DNA 메틸화의 생물 정보학 분석에 대한 샘플 준비 : 비만 및 관련 특성 연구를위한 협회 전략

대규모 오믹스 기술은 비만에 초점을 맞춘 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 후성 유전학은 노출과 건강 결과 사이의 연결 고리가 될 수 있습니다. 이러한 유형의 연구는 엄청난 양의 데이터를 생성합니다.

이를 감안할 때 데이터를 기술적으로 비교할 수 있도록 프로토콜을 표준화하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 DNA 메틸화 데이터를 얻고 분석하기 위해 파이프 라인을 제안 할 것입니다. 동일한 프로토콜을 400K 및 에픽 버전 모두에 적용할 수 있습니다.

첫째 날 : 중아황산염 처리. 게놈 DNA를 변성시키는 것으로 시작한 다음 전환 시약을 추가하십시오. 키트의 권장 사항을 따라야합니다.

변성 DNA를 비스포스페이트로 처리한다. 그런 다음 샘플을 열 사이클러에서 인큐베이션한다. 세척 버퍼를 사용하여 세척 단계를 수행하십시오.

둘째 날:메틸화 분석, 수동 프로토콜에 따른 증폭. 혼성화 오븐을 섭씨 37도에서 예열하고 온도가 평형을 이루도록하십시오. 20 마이크로 리터의 MA1을 플레이트의 웰에 분산시킵니다.

네 마이크로 리터의 DNA를 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 네 마이크로 리터의 수산화 나트륨 용액을 플레이트 웰에 분산시킵니다. 플라스틱 씰로 플레이트를 밀봉하십시오.

플레이트를 소용돌이 치며 시약을 샘플과 혼합하십시오. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 68 마이크로리터의 RPM을 각 웰에 분산시킨 다음, 이전의 용액을 제거하지 않고 75 마이크로리터의 MSM을 분산시킨다.

새 씰을 사용하여 플레이트를 덮으십시오. 접시를 한 분 동안 소용돌이치십시오. 혼성화 오븐에서 섭씨 37도에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션한다.

셋째 날:메틸화 분석, 수동 프로토콜에 따른 혼성화. 플레이트를 섭씨 37도에 삽입하여 블록을 예열하십시오. 하이브리디제이션 오븐에서 플레이트를 조심스럽게 제거하십시오.

플레이트를 펄스 원심분리한다. 플레이트에서 씰을 분리합니다. 50 마이크로 리터의 FMS를 각 샘플 용기에 첨가하십시오.

접시를 한 분 동안 소용돌이치십시오. 플레이트에 필요한 원심 분리기. 그런 다음 밀봉 된 플레이트를 섭씨 37도에서 가열 블록 위에 한 시간 동안 놓습니다.

100 마이크로 리터의 PM1을 샘플이 들어있는 각 웰에 첨가하십시오. 플레이트를 다시 밀봉하십시오. 접시를 한 분 동안 소용돌이치십시오.

섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 원심 분리기에서 1 분 동안 펄스 한 다음 샘플이있는 각 웰에 300 마이크로 리터의 100 % 2- 프로판올을 첨가하십시오. 플레이트를 다시 밀봉하십시오.

플레이트를 적어도 10 번 뒤집어서 모든 내용물을 혼합하십시오. 섭씨 네 도에서 30분 동안 배양한 다음, 섭씨 네 도에서 20분 동안 원심분리한다. 플레이트에서 씰을 분리합니다.

플레이트를 적절한 장소에서 신속하게 뒤집어 상청액을 버립니다. 모든 우물에 액체가 없다는 것을 알게 될 때까지 여러 번 단단히 누릅니다. 실온에서 플레이트를 거꾸로 놓고 한 시간 동안 덮지 마십시오.

모든 액체를 건조 한 후에는 우물 바닥에 파란색 팔레트가 있어야합니다. 그런 다음 46 마이크로 리터의 RA1을 각 웰에 첨가하십시오. 열 밀봉을 플레이트에 바릅니다.

밀봉을 고르게 수행하기 위해 단단히 잡으십시오. 플레이트를 하이브리디제이션 오븐에 섭씨 48도에서 한 시간 동안 넣은 다음 1 분 동안 와류하십시오. 원심분리기에서 펄스하고, 플레이트를 섭씨 95도에서 한 시간 동안 가열한다.

BeadChip Hyb 챔버를 함께 준비합니다. 이 다음 단계에서는 400 마이크로 리터의 PB2를 Hyb Chambers의 저수지에 분산시킵니다. Hyb Chamber 저수지에 PB2를 채운 후 즉시 뚜껑을 덮으십시오.

플레이트의 각 샘플을 마이크로어레이의 샘플 입구로 조심스럽게 로딩하십시오. 마이크로어레이가 포함된 Hyb 챔버 인서트를 Hyb 챔버에 로드합니다. Hyb 챔버의 가능한 이동을 피하기 위해 Hyb 챔버를 십자형으로 닫으십시오.

넷째 날:메틸화 분석, 수동 프로토콜에 따른 염색. 야간 인큐베이션 후, 삽입물로부터 모든 마이크로어레이를 제거하였다. 마이크로어레이를 천천히 그리고 가볍게 세척하고, 총 10회 위아래로 세척한다.

마이크로어레이를 PB1 컨테이너 번호 2로 이동하고 위아래로 10번 반복합니다. 흐름 챔버의 프레임을 올바른 위치에 놓은 다음 각 마이크로어레이를 배치합니다. 각 스페이서의 맨 위에 투명한 스페이서를 사용하십시오.

정렬 막대는 정렬 액세서리에 배치해야 합니다. 유리 백 플레이트는 스페이서 위에 놓아야합니다. 그런 다음 금속 클램프를 플로우 챔버에 부착하십시오.

가위를 사용하여 플로우 챔버 스페이서의 끝을 트리밍합니다. 마이크로어레이가 있는 플로우 챔버를 챔버 랙에 넣습니다. 피펫 150 마이크로 리터의 RA1.

30 분 동안 배양하고 다섯 번 반복하십시오. 450 마이크로리터의 XC1을 피펫하고, 10분 동안 인큐베이션한다. 450 마이크로리터의 XC2를 피펫하고 10분 동안 인큐베이션한다.

피펫 200 마이크로 리터의 TEM. 15분 동안 인큐베이션한다. 피펫 450 마이크로 리터의 95 % 포름 아미드.

한 분 동안 배양하고 두 번 반복하십시오. 다섯 분 동안 배양하십시오. 피펫 450 마이크로 리터의 XC3.

한 분 동안 배양하고 반복하십시오. 이 단계에서, 다음의 시약, 250 마이크로리터의 STM, 450 마이크로리터의 XC3 및 250 마이크로리터의 ATM이 분배될 것이다. 다음 반복 체계를 수행하십시오.

모든 반복과 인큐베이션 후, 마이크로어레이를 스탠딩 랙에 놓고 세척 용기에 담그십시오. 위아래로 움직이면서 천천히 가볍게 움직이며 10 번 움직입니다. 마이크로어레이를 진공 데시케이터를 사용하여 50 내지 55분 동안 건조시킨다.

마이크로어레이가 건조되면, 스캔으로 마이크로어레이를 이미지화한다. 이 이미지에서는 참가자 선택부터 메틸화 실험 마지막 날에 얻은 IDAT 파일 처리에 이르기까지 사용 된 모든 프로토콜을 볼 수 있습니다. 파일은 생물 정보 분석이 수행 된 컴퓨터로 전송되었습니다.

분석은 R Studio 및 Bioconductor ChAMP 패키지를 사용하여 처리하였다. 컴퓨터에 최소 여덟 기가바이트의 RAM이 있는지 확인합니다. 유전자 농축과 같은 다른 생물정보학 분석은 데이터를 독자에게 더 잘 제시하기 위해 수행되었다.

이 표에서 우리는이 연구에 사용 된 두 그룹, 비만과 비 비만을 관찰 할 수 있습니다. 변수, 체질량 지수, 복부 둘레, 킬로그램의 지방 질량 및 지방 질량에 대한 그룹간에 차이가있었습니다. 이 그림에 제시된 계획을 관찰하면서 우리는 제안 된 프로토콜이 우리의 데이터에 적합하다는 것을 이해할 수있었습니다.

그리고 생물정보분석 후, 필터가 수행된 후에 총 409, 887개의 프로브가 제시되었다. 밀도 플롯은 모든 샘플이 베타 분포의 밀도가 비슷하다는 것을 밝혀 냈습니다. 이들 분석에 기초한 샘플은 배제되지 않았다.

정규화된 데이터의 단수 값 분해 분석은 BMI, 이중 C 및 FM이 DNA 메틸화 데이터 변동성에 유의하게 영향을 미친다는 것을 밝혀냈다. 세포 유형 추정에 따르면 자연 살해 세포, NK 및 B 세포 모두 비만 여성에서 더 높았다. 비만 여성과 비비만 여성 사이의 DNA 메틸화 수준은 세포 유형 교정 전후에 달랐다.

보정 전에, 43, 463개의 상이한 메틸화 위치가 관찰되었다. 그리고 그 후, 3, 329 CPG가 크게 남아있었습니다. 총 162 개의 CPG가 하이포 메틸화되었고, 576 개는 비만이 아닌 비만에 비해 하이퍼 메틸화되었습니다.

데이터는 GEO 데이터베이스에서 등록 코드 GSE166611로 사용할 수 있습니다. 우리는 SVD에서 관찰 된 참가자의 특정 특성과 관련된 CPG 사이트를 제시합니다. 지방 질량의 경우, 13, 222 CPG 부위가 발견되었다.

프로모터 영역에서 6, 159개의 지방량 관련 CPGs가 있었다. 470 하이포메틸화 및 94 하이퍼메틸화. 연관된 부위의 각각의 유전자가 풍부해졌고, 이제 보여진다.

우리는 제안 된 프로토콜이 메틸화 패턴 내에서 식별 할 수 있으며 메틸화 내에서 관련시키는 것이 옳다는 것을 관찰했습니다. 우리의 결과는 비만 성 생활 방식이 인간 DNA의 후성 유전 적 변화를 촉진 할 수 있음을 확인합니다.