Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Agradecemos a Christine Holt e Bill Harris por ajuda com microscopia confocal. Agradecemos a Darren Gilmour pelas construções de espinha dorsal fluorescente e Anna Huttenlocher pelo vetor tol2-lyz backbone. Agradecemos a Steve Renshaw pela linha Tg(mpx:GFP)i114 . Este trabalho foi apoiado pelo MRC (MR/L019523/1), pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e um Isaac Newton Trust concedem 19.23(n). C.C. foi apoiado por uma estudante mrc DTP e em parte pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] concessão. H.W. foi apoiado por uma MrC DTP Studentship. A H.P. foi apoiada por uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) e em parte por um Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] grant e o MRC (MR/L019523/1).

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Os autores declaram não haver conflito de interesses

O método descrito permite imagens vivas da dinâmica do receptor em resposta a ligantes endógenos in situ durante uma resposta inflamatória a danos teciduais. O uso de repórteres de neutrófilo Cxcr1/Cxcr2 poderia ser expandido para outras configurações fisiológicas, como infecção, modelos tumorais ou outros tipos de danos teciduais 14,25,26,27. Além disso, linhas de resgate transgênicas, nas quais o receptor endógeno é suprimido e resgatado por um receptor mutante exógeno, poderiam fornecer ferramentas úteis para dissecar a importância de padrões específicos de migração de neutrófilos em respostas imunes. Por exemplo, mutantes receptores Cxcr1 que prejudicaram a dessensibilização causam agrupamento de neutrófilos mais proeminentes em locais inflamatórios14. Esse ganho de fenotipo de função poderia ser usado para entender o papel da congregação de neutrófilos em diferentes processos fisiológicos, por exemplo, reparação de feridas, doença infecciosa ou evolução tumoral, e complementar experimentos receptores knockdown/knockout. A metodologia também fornece uma base para expandir o leque de repórteres disponíveis. A escolha do repórter fluorescente é importante de se considerar e depende da questão biológica. Descobrimos que a rotatividade constitutiva desses receptores de quimioterapia em neutrófilos foi alta, em comparação com as células epiteliais, e que repórteres com maturação rápida (por exemplo, sfGFP) foram obrigados a relatar níveis de membrana em estado estável e resolver diferenças sobre a estimulação de neutrófilos 8,14. Assim, as relações de membrana de sfGFP/tagRFP não são aplicáveis para medir a internalização induzida por ligante neste tipo de célula, mas o padrão de tagRFP permite o rastreamento dos destinos intracelulares do receptor, o que poderia ser útil em alguns estudos. Também descobrimos que o sinal intracelular mais concentrado do tagRFP é útil para a triagem de larvas individuais. Uma abordagem alternativa para medir os níveis de receptor na membrana plasmática seria co-expressar um marcador de membrana fluorescente em neutrófilos no mesmo transgene9 ou em um transgeneindependente 14. No cenário anterior, o transgene forneceria um meio adicional para a triagem dos níveis de peixe e expressão seria comparável entre o marcador e o receptor. Esta última abordagem seria mais modular, na qual uma linha de zebrafish com um repórter receptor poderia ser combinada com diferentes linhas de repórteres. Em ambos os casos, vale a pena notar que a quantificação da membrana dos níveis do receptor é desafiadora em neutrófilos agrupados (veja abaixo). Por fim, observa-se que uma possível extensão deste protocolo seria acompanhar a imagem ao vivo pela imunohistoquímica para análises de localização mais detalhadas.
O sistema de transgênese Tol2 é bem estabelecido7 e o promotor de lysozyme C tem sido amplamente utilizado para a expressão de neutrófilo11,15. A abordagem transgênese é, portanto, relativamente simples e o nível de expressão alcançado com este promotor é alto o suficiente para fornecer contraste suficiente para a análise da dinâmica dos receptores. Uma possível limitação é que o nível de expressão não recapitula os níveis de expressão do receptor endógeno. Novas tecnologias CRISPR poderiam ser implantadas para estabelecer linhas de impacto para receptores de interesse particular28. Essas tecnologias ainda são complicadas e podem não garantir os níveis de expressão necessários para imagens subcelulares, mas seu desenvolvimento bem-sucedido seria um importante avanço para a compreensão da dinâmica de sinalização endógena. As validações funcionais são importantes para a interpretação de dados com construtos de receptores transgênicos. Por exemplo, ensaios de reconhecimento de ligantes podem ser usados para estabelecer que a proteína de fusão fluorescente é funcional e o resgate de fenótipos eliminatórios poderia ser usado para estabelecer que os níveis de expressão transgênica de neutrófilos são compatíveis com a funcionalidade14. Finalmente, uma maneira mais direta de validar a fusão receptora seria utilizar um ensaio funcional in vitro com receptor rotulado ao lado das versões não rotuladas14.
A abordagem de quantificação aborda dificuldades específicas na segmentação precisa da membrana em neutrófilos in vivo. Em células de natureza epitelial, a quantificação dos níveis dos receptores pode ser executada automaticamente pela normalização dos níveis do receptor de membrana para um marcador de controle, que pode ser expresso em conjunto ou separadamente9. De fato, aplicamos tal abordagem, ao usar o ensaio de reconhecimento de ligantes em embriões gasetruidores14. No entanto, os neutrófilos sofrem mudanças complexas e rápidas na forma celular in vivo, dificultando a segmentação da membrana tanto em 2D quanto em 3D14. Isso é ainda mais desafiador quando os neutrófilos se aglomeram, o que ocorre em muitas configurações fisiológicas29. A métrica de contraste supera essa limitação, pois não requer segmentação de membrana, mas reflete o estado geral de distribuição de receptores na célula (membranous/suave vs vesicular/dotty). É importante notar que a métrica de contraste pode ser afetada pelo contraste geral da imagem, de modo que a normalização dos valores celulares individuais a uma referência interna é necessária para explicar a variabilidade do sinal em diferentes embriões/amostras. Por exemplo, utilizamos o valor médio de contraste celular de neutrófilos não responsivos no CHT (ou seja, neutrófilos que permanecem estacionários e não migram para a barbatana ventral)14. Uma possibilidade adicional seria normalizar com valores de contraste de um marcador de controle na mesma célula. Isso forneceria uma solução quando uma referência interna de células não-respondendo não estiver disponível e provavelmente resolveria diferenças quantitativas mais finas na dinâmica do receptor entre diferentes condições.
A localização da imagem é outra variável a considerar. A razão para escolher a ferida da barbatana ventral aqui, ao contrário da ferida da barbatana traseira mais usada modelo16,30, é porque o local do ferimento está próximo ao local de residência neutrófila/origem migratória. Isso acelera a linha do tempo do ensaio, pois leva relativamente pouco tempo para os neutrófilos chegarem. Além disso, oferece a oportunidade de capturar o comportamento celular tanto na origem migratória (CHT) quanto no local de destino do interesse (ferida). Isso é relevante aqui, pois a resolução espacial e temporal necessária para imagens subcelulares é difícil de combinar com um grande campo de visão ou varredura multi-posição. Assim, o ensaio da ferida da barbatana ventral permite o acompanhamento da evolução da resposta migratória da origem migratória e a captura simultânea de flutuações de receptores inespecíficos em células que não respondem. Como mencionado acima, este último é útil para fins de quantificação, pois fornece uma referência interna para dinâmicas inespecíficas. Em outros sistemas, pode não ser possível ter tal referência interna, nesse caso os valores de contraste de um marcador de membrana co-expresso forneceriam um controle alternativo.
Em resumo, prevemos que a metodologia é aplicável a outros sistemas e pode ser implantada para uma variedade de propósitos. Por exemplo, os mesmos repórteres poderiam ser utilizados em outros ambientes inflamatórios, como configurações de infecção ou outros modelos de doenças. O repertório de linhas de repórteres receptores de zebrafish poderia ser expandido para outros receptores de sinalização, para entender mecanismos de sinalização ou relatar a dinâmica de ligantes in vivo. A abordagem pode ser combinada com técnicas de knockdown/nocaute para interrogar a base mecanicista da dinâmica observada. Por exemplo, a perturbação da expressão de ligantes pode indicar a dependência de ligantes para a dinâmica do receptor observado. No futuro, prevemos que o sistema poderia ser refinado para incorporar a inserção de repórteres. Em última análise, os achados que utilizam essa metodologia forneceriam novas percepções valiosas para além da comunidade de zebrafish, dada a conservação desses receptores de sinalização em mamíferos e o desafio relativo de realizar esses estudos em organismos maiores.

A migração de leucócitos é de suma importância para as respostas imunológicas. As células imunes são células migratórias prototípicas, que são notavelmente capazes de atravessar tecidos e vasos sanguíneos e sentir uma série de sinais de orientação química para migrar direcionalmente em direção a micróbios ou outras células hospedeiras de importância. A orientação correta baseia-se no reconhecimento de quimioattractants, entre os quais as quimiocinas representam a categoria1 mais proeminente. As quimiocinas são reconhecidas por receptores acoplados altamente específicos de sete transmembranos G. Após a ligação de quimiocina, os receptores de quimioterapia mudam a conformação levando à ativação de proteínas G trimeric associadas e sua dissociação em subunidades de sinalização funcional que promovem alterações citoesqueléticas e migração direcionada1. Em segundo lugar, os receptores de quimioterapia são fosforilados, e essa modificação leva à dessensibilização ao atrativo, que pode ser seguida por rápida resensibilidade/reciclagem ou degradação intracelular e baixa regulação da superfície celular2. Essas dinâmicas receptoras influenciam a duração e a dose de sinalização recebida pelas células, mas como elas afetam o comportamento de migração de leucócitos tem sido difícil de elucidar in vivo.
O rastreamento da dinâmica dos receptores em leucócitos vivos em sistemas tradicionais de mamíferos enfrenta vários desafios. Para estudos vivos, fusões receptoras com proteínas fluorescentes devem ser expressas nas células. Isso é desafiador em leucócitos primários, particularmente em neutrófilos, e estudos até agora têm usado linhas de células neutrófilas substitutas para expressar receptoresde quimioterapia 3,4. A geração de modelos de camundongos transgênicos, nos quais os leucócitos expressam um receptor fluorescente ou receptores mutantes com defeitos informativos de tráfico 5,6, implica um investimento considerável de tempo e recursos. Mesmo nesses casos, a resolução de imagens e o contraste para a dinâmica do receptor de imagem no animal vivo podem ser limitados e estudos têm usado imunohistoquímica nas seções de tecido fixo5. Dado esses desafios técnicos, nossa compreensão de como a dinâmica dos receptores quimioattractant afeta o comportamento celular em um ambiente de tecido vivo é atualmente limitada.
Aqui fornecemos uma metodologia para monitorar o tráfico de receptores em neutrófilos de zebrafish. Os zebrafish são geneticamente tratáveis, como ratos, mas a transgênese é relativamente mais simples através do uso de sistemas transposon eficientes e manipulação direta de zigoto7. A larva transparente é idealmente agradável à imagem. A dinâmica do receptor de quimiocina foi visualizada em células germinativas primordiais e a linha lateral primordium por expressão de fusões correspondentes com repórteres fluorescentes 8,9,10. As larvas de zebrafish são equipadas com neutrófilos maduros que têm propriedades genéticas e celulares altamente conservadas em relação aos neutrófilos mamíferos. Dinâmicas de sinalização subcelular, como a dinâmica citoesqueléllica e os reguladores de polaridade foram visualizadas nessas células pela geração das linhas transgênicas correspondentes 11,12,13. Recentemente, visualizamos e analisamos funcionalmente a dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante o curso de respostas inflamatórias a danos teciduais14. Aqui, descrevemos a geração de linhas de repórteres transgênicos para sinalização de quimiocina em neutrófilos, preparação de embriões para imagens vivas, um ensaio de ferida para estudar sinalização de neutrófilo e o protocolo para aquisição e análise de imagens. Também fornecemos um protocolo lateral para testar as respostas do receptor de quimiocina aos ligantes candidatos, o que é útil ao tentar estabelecer padrões de reconhecimento de ligantes em receptores não característicos. Essas técnicas podem ser usadas em combinação com outras manipulações genéticas, como a inibição da expressão endógena da quimiocina ou geração de receptores mutantes com tráfico induzido por ligantes alterados, para questionar como a dinâmica de sinalização específica afeta o comportamento leucócito in vivo. As linhas transgênicas que expressam receptores de quimioterapia fluorescentes também podem ser usadas como repórteres para gradientes endógenos de quimioterapia, que são difíceis de detectar por manchas diretas de anticorpos. A metodologia descrita fornece espaço para a expansão da geração de repórteres para outros receptores de imuno-sinalização.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark capillary glass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom microwell dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small paintbrush</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

A orientação de leucócitos por gradientes químicos é essencial para respostas imunes. Os neutrófilos são as primeiras células a serem recrutadas para locais de danos teciduais onde executam funções antimicrobianas cruciais. Seu tráfico para esses loci é orquestrado por vários quimioattractants inflamatórios, incluindo quimiocinas. No nível molecular, a sinalização de quimioattractant é regulada pelo tráfico intracelular dos receptores correspondentes. No entanto, ainda não está claro como as mudanças subcelulares nos receptores de quimiocina afetam a dinâmica de migração de leucócitos no nível celular e tecidual. Aqui descrevemos uma metodologia para imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante respostas inflamatórias a danos teciduais. Essas ferramentas revelaram que o tráfico diferencial de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish coordena o agrupamento e dispersão de neutrófilos em locais de danos teciduais. Isso tem implicações para nossa compreensão de como as respostas inflamatórias são auto-resolvidas. As ferramentas descritas poderiam ser usadas para entender padrões de migração de neutrófilos em uma variedade de ambientes fisiológicos e patológicos e a metodologia poderia ser expandida para outros receptores de sinalização.

A ferida da barbatana ventral é seguida pela rápida mobilização de neutrófilos do CHT para a barbatana ventral e agrupamento na margem da ferida, dentro de 30-60 min (Figura 1). Visualizamos a distribuição de dois receptores de quimiocina, Cxcr1 e Cxcr2, que são expressos por neutrófilos de zebrafish24 e reconhecem Cxcl8a e Cxcl8b14, usando microscopia confocal de disco giratório. Geramos duas linhas transgênicas correspondentes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), nas quais os neutrófilos expressam uma construção do temporizador fluorescente (FT) do receptor, ou seja, uma fusão com um tandem de sfGFP e tagRFP (Figura 2 e referência14). O uso dos dois fluoroforos destinava-se a permitir o monitoramento de uma ampla gama de destinos receptores e fornecer estimativas de tempo de rotatividade de proteínas na membrana plasmática, já que receptores recém-sintetizados fluoresceriam em verde e progressivamente se tornariam vermelhos à medida que envelheciam 8,14 anos. No entanto, esses receptores apresentaram rápida rotatividade constitutiva na membrana plasmática de neutrófilo e que o tempo de residência foi menor do que o tempo de maturação do tagRFP, com sfGFP mostrando localização de membrana e tagRFP mostrando localização vesicular em estado estável (Vídeo Suplementar 1 e ref14). Por isso, focamos na distribuição do SFGFP para monitorar a internalização induzida por ligantes em locais de danos teciduais. O padrão de distribuição do receptor foi quantificado utilizando-se a métrica de contraste, que relata diferenças de intensidade entre pixels vizinhos. A lógica é que quando a distribuição do receptor é membranous e suave, o valor de contraste é baixo. Quando a distribuição do receptor é vesicular e mais pontual, então o valor de contraste é alto (Figura 3).
Um método alternativo é quantificar a razão dos níveis de receptor (intensidade sfGFP) sobre os níveis de um marcador de membrana de controle, por exemplo, membrana CFP (mCFP) (Figura 3). Ambos os métodos poderiam detectar a internalização do receptor, como indicado por um padrão de distribuição de receptores mais vesiculares globalmente na célula (maior valor de contraste) ou níveis de receptores mais baixos na membrana (menor razão sfGFP/mCFP). No entanto, a métrica de contraste também poderia detectar internalização do receptor em aglomerados de neutrófilos na ferida, em que a segmentação da membrana era menos precisa e não aplicável (Figura 3). Utilizando esta métrica, conseguimos quantificar diferenças visíveis entre o tráfico de Cxcr1 e Cxcr2 em neutrófilos em feridas (Figura 4 e Vídeo Suplementar 2). Cxcr1-FT internalizado em células localizadas na ferida, enquanto Cxcr2-FT permaneceu membranous em neutrófilos na ferida (Figura 4A-C, Vídeo Suplementar 2 e Vídeo Suplementar 3). A supressão de Cxcl8a e Cxcl8b, através do tratamento de morfolino, afetou diferencialmente a internalização Cxcr1-FT nas feridas (Figura 4C,D). Para validar ainda mais que o Cxcr1-FT responde ao Cxcl8a, realizamos ensaios de resposta de quimioterapia em embriões precoces. Descobrimos que cxcr1-FT foi significativamente internalizado em embriões nos quais Cxcl8a foi co-expresso (Figura 5). Ao todo, esses resultados indicam que os métodos descritos podem ser implantados para medir a internalização do receptor induzido pela quimiocina em neutrófilos e estabelecer a identidade do ligante mediando esses efeitos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migração de neutrófilo para feridas de barbatana ventral. (A) (Esquerda) Desenho de 3 larvas dpf mostrando a localização do tecido hematopoiético caudal (CHT), a circulação de vênus (VC, azul), a barbatana ventral (VF) e o local da ferida. (À direita) Desenho animado retratando a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados do CHT e agrupando-se na ferida. O plexo da veia caudal (CVP) do tecido CHT é desenhado em azul. (B) Imagem de campo brilhante (esquerda) e projeção confocal (direita) mostrando a ferida da barbatana ventral e a distribuição de neutrófilos em larvas Tg (mpx:GFP) a 2 h após o ferimento. As linhas tracejadas mostram contornos VF e CHT. Barra de escala = 25 μm. Desenho animado e imagem fluorescente modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia em neutrófilos. (A) Construções utilizadas para expressão transgênica específica de neutrófilo de Cxcr1-FT (Temporizador Fluorescente) e Cxcr2-FT. Projeções confocal de neutrófilos na cabeça de uma larva transgênica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), topo; Tg(lyz:Cxcr2-FT), inferior) mostrando canais tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatômico de 3 dpf larva como na Figura 1A. Abaixo da larva estão esquemas que retratam a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados a partir do CHT (topo) ou realizando quimitaxis ao entrar na barbatana ventral (inferior). O quadrado tracejado indica área imagem em instantâneos à direita. (C) Nêutrons em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP) após a mobilização do CHT (painéis superiores) ou quimiotaxis em direção à ferida (painéis inferiores). As flechas mostram as mesmas células ao longo do tempo. Os pontos de tempo na imagem direita são minutos decorridos após a imagem à esquerda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representação esquemática da abordagem experimental para imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia. Painéis A-C modificados a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Exemplos de quantificação da dinâmica dos receptores. Neutrófilos únicos (azuis) ou agrupados (verdes) em feridas ou neutrófilos não mobilizados na CHT (vermelho, laranja) foram segmentados e analisados por diferentes métodos para comparar resultados. As mesmas células de exemplo mostradas foram analisadas com dois métodos para relacionar o que é visto na imagem com a gama de valores extraídos. (A) A superfície das células selecionadas, exemplo, foi segmentada com base na definição de contorno no canal sfGFP. (B) O contraste foi computado a partir das células de exemplo mostradas em A. (C) A membrana das células selecionadas, exemplo, foram segmentadas com base na definição de contorno no canal CFP. Análise ratiométrica do sfGFP/CFP seguido. (D) A razão de sfGFP/CFP foi calculada nas células de exemplo mostradas em C. As barras de erro representam S.E.M. de células individuais, em casos de n>1, valores aqui não foram utilizados para análise estatística, mas apenas para exemplificar medições obtidas com os diferentes métodos de quantificação. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinâmica diferencial de Cxcr1 e Cxcr2 em resposta ao ferimento. (A) Projeção confocal de neutrófilos em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) ou Tg (lyz:Cxcr2-FT) na ferida a 80 min pós-ferida (canal sfGFP mostrado). Barra de escala = 10 μm.  (B) Neutrófilo Cxcr1-FT ampliado (esquerda) e Cxcr2-FT (direita) na ferida. Receptor verde é mostrado em cinza. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado ao contraste médio de células não mobilizadas no CHT). cxcl8a refere-se à injeção de um bloqueio de emendas juntamente com um morfolino bloqueador de tradução para cxcl8a. cxcl8b refere-se à injeção com um morfolino bloqueador de emendas para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (ferida) de 8 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr1-FT) com morfolnos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) e n=20 células (ferida) de 3 larvas. Os dados foram agrupados de larvas independentes adquiridas em 1-5 sessões de imagem. Teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparações múltiplas de Dunn para Tg (lyz:Cxcr1-FT), teste mann-whitney não pago de duas caudas para Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) Projeção confocal de neutrófilos em Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvas transgênicas tratadas com cxcl8a morpholino (MO) (esquerda) e cxcl8b MO (direita) respondendo a feridas de barbatana (canal sfGFP mostrado em verde). Instantâneo tirada em pontos de tempo de acúmulo de neutrófilo equivalente (85 min pós-ferimentos na imagem esquerda e 45 minutos pós-ferimentos na imagem direita). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Ensaio de resposta de quimiocina em embriões primitivos. Fatias confocal de escaneamento a laser de embriões gastrulating mostrando expressão e distribuição de Cxcr1-FT. 100 pg de Cxcr1-FT mRNA foram injetadas em um estágio celular com ou sem 150 pg Cxcl8a mRNA. Receptores verdes e vermelhos são mostrados em canais separados. O marcador CFP da membrana de controle (mCFP) é mostrado no canal ciano. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme suplementar 1: Neutrófilos transgênicos na cabeça de uma larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (direita) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme suplementar 2: Neutrófilos em Tg (lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg (lyz:Cxcr2-FT) (direita) larvas transgênicas respondendo a feridas na barbatana. O filme começa dentro de 10 min pós-ferida e dura 60 min. sfGFP (verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 10 fps. CHT = tecido hematopoiético caudal. VF = barbatana ventral. Barra de escala = 25 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme suplementar 3. Exemplos adicionais de neutrófilos de uma larva transgênica Tg(lyz:Cxcr1-FT) ferida (larva diferente da mostrada no Vídeo 2), adquirida em maior resolução, mostrando internalização receptora (canal sfGFP mostrado em verde) após mobilização no CHT ou na entrada e quimipeso na barbatana ventral. O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Arquivo complementar 1: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 3: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 4: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Aqui descrevemos protocolos para realizar imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor quimioattractant em neutófilos de zebrafish

Imagem ao vivo de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish durante respostas de feridas

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K visualizações.  University of Cambridge. Aqui descrevemos protocolos para realizar imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor quimioattractant em neutófilos de zebrafish

Vídeo: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Biologia do Desenvolvimento

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Imunologia e Infecção

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Biologia

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Source: Harvie, E. A. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52788">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes&#39; migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Rastreamento de leucócitos baseado em fotoconversão em peixe-zebra transgênico infectado por bactérias

1. Preparing Microinjection Needles

	Prepare thin wall glass capillary injection needles (1.0 OD/0.75 ID) using a micropipette puller device with the ...