Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

우리는 공초점 현미경 검사에 도움을 주신 Christine Holt와 Bill Harris에게 감사드립니다. 형광 타이머 백본 구축물에 대한 대런 길모어와 Tol2-Lyz 백본 벡터에 대한 Anna Huttenlocher에게 감사드립니다. Tg(mpx:GFP)i114 라인에 대해 Steve Renshaw에게 감사드립니다. 이 작업은 MRC (MR / L019523 / 1), Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i]와 아이작 뉴턴 트러스트 보조금 19.23 (n). C.C.는 MRC DTP 학생회와 Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금. H.W.는 MRC DTP Studentship의 지원을 받았습니다. H.P.는 Wellcome Trust PhD 보조금 (105391 / Z / 14 / Z)과 Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]의 지원을 받았습니다. 아이작 뉴턴 트러스트 [12.21 (a)i] 보조금과 MRC (MR / L019523 / 1).

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

기술된 방법은 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 계내에서 내인성 리간드에 반응하는 수용체 역학의 살아있는 이미징을 허용한다. Cxcr1/Cxcr2 호 중구 리포터의 사용은 감염, 종양 모델 또는 다른 유형의 조직 손상(14,25,26,27)과 같은 다른 생리학적 설정으로 확장될 수 있다. 또한, 내인성 수용체가 외인성 돌연변이 수용체에 의해 억제되고 구출되는 트랜스제닉 구조 라인은 면역 반응에서 특정 호중구 이동 패턴의 중요성을 해부하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있다. 예를 들어, 탈감작 장애를 갖는 Cxcr1 수용체 돌연변이체는 염증 부위(14)에서 더욱 두드러진 호중구 클러스터링을 야기한다. 이러한 기능 표현형의 이득은 상이한 생리학적 과정들, 예를 들어, 상처 복구, 감염성 질환 또는 종양 진화, 및 보체 수용체 녹다운/녹아웃 실험에서 호중구 회중의 역할을 이해하는데 사용될 수 있다. 이 방법론은 또한 사용 가능한 기자의 범위를 확대 할 수있는 기반을 제공합니다. 형광 리포터의 선택은 고려해야 할 중요한 것이며 생물학적 질문에 달려 있습니다. 우리는 호중구에서 이러한 케모카인 수용체의 구성 회전율이 상피 세포와 비교하여 높았으며 빠른 성숙 (예 : sfGFP)을 가진 기자가 정상 상태에서 막 수준을보고하고 호중구 자극시 차이를 해결해야한다는 것을 발견했습니다 8,14. 따라서, sfGFP/tagRFP의 막 비율은 이 세포 유형에서 리간드-유도된 내재화를 측정하는 데는 적용되지 않지만, tagRFP의 패턴은 수용체의 세포내 운명의 추적을 허용하며, 이는 일부 연구에서 유용할 수 있다. 우리는 또한 tagRFP의 더 집중된 세포 내 신호가 개별 유충을 스크리닝하는 데 유용하다는 것을 발견했습니다. 원형질막에서 수용체 수준을 측정하기 위한 대안적인 접근법은 동일한 전이유전자(9) 또는 독립적인 전이유전자(14)에서 호중구에서 형광막 마커를 공동발현시키는 것이다. 이전의 시나리오에서, 전이유전자는 물고기를 스크리닝하기 위한 추가적인 수단을 제공할 것이고, 발현 수준은 마커와 수용체 사이에서 필적할 것이다. 후자의 접근법은 수용체 리포터가있는 제브라 피쉬 라인이 다른 리포터 라인과 결합 될 수 있다는 점에서 더 모듈화 될 것입니다. 두 경우 모두 수용체 수준의 막 정량화가 군집형 호중구에서 어렵다는 점은 주목할 가치가 있습니다 (아래 참조). 마지막으로, 우리는이 프로토콜의 가능한 확장은보다 상세한 국소화 분석을 위해 면역 조직 화학에 의한 라이브 이미징을 후속 조치하는 것입니다.
Tol2 형질생성 시스템은 잘 확립되어 있고7 라이소자임 C 프로모터는 호중구 발현11,15를 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 따라서, 트랜스제네시스 접근법은, 비교적 간단하고, 이러한 프로모터로 달성된 발현 수준은 수용체 역학의 분석을 위한 충분한 콘트라스트를 제공하기에 충분히 높다. 가능한 제한은 발현 수준이 내인성 수용체 발현 수준을 재구하지 않는다는 것이다. 새로운 CRISPR 기술은 특정 관심의 수용체에 대한 녹인 라인을 확립하기 위해 배치될 수 있다(28). 이러한 기술은 여전히 번거롭고 세포 내 이미징에 필요한 발현 수준을 보장하지는 않지만 성공적인 개발은 내인성 신호 역학을 이해하는 데 중요한 돌파구가 될 것입니다. 기능적 검증은 트랜스제닉 수용체 구축물을 사용한 데이터를 해석하는데 중요하다. 예를 들어, 리간드 인식 분석은 형광 융합 단백질이 기능적이라는 것을 확립하는데 사용될 수 있고, 넉아웃 표현형을 구하고, 트랜스제닉 호중구 발현 수준이 기능성14와 양립가능하다는 것을 확립하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 수용체 융합을 검증하는 보다 직접적인 방법은 표지되지 않은 버전14와 함께 표지된 수용체를 갖는 시험관내 기능적 검정을 이용하는 것이다.
정량화 접근법은 생체 내에서 호중구에서 정확한 막 세분화의 특정 어려움을 해결합니다. 상피 성질의 세포에서, 수용체 수준의 정량화는 막 수용체 수준을 조절 마커로 정상화함으로써 자동으로 실행될 수 있으며, 이는 병렬로 또는 개별적으로 발현될 수 있다9. 실제로, 우리는 가스트레이션 배아14에서 리간드-인식 검정을 사용할 때 그러한 접근법을 적용하였다. 그러나 호중구는 생체 내에서 세포 모양의 복잡하고 급격한 변화를 겪어 2D 및 3D14에서 막 세분화를 어렵게 만듭니다. 이것은 호중구 군집이 많은 생리적 환경29에서 발생하는 경우 훨씬 더 도전적입니다. 대조 메트릭은 막 세분화를 필요로하지 않고 대신 세포에서 수용체 분포의 전체 상태 (막성 / 부드러운 대 수포 / 도티)를 반영하기 때문에이 제한을 극복합니다. 콘트라스트 메트릭은 이미지의 전체 대비에 의해 영향을 받을 수 있으므로 서로 다른 배아/샘플에서 신호의 변동성을 설명하기 위해서는 개별 세포 값을 내부 참조로 정규화해야 합니다. 예를 들어, 우리는 CHT에서 반응하지 않는 호중구의 평균 세포 대조 값 (즉, 정지되어 있고 복부 지느러미로 이동하지 않는 호중구)14를 사용했습니다. 추가적인 가능성은 동일한 세포에서 대조 마커의 대조 값으로 정규화하는 것이다. 이것은 무반응 세포의 내부 참조가 이용 가능하지 않을 때 해결책을 제공 할 것이고, 다른 조건 사이의 수용체 역학의 미세한 정량적 차이를 해결할 수 있습니다.
이미징의 위치는 고려해야 할 또 다른 변수입니다. 더 일반적으로 사용되는 꼬리 지느러미 상처 모델16,30과는 달리 복부 지느러미 상처를 여기에서 선택하는 이유는 상처 부위가 호중구 거주지 / 철새 기원 부위 근처에 있기 때문입니다. 이것은 호중구가 도착하는 데 상대적으로 적은 시간이 걸리기 때문에 분석의 타임 라인을 가속화합니다. 추가적으로, 그것은 이동 기원 (CHT) 및 관심의 표적 위치 (상처) 둘 다에서 세포 거동을 포착할 수 있는 기회를 제공한다. 이는 세포하 영상화에 필요한 공간적 및 시간적 분해능이 넓은 시야각 또는 다중 위치 스캐닝과 결합하기 어렵기 때문에 여기에서 관련이 있다. 따라서, 복부 지느러미 상처 분석은 이동 기원으로부터의 이주 반응의 진화를 추적하고 반응하지 않는 세포에서 비특이적 수용체 변동을 동시에 포착하는 것을 허용한다. 위에서 언급했듯이, 후자는 불특정 역학에 대한 내부 참조를 제공하기 때문에 정량화 목적으로 유용합니다. 다른 시스템에서, 이러한 내부 참조를 갖는 것이 불가능할 수 있으며, 이 경우 공동-발현된 막 마커의 콘트라스트 값은 대안적인 제어를 제공할 것이다.
요약하면, 우리는 방법론이 다른 시스템에 적용 가능하고 다양한 목적으로 배포 될 수 있다고 예상합니다. 예를 들어, 동일한 리포터가 감염 설정 또는 다른 질병 모델과 같은 다른 염증 설정에서 활용될 수 있다. 제브라피쉬 수용체 리포터 라인의 레퍼토리는 다른 신호전달 수용체로 확장될 수 있고, 신호전달 메카니즘을 이해하거나 생체내에서 리간드 역학을 보고할 수 있다. 이 접근법은 녹다운/녹아웃 기술과 결합하여 관찰된 역학의 기계론적 기초를 조사할 수 있다. 예를 들어, 리간드 발현의 섭동은 관찰된 수용체 역학에 대한 리간드 의존성을 나타낼 수 있다. 앞으로는 기자의 녹인 삽입을 통합하기 위해 시스템을 더욱 정교하게 만들 수 있을 것으로 예상합니다. 궁극적으로,이 방법론을 사용한 발견은 포유류에서 이러한 신호 수용체의 보존과 더 큰 유기체에서 이러한 연구를 수행하는 상대적 도전을 감안할 때 제브라 피쉬 공동체를 넘어서는 가치있는 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.

백혈구 이동은 면역 반응에 가장 중요합니다. 면역 세포는 원형 철새 세포로, 조직과 혈관을 횡단하고 미생물 또는 기타 중요한 숙주 세포쪽으로 방향으로 이동하기위한 다양한 화학적 안내 신호를 감지 할 수 있습니다. 올바른 지침은 화학 유인 물질의 인식에 의존하며, 그 중 케모카인은 가장 두드러진 범주1을 나타냅니다. 케모카인은 고도로 특이적인 일곱 막횡단 G 단백질 결합 수용체에 의해 인식된다. 케모카인 결합시, 케모카인 수용체는 형태 변화를 일으켜 연관된 삼량체 G 단백질의 활성화와 세포골격 변화 및 지시된 이동을 촉진하는 기능적 신호전달 서브유닛으로의 해리를 유도한다1. 이차적으로, 케모카인 수용체는 인산화되고, 이러한 변형은 유인제에 대한 탈감작으로 이어지고, 이는 신속한 재감작/재활용 또는 세포내 분해 및 세포 표면으로부터의 하향 조절(down-regulation 2)에 뒤따를 수 있다. 이러한 수용체 역학은 세포에 의해 수신되는 신호전달의 지속 기간 및 용량에 영향을 미치지만, 이들이 백혈구 이동 거동에 어떻게 영향을 미치는지 생체내에서 밝히기가 어려웠다.
전통적인 포유류 시스템에서 살아있는 백혈구에서 수용체 역학을 추적하는 것은 몇 가지 도전에 직면 해 있습니다. 살아있는 연구를 위해, 형광 단백질과의 수용체 융합은 세포에서 발현되어야 한다. 이것은 원발성 백혈구, 특히 호중구에서 도전적이며, 지금까지의 연구는 케모카인 수용체 3,4를 발현하기 위해 대리 호중구 세포주를 사용했다. 백혈구가 유익한 인신 매매 결함 5,6을 갖는 형광 수용체 또는 돌연변이 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델의 생성은 상당한 시간과 자원의 투자를 수반한다. 이러한 경우에도, 살아있는 동물에서 수용체 역학을 영상화하기 위한 이미징 해상도 및 콘트라스트는 제한될 수 있고, 연구는 고정된 조직 절편(5)에 대한 면역조직화학을 이용하였다. 이러한 기술적 과제를 감안할 때, 화학 유인 수용체 역학이 살아있는 조직 환경에서 세포 거동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해는 현재 제한적입니다.
여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 수용체 밀매를 모니터링하는 방법론을 제공합니다. 제브라피쉬는 생쥐처럼 유전적으로 다루기 쉽지만, 효율적인 트랜스포존 시스템과 직접 접합체 조작을 통해 트랜스제네시스가 비교적 더 간단하다7. 투명한 유충은 이상적으로 이미징에 복종 할 수 있습니다. 케모카인 수용체 역학은 형광 리포터 8,9,10과의 상응하는 융합체의 발현에 의해 원시성 생식 세포 및 측선 프리모듐에서 시각화되었다. Zebrafish 유충은 포유류 호중구와 관련하여 유전 적 및 세포 특성을 고도로 보존 한 성숙한 호중구를 갖추고 있습니다. 세포골격 역학 및 극성 조절제와 같은 세포하 신호전달 역학은 상응하는 트랜스제닉 라인(11,12,13)의 생성에 의해 이들 세포에서 시각화되었다. 최근에, 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응의 과정 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학을 시각화하고 기능적으로 분석하였다14. 여기에서는 호중구에서 케모카인 신호전달을 위한 형질전환 리포터 라인의 생성, 라이브 이미징을 위한 배아의 준비, 호중구 신호전달을 연구하기 위한 상처 분석 및 이미지의 획득 및 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 또한 후보 리간드에 대한 케모카인 수용체 반응을 시험하기 위한 사이드 프로토콜을 제공하며, 이는 특징이 없는 수용체에서 리간드 인식 패턴을 확립하려고 할 때 유용하다. 이들 기술은 내인성 케모카인 발현의 억제 또는 변경된 리간드-유도된 인신매매를 갖는 돌연변이 수용체의 생성과 같은 추가의 유전자 조작과 조합하여, 특정 신호전달 역학이 생체내에서 백혈구 거동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 사용될 수 있다. 형광 태깅된 케모카인 수용체를 발현하는 트랜스제닉 라인은 또한 내인성 케모카인 구배에 대한 리포터로서 사용될 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 직접 항체 염색에 의해 검출하기 어렵다. 기술된 방법론은 리포터의 생성을 다른 면역-신호전달 수용체로 확장시키기 위한 범위를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark capillary glass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom microwell dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small paintbrush</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

화학적 구배에 의한 백혈구 안내는 면역 반응에 필수적입니다. 호중구는 중요한 항균 기능을 수행하는 조직 손상 부위에 모집 된 최초의 세포입니다. 이 유전자좌로의 밀매는 케모카인을 포함한 여러 염증성 화학 유인제에 의해 조정됩니다. 분자 수준에서, 화학유인제 신호전달은 상응하는 수용체의 세포내 밀매에 의해 조절된다. 그러나 케모카인 수용체의 세포 내 변화가 세포 및 조직 수준에서 백혈구 이동 역학에 어떻게 영향을 미치는지는 분명하지 않습니다. 여기서 우리는 조직 손상에 대한 염증 반응 동안 호중구에서 케모카인 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량 분석을위한 방법론을 설명합니다. 이러한 도구는 제브라피쉬 호중구에서의 차등 케모카인 수용체 밀매가 조직 손상 부위에서 호중구 군집화 및 분산을 조정한다는 것을 밝혀냈다. 이것은 염증 반응이 어떻게 스스로 해결되는지에 대한 우리의 이해에 영향을 미칩니다. 기술된 도구들은 다양한 생리학적 및 병리학적 설정들에서 호중구 이동 패턴을 이해하는데 사용될 수 있고, 방법론은 다른 신호전달 수용체들로 확장될 수 있다.

복부 지느러미 상처는 CHT에서 복부 지느러미로 급속 호중구 동원 및 30-60 분 이내에 상처 마진에서 군집화됩니다 (그림 1). 우리는 제브라피쉬 호중구 24에 의해 발현되는 두 개의 케모카인 수용체인 Cxcr1 및 Cxcr2의 분포를 시각화하고 스핀 디스크 공초점 현미경을 사용하여 Cxcl8a 및 Cxcl8b14를 인식합니다. 우리는 두 개의 상응하는 트랜스제닉 라인, Tg(lyz:Cxcr1-FT) 및 Tg(lyz:Cxcr2-FT)를 생성했는데, 여기서 호중구는 수용체의 형광 타이머(FT) 구축물, 즉 sfGFP 및 tagRFP의 탠덤과의 융합을 발현한다(도 2 및 참조14). 두 형광단의 사용은 광범위한 수용체 운명을 모니터링하고 원형질막에서의 단백질 턴오버 시간의 추정치를 제공하기위한 것이었으며, 새로 합성 된 수용체는 녹색으로 형광을 띠고 8,14 세가되면 점진적으로 적색이됩니다. 그러나, 이들 수용체는 호중구 원형질막에서 빠른 구성적 턴오버를 가지며 체류 시간이 tagRFP의 성숙 시간보다 짧았고, sfGFP는 막 국소화를 나타내고 tagRFP는 정상 상태에서 수포 국소화를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (보충 비디오 1 및 참조14). 따라서, 우리는 조직 손상 부위에서 리간드-유도된 내재화를 모니터링하기 위해 sfGFP의 분포에 초점을 맞추었다. 수용체 분포의 패턴은 이웃 픽셀들 사이의 강도의 차이를 보고하는 콘트라스트 메트릭을 사용하여 정량화되었다. 그 근거는 수용체 분포가 막강하고 매끄럽게 될 때 대조 값이 낮다는 것입니다. 수용체 분포가 수포성이고 더 많은 구멍을 뚫으면 명암비가 높습니다 (그림 3).
대안적인 방법은 대조군 막 마커, 예를 들어 막 CFP(mCFP)의 수준에 대한 수용체 수준(sfGFP 강도)의 비율을 정량화하는 것이다(도 3). 두 방법 모두 세포에서 전세계적으로 더 많은 수포 수용체 분포 패턴 (더 높은 명암치) 또는 막에서의 낮은 수용체 수준 (더 낮은 sfGFP / mCFP 비율)에 의해 나타나는 것처럼 수용체 내재화를 감지 할 수 있습니다. 그러나, 콘트라스트 메트릭은 또한 상처에서 호중구 클러스터에서 수용체 내재화를 검출할 수 있었는데, 여기서 막 분할은 덜 정확했고 적용 가능하지 않았다(그림 3). 이 메트릭을 사용하여 상처에서 호중구에서 Cxcr1과 Cxcr2 밀매의 가시적 인 차이를 정량화 할 수있었습니다 (그림 4 및 보충 비디오 2). Cxcr1-FT는 상처에 위치한 세포에 내재화되는 반면, Cxcr2-FT는 상처에서 호중구에서 막강한 상태로 남아있었습니다 (그림 4A-C, 보충 비디오 2 및 보충 비디오 3). 모르폴리노 치료를 통해 Cxcl8a 및 Cxcl8b의 억제는 상처에서 Cxcr1-FT 내재화에 차별적으로 영향을 미쳤다 (그림 4C, D). Cxcr1-FT가 Cxcl8a에 반응하는지 더 검증하기 위해, 우리는 초기 배아에서 케모카인 반응 분석을 수행했습니다. 우리는 Cxcr1-FT가 Cxcl8a가 공동 발현된 배아에서 현저하게 내재화된다는 것을 발견했다(도 5). 전체적으로 이들 결과는 호중구에서 케모카인 유도된 수용체 내재화를 측정하고 이들 효과를 매개하는 리간드의 동일성을 확립하기 위해 기술된 방법이 전개될 수 있음을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> 그림 1: 복부 지느러미 상처로의 호중구 이동. (A) (왼쪽) 꼬리 조혈 조직 (CHT), 금성 순환 (VC, 파란색), 복부 지느러미 (VF) 및 상처 부위의 위치를 보여주는 3 dpf 유충의 만화. (오른쪽) 호중구가 CHT에서 동원되어 상처에서 군집하는 상처 (W)의 영역을 묘사하는 만화. CHT 조직의 꼬리 정맥 신경총 (CVP)은 파란색으로 그려집니다. (B) 밝은 필드 이미지 (왼쪽) 및 공초점 투영 (오른쪽)은 상처 후 2 시간에서 Tg (mpx : GFP) 유충에서 복부 지느러미 상처와 호중구의 분포를 보여줍니다. 파선은 VF 및 CHT 윤곽선을 표시합니다. 스케일 바 = 25 μm. 만화 및 형광 이미지는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> 그림 2: 호중구에서 케모카인 수용체 밀매의 라이브 이미징. (a) Cxcr1-FT (형광 타이머) 및 Cxcr2-FT의 호중구 특이적 트랜스제닉 발현에 사용되는 작제물. 3 dpf 트랜스제닉 유충의 머리에서 호중구의 공초점 돌기 (Tg(lyz:Cxcr1-FT), 상단; Tg(lyz:Cxcr2-FT), 하단)는 tRFP(마젠타) 및 sfGFP(녹색) 채널을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. (B) 도 1A에서와 같이 3 dpf 유충의 해부학적 계획. 유충 아래에는 CHT (상단)에서 동원되거나 복부 지느러미 (하단)에 들어갈 때 화학 주성을 수행하는 호중구가있는 상처 (W)의 면적을 묘사하는 계획이 있습니다. 파선 사각형은 오른쪽의 스냅숏으로 이미지화된 영역을 나타냅니다. (C) CHT (상단 패널) 또는 상처 (하단 패널)쪽으로 화학 주축을 동원 할 때 Tg (lyz : Cxcr1-FT) 유충 (sfGFP가 표시됨)의 호중구. 화살표는 시간이 지남에 따라 동일한 셀을 표시합니다. 오른쪽 이미지의 시간 지점은 왼쪽의 이미지 이후 경과된 시간(분)입니다. 스케일 바 = 10 μm. (D) 케모카인 수용체 밀매의 라이브 이미징을 위한 실험적 접근법의 개략적인 표현. 패널 A-C가 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)로부터 변형되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> 도 3: 수용체 역학의 정량화 예. CHT에서 상처 또는 비동원된 호중구에서 단일(청색) 또는 군집형 호중구(녹색)(적색, 주황색)를 분절하고 결과를 비교하기 위해 상이한 방법에 의해 분석하였다. 표시된 동일한 예제 셀은 이미지에서 보이는 것을 추출된 값의 범위와 관련시키는 두 가지 방법으로 분석되었습니다. (a) 선택된 실시예 셀의 표면은 sfGFP 채널에서의 윤곽선 정의에 기초하여 분절되었다. (B) 콘트라스트는 A. (C)에 나타낸 실시예 세포로부터 계산하였고, 선택된 세포들, 실시예 셀들의 멤브레인은 CFP 채널에서의 등고선 정의에 기초하여 분절되었다. sfGFP/CFP의 비율계량 분석이 뒤따랐다. (D) sfGFP/CFP의 비율은 C. 에러 막대는 개별 세포로부터 S.E..M.를 나타내는 예시 셀에서 계산되었으며, n>1의 경우, 여기의 값들은 통계적 분석에 사용되지 않고 단지 상이한 정량화 방법으로 얻은 측정치를 예시하기 위한 것이다. 스케일 바 = 10 μm. 참조14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> 그림 4: 상처에 대한 반응에서 Cxcr1 및 Cxcr2의 차동 역학. (A) 상처 후 80분에 상처에서 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 또는 Tg(lyz:Cxcr2-FT) 유충에서 호중구의 공초점 투영(sfGFP 채널 표시). 스케일 바 = 10 μm.  (B) 상처에서 확대된 Cxcr1-FT 호중구(왼쪽) 및 Cxcr2-FT(오른쪽). 녹색 수용체는 회색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 5 μm. (C) 정규화된 대조 (CHT에서 동원되지 않은 세포의 평균 대비로 정규화된 개별 호중구 당 대비). cxcl8a는 cxcl8a에 대한 번역 블로킹 모르폴리노와 함께 스플라이스 블로킹의 주입을 지칭한다. cxcl8b는 cxcl8b에 대한 스플라이스 블로킹 모르폴리노를 사용한 주입을 지칭한다. Tg (lyz : Cxcr1-FT)의 경우 : n = 24 세포 (CHT), n = 8 마리의 유충에서 나온 47 세포 (상처). 모르폴리노스를 가진 Tg (lyz:Cxcr1-FT)의 경우: 5마리의 유충에서 n=28 세포(Cxcl8a-MO), 5마리의 유충으로부터 n=16개의 세포(Cxcl8b-MO)가 있다. Tg (lyz : Cxcr2-FT)의 경우 : n = 10 세포 (CHT) 및 n = 20 세포 (상처) 3 마리의 유충. 데이터는 1-5 개의 이미징 세션에서 획득 한 독립적 인 유충으로부터 풀링되었습니다. Tg(lyz:Cxcr1-FT)에 대한 Dunn의 다중 비교 테스트, Tg(lyz:Cxcr2-FT)에 대한 2개의 꼬리 무쌍 Mann-Whitney 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis 테스트. (d) 지느러미 상처에 반응하는 cxcl8a 모르폴리노(MO)(왼쪽) 및 cxcl8b MO(오른쪽)로 처리된 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 형질전환 유충에서 호중구의 공초점 투영(녹색으로 표시된 sfGFP 채널). 동등한 호중구 축적의 시점에서 찍은 스냅 샷 (왼쪽 이미지에서 85 분, 오른쪽 이미지에서 상처 후 45 분). 스케일 바 = 10 μm. 참조14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> 도 5: 초기 배아에서의 케모카인 반응 분석. 레이저-스캐닝 공초점 Cxcr1-FT. Cxcr1-FT mRNA의 발현 및 분포를 나타내는 가스트레이션 배아의 공초점 슬라이스를 150 pg Cxcl8a mRNA가 있거나 없는 150 pg의 세포-단계 난자에 주입하였다. 녹색 및 적색 수용체는 별개의 채널로 표시된다. 대조군 막 CFP 마커 (mCFP)는 시안 채널에 도시되어 있다. 스케일 바 = 20 μm. 참조14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 수정된 그림입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 영화 1: 3 dpf에서 Tg (lyz : Cxcr1-FT) (왼쪽) 및 Tg (lyz : Cxcr2-FT) (오른쪽) 유충의 머리에있는 형질전환 호중구. sfGFP (녹색), tagRFP (자홍색). 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 5fps입니다. 스케일 바 = 20 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 영화 2: Tg(lyz:Cxcr1-FT)(왼쪽)와 Tg(lyz:Cxcr2-FT)(오른쪽)의 호중구가 지느러미 상처에 반응하는 형질전환 유충입니다. 영화는 상처 후 10 분 이내에 시작되어 60 분 동안 지속됩니다. sfGFP (녹색), tagRFP (자홍색). 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 10fps입니다. CHT = 인과적 조혈 조직. VF = 복부 지느러미. 스케일 바 = 25 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 영화 3. 상처 입은 Tg(lyz:Cxcr1-FT) 트랜스제닉 유충(비디오 2에 표시된 것과 다른 유충)으로부터의 호중구의 추가 예는 CHT에서 동원될 때 또는 복부 지느러미에 진입 및 화학주성시 수용체 내재화(녹색으로 표시된 sfGFP 채널)를 보여주는, 더 높은 해상도로 획득되었다. 프레임 간격은 30초이고 프레임 속도는 2fps입니다. 스케일 바 = 10 μm. 비디오는 ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에서 유래했습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1 :<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 화학유인성 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량적 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다.

상처 반응 중 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체의 라이브 이미징

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K 조회수.  University of Cambridge. 여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 화학유인성 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량적 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다.

비디오: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

연구

발생학

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

면역학 및 감염병학

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

생체내 대식세포 모집 테스트를 위한 자궁외 체모카인 발현 모델

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

초파리 번데기 내에서 염증 성 세포 역학의 장기 Vivo에서 추적

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

생물학

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Source: Harvie, E. A. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52788">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes&#39; migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

박테리아에 감염된 형질전환 제브라피시의 광변환 기반 백혈구 추적

1. Preparing Microinjection Needles

	Prepare thin wall glass capillary injection needles (1.0 OD/0.75 ID) using a micropipette puller device with the ...