DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略

大規模なオミックス技術は、肥満に焦点を当てた研究でますます使用されています。エピジェネティクスは、曝露と健康転帰との間のリンクであり得る。このタイプのスタディでは、膨大な量のデータが生成されます。

このため、データを技術的に比較可能にするためにプロトコルを標準化することが重要です。本研究では、DNAメチル化データを取得・解析するためのパイプラインを提案します。同じプロトコルを400Kバージョンとエピックバージョンの両方に適用できます。

1日目:亜硫酸水素塩治療。ゲノムDNAを変性させることから始めて、次に変換試薬を加える。キットの推奨事項に従う必要があります。

変性DNAをビスリン酸で処理する。その後、サンプルをサーマルサイクラーでインキュベートします。洗浄バッファーを用いて洗浄工程を行う。

2日目:メチル化アッセイに続く増幅、手動プロトコール。ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏37度で予熱し、温度を平衡化させる。20マイクロリットルのMA1をプレートのウェルに分散させる。

4マイクロリットルのDNAをプレート上の対応するウェルに移す。4マイクロリットルの水酸化ナトリウム溶液をプレートウェルに分散させる。プレートをプラスチックシールでシールします。

プレートを渦巻き、試薬とサンプルを混合します。室温で10分間インキュベートする。68マイクロリットルのRPMを各ウェルに分散させ、次いで、以前の溶液を除去することなく75マイクロリットルのMSMを分散させる。

プレートを覆うために新しいシールを使用してください。プレートを1分間渦巻きます。ハイブリダイゼーションオーブン中で、摂氏37度で20〜24時間インキュベートする。

3日目:メチル化アッセイに続くハイブリダイゼーション、手動プロトコール。プレートを摂氏 37 度に挿入してブロックを予熱します。プレートをハイブリダイゼーションオーブンから慎重に取り出します。

プレートをパルス遠心分離機で遠心分離します。プレートからシールを外します。各サンプル容器に50マイクロリットルのFMSを加える。

プレートを1分間渦巻きます。プレートに必要な遠心分離機。その後、密閉板を37°Cの加熱ブロック上に1時間置きます。

サンプルを含む各ウェルに100マイクロリットルのPM1を加える。プレートをもう一度封印します。プレートを1分間渦巻きます。

摂氏37度で5分間インキュベートする。次いで、遠心分離機中で1分間パルスし、次いで、300マイクロリットルの100%2−プロパノールをサンプルと共に各ウェルに加える。プレートをもう一度封印します。

プレートを少なくとも10回反転させてすべての内容物を混ぜる。摂氏4度で30分間インキュベートし、次に摂氏4度で20分間遠心分離します。プレートからシールを外します。

プレートを適切な場所に素早く反転させ、上清を捨てる。すべての井戸に液体がないことに気付くまで、数回しっかりとタップします。室温で、プレートを逆さまにして1時間覆い隠します。

すべての液体を乾燥させた後、井戸の底に青いパレットを見る必要があります。その後、各ウェルに46マイクロリットルのRA1を加える。ヒートシールをプレートに塗布します。

しっかりと保持して、シーリングを均等に実行します。プレートを摂氏48度のハイブリダイゼーションオーブンに1時間入れ、その後ボルテックスを1分間置いた。遠心分離機でパルスし、プレートを摂氏95度で1時間加熱する。

ビーズチップハイブチャンバーを一緒に準備します。この次のステップでは、400マイクロリットルのPB2をHybチャンバー内のリザーバに分散させます。HybチャンバーのリザーバをPB2で満たした後、すぐに蓋をします。

プレートからマイクロアレイのサンプルエントリに各サンプルを慎重にロードします。マイクロアレイを含むHybチャンバーインサートをHybチャンバーにロードします。ハイブチャンバーを横方向に閉じて、ハイブチャンバーがずれないようにします。

4日目:メチル化アッセイに続く染色、手動プロトコール。夜間インキュベーション後、インサートからすべてのマイクロアレイを除去する。マイクロアレイをゆっくりと軽く、合計10回、上下に洗浄する。

マイクロアレイをPB1容器番号2に移動し、上下に10回繰り返す。フローチャンバーのフレームを正しい位置に配置し、次に各マイクロアレイを配置します。それぞれの上部に透明なスペーサーを使用します。

位置合わせバーは、位置合わせアクセサリに配置する必要があります。ガラス製のバックプレートをスペーサーの上に配置する必要があります。次に、フローチャンバに金属クランプを取り付けます。

はさみを使用して、フローチャンバースペーサーの端をトリミングします。マイクロアレイ付きのフローチャンバーをチャンバーラックに入れます。RA1のピペット150マイクロリットル。

30分間インキュベートし、5回繰り返す。450マイクロリットルのXC1をピペットで、10分間インキュベートした。450マイクロリットルのXC2をピペットに入れ、10分間インキュベートした。

TEMのピペット200マイクロリットル。15分間インキュベートする。95%ホルムアミドのピペット450マイクロリットル。

1分間インキュベートし、2回繰り返す。5分間インキュベートする。XC3のピペット450マイクロリットル。

1分間インキュベートして繰り返します。このステップでは、以下の試薬、250マイクロリットルのSTM、450マイクロリットルのXC3、および250マイクロリットルのATMを分注する。次の繰り返しスキームを実行します。

すべての繰り返しとインキュベーションの後、マイクロアレイをスタンディングラックに置き、洗浄容器に浸します。上下の動きでゆっくりと軽く動く、10回。真空デシケーターを使用してマイクロアレイを50~55分間乾燥させます。

マイクロアレイが乾燥したら、スキャンでマイクロアレイのイメージングに進みます。この画像では、参加者の選択からメチル化実験の最終日に取得したIDATファイルの処理まで、使用されているすべてのプロトコルを見ることができます。ファイルは、バイオインフォマティクス分析が実行されたコンピュータに転送された。

分析は、R StudioおよびバイオコンダクターChAMPパッケージを使用して処理した。コンピュータに少なくとも8ギガバイトのRAMがあることを確認してください。遺伝子濃縮などの他のバイオインフォマティクス解析は、データを読者により良く提示するために実施された。

この表では、この研究で使用された2つのグループ、肥満と非肥満を観察することができます。変数、ボディマス指数、腹囲、キログラム単位の脂肪量、およびパーセント単位の脂肪量のグループ間に差があった。この図に示されているスキームを観察して、提案されたプロトコルがデータに適切であることを理解することができました。

そしてバイオインフォマティクス分析の後、フィルターが実行された後、合計409、887個のプローブが提示された。密度プロットは、すべてのサンプルがベータ分布の密度が類似していることを明らかにしました。これらの分析に基づいて除外されたサンプルはなかった。

正規化されたデータの特異値分解解析により、BMI、ダブルC、およびFMがDNAメチル化データの変動性に有意に影響することが明らかになった。細胞型推定により、ナチュラルキラー細胞、NK細胞、B細胞の両方が肥満女性で高いことが明らかになった。肥満女性と非肥満女性との間のDNAメチル化レベルは、細胞型補正の前後で異なっていた。

補正前に、43、463の異なるメチル化位置が観察された。その後も、3,329のCPGが有意に残った。合計162個のCPGが低メチル化され、576個が非肥満と比較して肥満において高メチル化されていた。

データは、登録コードGSE166611の下でGEOデータベースで利用可能です。我々は、SVDで観察された参加者の特定の特性と関連していたCPGサイトを提示する。脂肪量については、13、222のCPGサイトが見つかった。

プロモーター領域には6,159個の脂肪量関連CPGがあった。470は低メチル化され、94は高メチル化される。関連部位のそれぞれの遺伝子が富化され、現在示されている。

私たちは、提案されたプロトコルがあなたのメチル化パターン内を識別することができ、あなたのメチル化内に関連することは正しいことを観察しました。我々の結果は、肥満のライフスタイルがヒトDNAのエピジェネティックな変化を促進することができることを確認しています。