이 작품은 CPRIT 연구 교육 상 RP140105에서 지원뿐만 아니라 부분적으로 건강의 미국 국립 보건원 (NIH) R01 GM114142을 부여하여 윌리엄 &amp; 엘라 오웬스 의학 연구 재단이 지원됩니다.

모든 조직은 임상 시험 심사위원회위원회의 승인을 다음과 얻어진 모든 참가자가 분자 분석과 후속 연구에 모두 동의 할 때. 프로토콜은 샌 안토니오 텍사스 건강 과학 센터의 대학에서 인간 연구위원회에 의해 승인됩니다. 1. 메틸 결합 DNA 캡처 (MBDCap) <ol><li> 샘플 수집 및 DNA 분리 <ol><li> 환자 파라핀 조직 샘플에서 대량 종양 또는 정상 조직 샘플을 수집합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 파라핀 조직 샘플에서 게놈 DNA를 분리 상업 DNA 미니 키트를 사용합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 여기에 설명 된 절차에 메틸화 DNA 농축 키트를 사용합니다. </li></ol></li><li> 초기 비드 세척 참고 : 구슬은 게놈에 DNA 메틸화를 검출 MBD - 비오틴 단백질과 커플하는 데 사용됩니다. 구슬은 일반적으로 일시 중단주식 솔루션입니다. 이 액체를 씻어하려면 다음 단계를 사용합니다. <ol><li> 균일 한 현탁액을 얻기 위해 아래로 부드럽게 피펫 팅에 의해 스트렙 타비 딘 비즈 (재료 표 참조)의 주식을 재현 탁합니다. 텍싱하여 구슬을 혼합하지 마십시오. </li><li> 입력 DNA 중 하나 μg의 경우, 1 배 바인딩 / 워시 버퍼의 90 μL와 튜브 구슬의 add10 μL. 1 분 동안 회전합니다. 텍싱하여 혼합하지 마십시오. </li><li> 1 분 동안 자기 랙에 튜브 (들)을 놓습니다. </li><li> 피펫으로 액체를 제거하고 액체를 폐기합니다. </li><li> 구슬에 1 배 바인딩 / 워시 버퍼 250 μL를 추가하고 1 분 동안 회전합니다. </li><li> 두 번 1.2.5 - 반복 1.2.3 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 비드에 MBD-비오틴 단백질 커플 링 <ol><li> 입력 DNA의 1.2 μg의, 각 튜브에 MBD - 비오틴 단백질의 7 μL (3.5 μg의)를 추가합니다. </li><li> 100 μL의 최종 볼륨을 만들기 위해 단백질 1 배 바인딩 / 워시 버퍼의 93 μL를 추가합니다. </li><li> 구슬 단백질을 혼합실온에서 1 시간 동안 회전 혼합기에서 혼합. </li></ol></li><li> 단편화 된 DNA (입력) <ol><li> TE 버퍼 96 μL, 24 μL 5 배의 귀속 / 세척 버퍼에 전체 게놈 DNA의 1.2 μg의를 추가하여 초음파 처리 DNA 120 μL 솔루션을 확인합니다. 25 시간 - 30의 전원 ON 및 초음파 동안 30의 전원 OFF, 20을 사용합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 혈압 (350) - (150)의 범위로 단편의 크기를 확인하는 상업용 고감도 DNA 키트와 bioanalyzer 시스템을 이용하여 초음파 DNA 용액 1 μL를 실행. </li></ol></li><li> MBD-구슬을 씻으십시오 <ol><li> 1 분 동안 자기 선반에 MBD-구슬이 들어있는 튜브를 놓습니다. </li><li> 제거하고 구슬을 건드리지 않고 피펫으로 액체를 폐기합니다. </li><li> 1 배 바인딩 / 워시 버퍼 250 μL와 비드를 재현 탁. </li><li> 5 분 동안 실온에서 회전 믹서 비드 섞는다. </li><li> 두 번 1.5.4 - 반복 1.5.1 단계를 반복합니다. </l난&gt; </ol></li><li> 단편화 된 DNA 캡처 반응 (1 μg의 입력 DNA) <ol><li> MBD 비드를 함유하는 튜브에 DNA / 완충액 혼합물을 전송. </li><li> RT에서 1 시간 동안 회전 혼합기에서 DNA와 MBD 비드 섞는다. 또한, 4 오 ℃에서 O / N을 혼합 </li></ol></li><li> 구슬에서 비 캡처 DNA 분리 <ol><li> 1 분은 상기 튜브의 내벽에 비드 모두 집중하기 위해 DNA와 MBD 비드를 혼합 한 후, 자기 선반에 튜브를 놓는다. </li><li> 피펫으로 상층 액을 제거하고 DNA nonmethylated 같은 깨끗한 DNase의 프리 microcentrifuge 관에 저장한다. 얼음이 샘플을 저장합니다. </li><li> 구슬을 씻어 구슬에 1 배 바인딩 / 워시 버퍼 200 μL를 추가합니다. </li><li> 3 분 동안 회전 믹서 비드 섞는다. </li><li> 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다. </li><li> 피펫으로 액체를 제거하고 microcentrifuge 관에 저장합니다. </li><li> 캡총이 더 세척 분획을 위해 1.7.6 - 입력 DNA의 ≤1 μg의의 반응을 진짜야, 반복 1.7.3 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 단일 분수 용출 <ol><li> 높은 소금 버퍼 저염 버퍼 믹스 (1 : 1) 용출 버퍼 (1,000 밀리미터의 NaCl)을 얻을 수 있습니다. </li><li> 용출 버퍼 (1000 mM의 염화나트륨)의 200 μL의 비드를 재현 탁. </li><li> 3 분 동안 회전 믹서에 구슬을 품어. </li><li> 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다. </li><li> 자기 선반에 장소에 튜브, 피펫 팁으로 구슬을 건드리지 않고 피펫으로 액체를 제거하고 깨끗한 DNase의 프리 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 저장합니다. 얼음이 샘플을 저장합니다. </li><li> 반복 1.8.1 단계 - 같은 튜브의 두 번째 샘플을 수집 한 번 1.8.4을 (총 부피는 400 μL 될 것입니다). 얼음에 풀링 된 샘플을 저장합니다. </li></ol></li><li> 에탄올 침전 (DNA 정리) <ol><li> 각 noncaptured, 세척 및 용출 분수 FR에이전 단계 OM 1 μL의 글리코겐을 추가 (20 μg의 / 키트에 포함 μL), 3M 아세트산 나트륨 1/10 샘플 볼륨의 pH 5.2 (예를 들어, 400, 40 μL 샘플 μL) 및 100 %의 2 샘플 볼륨 에탄올 (예, 400 당 800 μL 샘플 μL). 총 부피는 1241 μL이다. </li><li> 잘 믹스 적어도 2 시간 동안 C O를 -80에서 품어. </li><li> 4 오 ℃에서 11,363 XG에 15 분 동안 튜브를 원심 분리기 </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. </li><li> 차가운 70 % 에탄올 500 μL를 추가합니다. </li><li> 4 오 ℃에서 11,363 XG에서 5 분 튜브를 원심 분리기 </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. </li><li> 1.9.7 한 번 남아있는 잔류 뜨는을 제거 - 반복 1.9.6 단계를 반복합니다. </li><li> ~ 5 분 펠렛을 공기 - 건조. 완전히 펠렛을 건조하지 마십시오. </li><li> DNase의없는 물 또는 기타 37.5 μL의 DNA 펠렛을 재현 탁버퍼의 적절한 볼륨. </li><li> 얼음의 DNA를 배치 또는 -20 ℃로 또는 아래에서 더 사용할 때까지 DNA를 저장합니다. </li><li> DNA의 총량이 20 ng의 위에 있는지 확인합니다 (예, 형광 정량 시스템을 사용, 재료 표 참조). </li></ol></li></ol> 2. 시퀀싱 <ol><li> 시퀀싱 MBDCap 절차에서 회수 된 DNA 조각을 사용합니다. 각 샘플 시퀀싱하기 위해서는 (20)의 총량 - 40 ng의 DNA를 라이브러리 제조를 위해 요구된다. </li><li> DNA-SEQ 라이브러리 준비는 완전 자동화 된 라이브러리 구축 시스템을 사용하십시오 (재료 표 참조) 및 제조 업체에서 제공하는 표준 프로토콜을 따르십시오. 라이브러리 준비를위한 400 bp의 - 크기 (200)의 선택 DNA 조각. 자동화 라이브러리 제조 시스템은 라이브러리 제조 과정을 표준화 의한 수동 제제에 샘플에 걸쳐 변화를 최소화 허용한다. </li><li> 사용 어댑터 프라임RS 및 100 배 농도로 희석. 이 중, 각 샘플 10 μL를 사용합니다. </li><li> 단계 2.2에 따라, 반응을 수행하고, 형광 정량 시스템 (재료 표 참조)를 사용하여 DNA-SEQ 라이브러리를 정량화. <ol><li> PCR 증폭 과정을 설정합니다. PCR 마스터 믹스의 선택은 게놈의 GC 풍부 영역의 PCR 효율을 향상시키는 것이다. PCR의 관에서 15 μL DNA-서열 라이브러리를 추가, 25 μL PCR 마스터 믹스 (재료 표 참조) 2 μL PCR 프라이머 믹스 (재료 표 참조), 8 μL H 2 O </li></ol></li><li> 출발 물질을 다른위한 순환 시간과 온도 변화의 PCR 마스터 믹스의 제조 업체에서 PCR 권고를 따라 98 O C 45 초 동안, 15 초 98 O를 C, 30 초 65 O를 C, 30, 72 O를 C의 X 사이클 의, 1 분 후 72 O를 C. 4 오 ℃에서 잡아 <ol><li> 반환 한(- 10 회 8) 라이브러리 DNA의 10 nm의 - 2로 끝날 정도로 사이클을 ORM. </li></ol></li><li> 1 PCR 반응 정리 : 제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 정화 구슬의 1 비율 (재료 표 참조). </li><li> 30 μL 용출 완충액 - 20 용리. </li><li> 흐름 셀의 한 차선으로 4 샘플 함께 각각의 샘플과 풀을 바코드. 시퀀싱에 대한 표준 50 bp의 단일 읽기 프로토콜 (재료 표 참조)를 사용합니다. </li></ol> 3. 생물 정보학 분석 주의 : 서열로부터 수득 또한 프로세스 원료 fastq 파일은 품질 제어를 수행하며 게놈 짧은 DNA 서열 (판독) 매핑. <ol><li> 사용 나비 넥타이 짧은 판독 노광 각 샘플 fastq 파일의 게놈 맵핑 도구가 기준 게놈 판독 매핑한다. 다수의 판독 매핑 툴이 단계를 수행 할 수있는 개인 선호도에 따라 사용될 수있다. <ol><li> 도 ë 2 불일치까지 허용참조 게놈에 매핑하는 동안 전자는 읽습니다. 각 읽기 (20) 최고의 정렬까지보고합니다. 예를 들어, 나비 넥타이 -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 &lt;ebwt&gt; &lt;fastqFile&gt; &lt;alignFile&gt;를 사용합니다. </li></ol></li><li> 다중 매핑이 농후 영역의 검출을 개선하기 위해 판독 복구 LONUT 9를 사용한다. 각각의 판독의 경우, 최대 하나의 배향으로는 상기 호출 피크 중 충분히 근접 할 때 복원 될 것이다. 예를 들어, 사용 : 펄 lonut.pl -g hg19 -w (250) -p (99) &lt;alignFile&gt; &lt;outputPath&gt;. LONUT 다음 단계를 수행합니다. <ol><li> 로 분할 정렬 고유 읽고 매핑과 다중 읽기 매핑. 유일하게 매핑에 전화 피크는 피크 발신자 벨트 (11)를 사용하여 읽습니다. 예제 명령 (250) 및 -p 99 -w 옵션은 BELT위한 것입니다. </li><li> 고유 매핑 수확기는 LONUT에서 얻은 읽기 회복과 함께 읽고, 결합은 침대 형식으로 추가 분석에 사용됩니다 읽습니다. COMBIN 수를 계산에드는 미래의 정상화를 위해 읽습니다. </li></ol></li><li> 빈 읽습니다. 추출 펄 스크립트를 사용하여 관심의 영역에서 읽 펄 methyPipeline.pl &lt;sampleInfoFile&gt; &lt;refGeneFile&gt; - 최대 &lt;상류 연장 길이&gt; -dn &lt;하류 연장 길이&gt;. sampleInfoFile에 나열된 각 침대 파일의 경우, 펄 스크립트는 아래의 작업을 수행합니다. 참고 : 펄 스크립트 추가 코딩 파일을 참조하십시오. <ol><li> 빈 24 염색체를 들어, 고정 빈 크기로 예를 들어, 100 bp의를 읽습니다. </li><li> refGeneFile에 지정된 각 유전자의 경우, 옵션 - 최대 및 -dn에 의해 지정된 연장 길이까지 전사 시작 사이트 주위의 빈 (TSS)을 추출한다. 예를 들어, 최대 및 다운 스트림 TSS 4 KB입니다 지역에서 데이터를 추출합니다. 빈 크기는 100 염기쌍, 이것은 데이터가 81 빈들을 추출하고, 상기 중앙의 빈 TSS에 대응한다. </li><li> 왼쪽에서 오른쪽으로 상류 쓰레기통은 항상 있도록 안티센스 가닥의 유전자를 들어, 괞 찮아 추출 된 영역을 반전상기 펄 스크립트 왼쪽에 세드릭. </li><li> 2킬로바이트을 상류 왼쪽, 상류 4킬로바이트; 또한 세 개의 하위 영역으로 TSS ± ​​4킬로바이트 영역을 분할 중동 최대 및 다운 스트림 2킬로바이트; 오른쪽, 4킬로바이트에 2킬로바이트 하류. </li><li> 3.3.3 계산 판독 매핑를 합한 총 횟수로 각 빈 판독의 각 샘플에 대해, 상기 카운트를 나눈다. 샘플 특정 제거됩니다 정규화는 차이를 읽고 다른 샘플에서 읽고 비교할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 왼쪽 영역으로부터 얻어진 판독 정규화에서 통계 테스트를 수행 (스크립트 파일에 나타낸 바와 같이) 측면 영역으로 기술 영역에서 정상적인 경우 그룹간에 차이 메틸화를 검출하는 상기 배시 스크립트를 실행. 주 : bash는 스크립트의 추가 코딩 파일을 참조하십시오. 차별적 메틸화 된 지역을 기반으로, 일곱 조합이있다 : 지역 전체 다음 TSS ± ​​4킬로바이트 영역에 걸쳐 차동 메틸화 MiddleLeft : 모두 중앙과 왼쪽 지역에서 차동 메틸화 MiddleRight : 모두 중간과 오른쪽 지역에서 차동 메틸화 측면 : 왼쪽과 오른쪽 지역에서 차동 메틸화 왼쪽 : 왼쪽 지역에서 차동 메틸화 만 오른쪽 : 오른쪽 지역에서 차동 메틸화 만 중간 : 중간 영역에 차등 메틸화 만 </li><li> 토네이도 플롯에서 차동 메틸화를 시각화하기 위해 동일한 bash는 스크립트를 사용합니다. 별도의 패널에 하이퍼 및 하이포 메틸화 유전자를 플롯 각각 3.4에 설명 된 영역의 조합의 순서로 정렬. </li></ol>

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이 프로토콜은 샌 안토니오 텍사스 건강 과학 센터의 대학에서 박사 팀 황 박사 빅터 진의 실험실에서 개발되고있다.

MBDCap-SEQ 기술은 환자 (15)의 다수 집단을 조사 할 때 비용 효율적인 대안으로 고려 친 화성 농축 방법 (3)이다. 여기에 제시된 파이프 라인은 데이터 분석 및 해석에 샘플 조달에서 포괄적 인 접근 방식을 설명합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 DNA 메틸화가 발생하는 곳이므로 게놈에서 GC 풍부 영역의 PCR 효율을 향상시키기 위해 PCR 증폭 과정을 설정한다. 또한, 시퀀싱 후, 각각의 샘플이 유일하게 매핑 적어도 20 개 이상의 백만 게놈을 읽고 있는지 확인하는 것이 필수적이다. 이 범위는 전체 게놈 (12)을 매핑하는 데 충분한 깊이 농축 또는 시퀀스를 제공 할 것으로 예상된다. 이 범위가 부분에서 그 샘플에 대한 특정 샘플에 대한 염기 서열의 첫 라운드 더 많은 DNA 동안 충족되지 않으면 하나를 사용할 수, 두 번째 부분에서 시퀀싱의 또 다른 라운드를 실행할 수 있습니다. 결과는 연구와 병합 할 수 있습니다 읽기첫 라운드에서 EADS는 커버리지를 달성했다. 전체 실험은 복사 번호 변이 15와 같은 요인에 기초하여 바이어스를 고려하여 일부 생물학적 제어 (예를 들어, 정상 조직)을 포함하도록 설계되어야한다. 환자 샘플에서 관찰 된 DNA 메틸화를 조사하기 위해 우리의 생물 정보학 접근 방식은 핵심 프로모터의 차동 메틸화 농축, 프로모터 해안 지역과 이들의 다양한 조합을 보여 가능한 표적 유전자를 제공한다. MBDCap-서열은 최대 만 100 bp의 최대 아래로 해상도를 도달 할 수 있다는 사실에도 불구하고, 프로토콜에 기술 된 바와 같이 코어와 해안에이 지역의 구분의 규제 역할의 추가 조사를 위해 잠재적 인 대상 영역을 식별하기 위해 우리를 수 메틸화 부화 차동와 미래 기전 연구를 실시하고 있습니다. 여기에서 우리는 또한 차동 농축 개요를 제공 플롯 토네이도 식별하여 이들 영역을 가시화하는 방법을 설명패턴. 가 탈 아미 노화를 통해 이황화 나트륨에 의해 우라실로 메틸화 된 시토신의 화성을 기반으로하는 다른 기술은, 단일 염기 해상도 DNA 메틸화의보다 광범위한 커버리지를 제공한다. 보통 이황화 변환 한 후, DNA는 목표 기반 실험 또는 순서 이황화 전체 게놈 샷건 (BS-SEQ)에 의해 pyrosequencing을 이용하여 염기 서열됩니다. 이들 기술은 100 염기쌍까지 가장 해상도를 달성 할 수 MBDCap-SEQ 여기 기재된 기술의 한계를 다룬다. 이러한 접근은보다 포괄적 임에도 불구 그러나 이들은 비교적 고가이며, 지수 시퀀스의 깊이 또는 환자의 수와 비용이 증가 높일 수있다. 한편, 일반적으로 사용되는 마이크로 어레이 이황화 플랫폼은 비용 효과적이지만 프로브 유전자 프로모터보다는 전체 게놈에 가까운 영역을 조사 비교적 낮은 커버리지를 제공한다. MBDCap-SEQ 그러나, 제공이러한 높은 비용 시퀀싱 기술과 저가의 메틸화 어레이 (16) 사이의 균형. 우리는 암 Methylome 시스템 프로젝트 (10)의 일부로서, 환자 집단의 다수의 DNA 메틸화를 조사하기 위해,이 프로토콜을 사용하는 큰 환자 집단을 포함하는 장래의 연구에 사용될 수있다.

DNA 메틸화를 통해 유전자의 후생 유전 학적 조절은 본체 (1)의 서로 다른 조직 유형의 안정에 의해 분화 세포의 운명을 결정하기 위해 필요한 필수 메커니즘이다. 이 과정의 이상 조절이 암을 비롯한 다양한 질환을 일으키는 것으로 알려져있다. 이 프로세스는 주로 DNA (3)의 CpG 디 뉴클레오티드의 시토신 잔기에 메틸기의 첨가를 포함한다. 현재 많은 연구 2-8에서 설명한 바와 같이 각각 자신의 장점을 갖는 이러한 메카니즘을 조사하기 위해 사용되는 몇 가지 방법이있다. 여기에서 우리는 우리가 DNA의 메틸화 지역을 식별하는 친 화성 농축 기술을 사용 (MBDCap-SEQ) 메틸 바인딩 DNA 캡처 순서라는 이러한 기술 중 하나를 설명합니다. 이 기술은 메틸화 된 CpG 부위를 함유하는 게놈 DNA 단편에 대한 농축하는 MBD2 단백질 메틸 결합능에 만든다. 우리는 상업 메틸화 된 DNA 농축 키트를 활용이러한 메틸화 영역의 분리를위한. 우리의 실험은이 기술을 사용하여 환자 샘플 수백 스크리닝하고 여기 큰 환자 집단을 조사하는데 사용될 수있는 최적화 된 광범위한 프로토콜을 제공한다. 모든 차세대 시퀀싱 기술 명백한 바와 같이, MBDCap-SEQ 또한 정확하게 샘플 통해 메틸화의 수준을 정량화하기 위해 특정 바이오 인포 매틱스 방법을 필요로한다. 시퀀스 데이터 (9), (10)의 정규화 및 분석 프로세스를 최적화하기 위해 많은 최근의 연구가 있었다. LONUT - - 환자 샘플의 다수에 걸쳐 편향 비교를 가능하게하기 위해, 각 샘플의 선형 정규화 뒤에이 프로토콜에서는 고유 판독 복구 방식을 구현하는 방법 중 하나를 보여준다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methylminer DNA enrichment Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ME10025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112-05D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus Sonication Device</td>
			<td>diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIworks Fragment Library System I</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A50100</td>
			<td>Fully automated library construction system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Primers</td>
			<td>Bioo Scientific</td>
			<td>514104</td>
			<td>PCR primer mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Fluorometric Quantitation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix</td>
			<td>KAPA scientific</td>
			<td>KK2621</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

메틸화 다른 조직 유형의 안정 발생과 분화에 필요한 유전자의 정확한 조절을 담당하는 DNA에 필수적인 후생 변형 중 하나이다. 이 과정의 이상 조절은 종종 암과 같은 다양한 질환의 특징이다. 여기서, 우리는 최근 시퀀싱 기술을 간략 메틸 - 바인딩 많은 환자 집단에 대한 다양한 정상 및 질병 조직에 메틸화를 정량화하는 데 사용되는 캡쳐 DNA 시퀀싱 (MBDCap-SEQ)를. 우리는 최적의 정량화를 달성하기 위해 생물 정보학 파이프 라인과 함께이 친 화성 농축 방법의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 1000 methylome 프로젝트 (암 Methylome 시스템)의 일부로서 다양한 종류의 암 환자에 걸쳐 수백 시퀀스 사용되고있다.

우리는 그 중에서도 유방 12, 13, 자궁 내막, 전립선 (14), 및 간암 등 다양한 종류의 암 환자에서 다수의 DNA 메틸화 변화를 연구 MBDCap - 배열을 사용했다. 여기에서 우리는 최근에 12 게시 된 유방암 연구에서 몇 가지 정보를 보여줍니다. 이 예에서, 우리는 다른 차등 게놈 영역에 걸쳐 정상에 대해 종양 메틸화 된 CpG 섬을 식별 총 유전체 방식을 사용 하였다. 조사는 개 가운데 유전자 프로모터 (N = 13,081)에 위치 된 CpG 섬을 조사 19.5 %가 정상에 비해 종양에서 차동 메틸화를 보였다 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 6959 유전자 내의 CpG 섬에서, 55.2 %는 차동 메틸화를 보였다. 유전자 간 발기인 4847의와의 CpG 섬이없는 유전자 프로모터에 대해 28.1 %를 보여, 5454 조사 지역의 1.8 % 차동 DNA 메틸화 (그림 1A)을 보여 주었다. 시각적 표현(그림 1B)는 위에서 언급 한 지역의 대표적인 예를 보여줍니다. 히트 맵 분명히 77 유방 종양 정상적인 유방 조직 10, 38 유방암 세포주 걸쳐 메틸화 된 영역을 나타낸다. 이 원고에 설명 된 생물 정보학 프로토콜에서 논의 메틸화의 정량은 전체 인구 또는 하위 집단에서 상당한 메틸화의 차이를 식별하기 위해 이러한 환자 샘플을 통해 다양한 통계 테스트를 수행하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 이 분석 방법은 더이 환자 샘플에서 후생 유전 학적 메커니즘을 조사하기 위해 검증 대상으로 우리를 제공합니다. 이러한 타겟이 식별되면, 메틸화의 수준은 상기 정량화 pyrosequencing를 사용하여 검증 할 수있다. 대상 200 bp의 - MBDCap-서열은 약 100의 게놈 해상도를 제공합니다. 더 해상도를 얻으려면,이 지역 내에서 개인의 CpG 위치는 정량을 pyrosequencing 선택할 수 있습니다. 우리는 콴이 방법을 사용tify 더 큰 해상도와 개별 환자 그룹 간의 비교를 위해 MBDCap - 서열 데이터에서 관찰 된 메틸화의 차이를 확인합니다. 하위 그룹이 2 자궁 내막 암에서의 메틸화의 정량화를 보여줍니다 nonrecurrent (NR) 재발 (R)에 비해. 그림은 확인 된 표적 유전자의 SFRP1의 프로모터의 CpG 섬 다른의 CpG 사이트에서이 그룹의 각 환자의 DNA 메틸화 수준을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54131/54131fig1.jpg" /> 그림 1. 프로모터 및 비 프로모터의 CpG 아일랜드 정상적인 유방 조직에 비해 유방암 샘플 DNA 메틸화 메틸 캡처 시퀀싱 (MBD-SEQ)는 유방 종양의 게놈의 DNA 메틸화 정보를 생성하는 데 사용되는 (N = 77) 및 한 정상적인 유방 조직 (N = 10). (A) 파이전자 차트는 차동 프로모터, 유전자 내에서 메틸화 및 유전자 간 CGI를뿐만 아니라 비 CGI 프로모터 영역을 보여줍니다. (B) 예 프로모터 CGI, 유전자 내, 유전자 간, 비 CGI 프로모터 영역을 나타내는 궤적. 점선 사각형이 유방암과 메틸화에 해당하는 영역을 강조 표시합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54131/54131fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54131/54131fig2.jpg" /> 그림 2 :. 식별 된 표적 유전자의 CpG 사이트의 pyrosequencing을 사용하여 DNA 메틸화 pyrosequencing에 의해 검출 재발 및 비 재발 성 자궁 내막 암 환자에서 SFRP 5 프로모터 영역의 DNA 메틸화의 정량화. 각 사이트는 하나의 CpG 사이트 나타낸다 (R : 재발을, N = 21, NR : 비 재발, N = 71). 플롯은 보여평균 및 오류 막대는 평균 또는 SEM의 표준 오차를 표시합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54131/54131fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

methyl-binding-dna-capture-sequencing-for-patient-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.5K 조회수.  University of Texas Health Science Center at San Antonio.  여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다. 

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

연구

유전학

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...