260 оборотов в минуту в течение ночи. На следующий день переложите 500 миллилитров среды LB и 500 микролитров ампициллина в стерильную сбитую колбу. Инокулируйте культуру OnePot PURE 1 675 микролитрами культуры EFTU и 55 микролитрами каждой из культур из глубокой плиты скважины.
Инкубируют культуру в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с встряхиванием 260 оборотов в минуту, или до тех пор, пока оптическая плотность культуры не достигнет от 0,2 до 0,3. Индуцируют культуру 500 микролитрами 0,1 миллимолярного IPTG и растут в течение дополнительных трех часов. Собирайте клетки центрифугированием при четырех градусах Цельсия и 3, 220 раз g в течение 10 минут и храните гранулы ячейки при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования.
На третий день измерьте количество буферов, необходимых для их очистки, и добавьте TCEP ко всем из них, как указано в тексте. Храните оставшиеся буферы без TCEP при четырех градусах Цельсия для будущих очистк. Уравновешивайте заряженную колонну 30 миллилитрами буфера А.После того, как через него прошло 25 миллилитров буфера А, закройте колонну снизу.
Разморозить клетки и использовать серологическую пипетку для повторного суспендирования клеточной гранулы в 7,5 миллилитрах буфера A.Lyse клеток с помощью зонда мощностью 130 Вт. Если ультразвуковая хищность будет успешной, раствор станет темнее. Убедитесь, что клетки держатся на льду и поместите зонд достаточно глубоко, не касаясь трубки.
Удалите обломки клеток центрифугированием при 21, 130 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и держите лисат на льду. Добавьте супернатант в уравновешивающий столбец. Закройте колонну сверху и убедитесь, что нет утечки.
Инкубировать колонну в течение трех часов при четырех градусах Цельсия при вращении с помощью трубчатого ротатора. Элюйте несвязанные компоненты из колонны и промывайте 25 миллилитрами буфера А.Промыть колонну 25 миллилитрами 25 миллимолярного имидазол-буфера. Элюируют белки пятью миллилитрами 450-миллимолярного имидазолового буфера и сохраняют элюированные белки на льду в любое время.
Разбавьте элюат 25 миллилитрами буфера HT и держите смесь на льду. Добавьте 15 миллилитров в 15-миллилитровый центробежный фильтр и сконцентрируйте до объема 1,5 миллилитров. Добавьте оставшиеся 15 миллилитров в фильтр с концентрированным раствором и еще раз сконцентрируйте до 1,5 миллилитра.
Добавьте 10 миллилитров буфера HT к концентрированной пробе и концентрат до одного миллилитра. Извлеким концентрированный образец и добавьте равное количество запасного буфера В и храните при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Во время буферного обмена восстановите столбец, указанный в тексте.
На четвертый день измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Сконцентрируйте образец с помощью 0,5 миллилитров трех килодалтонного отсечных центробежных фильтров до 20 миллиграммов на миллилитр. Проверьте состав белка OnePot PURE с помощью страницы SDS.
Разбавьте 2,5 микролитра образца 7,5 микролитрами воды, смешанной с 10 микролитрами двух буферов X Laemmli, а затем загрузите на гель пять микролитров и 2,5 микролитра образцов. Запустите страницу SDS, как указано в тексте. Заполните концентрацию и длину ДНК в соответствующих желтых клетках в электронной таблице, используя от двух до 10 наномоляров ДНК для реакции.
Заполните желаемый общий объем реакции микролитрами. Извлеките необходимые реагенты из морозильной камеры и разморозьте их на льду. Затем пипетка рассчитанного количества воды, ДНК и энергетического раствора на одну сторону ПЦР-трубки или один угол скважины на пластине 384 скважины.
Пипетка рассчитанных количеств белка и рибосомного раствора на другую сторону ПЦР-трубки или противоположный угол 384-й колодезной пластины. Вращайтесь около 30 секунд, чтобы объединить компоненты реакции. Чтобы предотвратить испарение во время экспериментов со считывателем пластин, добавьте 35 микролитров жидкого воска и запечатайте пластину прозрачным герметиком.
Инкубировать в течение минимум трех часов при 37 градусах Цельсия. Для считывания на пластинчатом считывателе измеряйте интенсивность цветения на требуемой длине волны каждые две минуты. Успешная экспрессия во всех отдельных штаммах, используемых впоследствии для белкового препарата OnePot, показана здесь.
Общий состав конечного белкового раствора OnePot PURE был проанализирован на странице SDS. Заметно, что EFTU присутствует в более высокой концентрации по сравнению с другими белками, как и ожидалось. Выходы синтеза белкового раствора OnePot в сочетании с his-помеченными или непомеченными рибосомами анализировали путем мониторинга флуоресценции eGFP с течением времени.
Уровни экспрессии трех различных белков, помеченных с использованием системы маркировки tRNA in vitro с зеленым списком или окрашивания Kumasi, были проанализированы на геле страницы SDS. Для функциональной системы PURE абсолютно важно, чтобы все штаммы хорошо экспрессивали свои соответствующие белки. Этот метод облегчает внедрение системы PURE в биологическую системную инженерию, позволяя создавать новые генетические сети, молекулярную диагностику, терапевтические и образовательные наборы.
