<p class="jove_content"&gt; 우리는 우수한 동물의 축산에 대한 Nadeshda 울프, 나딘 Eschen와 수잔 Delong 감사드립니다. CW는 Helmholtz 프로그램 &#39;에서 박사 학위 친교에 의해 지원되었다<em&gt; BioInterfaces</em&gt; 국제 대학원 &#39;(BIFIGS). 추가 지원은 CG로 제 7 회 유럽 커뮤니티 프레임 워크 프로그램 (PIRG07-GA-2010-267552) 내에 KIT-RISC 교부금에 의해 및 마리 퀴리 국제 합체 그랜트에 의해 제공되었다. 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (238821) - AHS는 (간, 췌장 개발 및 질병의 생물학) 굵은 의해 지원되었다. UL은 Dopaminet FP7 (일곱 번째 프레임 워크 프로그램) (223744)에 의해 지원되었다.</p&gt;

1. 동물 처리 친 분석 사용 3 dpf의 애벌레는 homozygous 이중 형질 전환 cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2와 AB (야생 형) 물고기 사이의 그룹 matings 인한하십시오. 자연 산란에 의해 배아를 수집 29에서 그들을 키울 ° 배양 접시에 E3 중간에 C (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.33 MM MgSO 4, 파랑의 0.1 %의 메틸렌, 산도 7.0 equilibrated). 그것은 접시 당 50-70를 초과하지 배아의 밀도를 유지하기 위해 필수적입니다. 2. 유충 정렬 형광 기자의 표현, 자발적인 염증과 적절한 연령 관련 개발을위한 형광 입체경 미만의 모든 애벌레를 확인하십시오. 3. 상영 매체 준비 (항상 신선한를 준비) DMSO (1 % 최종)과 MS222 (0.05 G / L)로 보완 메틸렌 블루없이 E3 매체를 준비합니다. 4. CuSO4준비 (항상 신선한 준비) 첫째 CuSO 4 아웃 무게 (M R = 159.6 g / 몰) DH와 20 밀리미터 주식 솔루션을 준비하는 두 O. E3/DMSO (1 %) / MS-222에서 120 μm의 CuSO 4 작업 솔루션 (20 밀리미터 주식 용액에서) 준비합니다. 빛으로부터 CuSO 4 용액을 보호합니다. 5. 384 잘 플레이트 준비 (Greiner 384 자 Microplate) 역방향 피펫으로 각각 잘으로 E3/DMSO (1 %) / MS-222의 20 μl를 사전에 추가합니다. 증가 피펫 팁을 구멍은 어떤 남긴 상처를 보면서 겁에 질리게하지 않고 신중하게 배아를 처리하는 데 필요한, ​​이것은 보어 2mm로 팁을 절단하여 이루어집니다. 각도 (치료 제어를위한 84 μl)로 매체의 74 μl의 단일 유충을 전송합니다. 필요한 경우, 잘 내에서 수평 위치에 동양의 유충은 유연 Eppendorf Microloader 피펫 팁 (; 5242 956.003 Eppendorf)를 사용합니다. 로봇 액체로 모두 다음과 같은 액체 처리 단계를 실시모든 애벌레의 동시 치료를 보장하기 위해 워크 스테이션을 취급. 6. 약물 치료 아래로 pipetting 및하여 약물 주식 판의 화합물 5 회를 섞습니다. 각도에 7.5X 약물 주식 판 16 μl을 넣고 5 번 섞는다. 애벌레의 부상을 방지하고 10 μl / s의 매체를 하는걸 우물 이내 팁 위치를 조정합니다. 잘 내에서 약물의 동질적인 유통을 보장하기 위해 우물의 중간 4 회를 섞습니다. 7. 잠복 29에서 1 H에 대한 검사 판을 품어 ° C에서 빛으로부터뿐만 CuSO 4와 같은 화합물을 보호하기 위해 알루미늄 호일 있었다. 8. 화학 남긴 상처 부정적인 컨트롤 믹스 4 배까지를 제외하고 각 잘 ~ 120 μm의 CuSO 4 작업 용액 10 μl를 추가 29에서 1 H에 다시 품어 ° C. 9. 세정 나 80 μl를 제거하고 교환<html> 각각의 dium 잘 회 (20 μl 단계에서) 화합물을 제거하고 CuSO 4. 10. 이미지 수집 90 분이면 초기 구리 치료 : 거꾸로 자동화된 현미경 (올림푸스 스캔 ^ R IE)에서 이미지 수집을 시작합니다. 좌우 측면 후부 라인 neuromasts가 표시되도록 초기 Z-레벨을 설정합니다. 이미지가 각각 잘 한 채널 brightfield에서 시간당 4 초점 비행기 (50 μm의 거리)에 Cy3와 GFP는 4X 목적 (NA가 = 0.13)을 사용합니다. 이미지 및 데이터 처리에 대한 자세한 내용은 요청시 가능합니다. 11. 이미지 처리 1. 정렬 데이터 RAW 이미지는 우리의 정의 LabView 소프트웨어 스크립트로 처리됩니다. 영상 처리 파이프라인의 첫 번째 작업은 채널, 잘하고 시간이 지점 정보에 의해 현미경 생성된 데이터 폴더에서 원시 이미지 정렬됩니다. ove_step &quot;&gt; 2. 확장 초점 이후 소프트웨어 채널의 각 4 초점 비행기에서 연장 초점 이미지를 생성합니다. 3. RGB-오버레이 마지막 단계에서는 3 채널의 확장된 초점 이미지는 최종 RGB-오버레이 이미지에 결과로 병합됩니다. 4. 자동 neuromast 검출 패턴 인식 도구 (LabView 래피드 아이오와 프로토 타이핑 도구)는 RGB 오버레이 이미지 내에서 neuromasts를 식별하고 neuromasts 주위의 관심 경험적으로 정의된 영역을 만듭니다. 5. 부량 부상당한 neuromasts 주변 관심 경험적으로 정의된 영역 내에 빨간색 형광 leukocytes는 (빨강 픽셀로 반영) 난 eukocytes (Paol)에 의해 ccupied P ercent 정말이에요 O의 기본 판독 결과 채점됩니다. 평균 95.27 ± 2.11 % (FDA1) 및 95.12 ±에우물 (애벌레)의 1.56 % (FDA2)을 제대로 감지하고 있으며 이후 추가로 데이터 처리를 받게되었습니다. 원시 데이터 출력 (각 감지 neuromast 대한 Paol) txt 파일에 저장하고 추가로 원시 데이터를 처리하는 MATLAB 스크립트를위한 데이터 입력으로 제공됩니다. 12. 데이터 처리 1. iMaps 색상 코드에서 원시 데이터 출력 Paol의 그래픽 시각화에 의한 개별 실험의 성공 여부를 평가하는 것은 소위 염증지도 (iMaps) (그림 2)로 실현될 수 있습니다. 밝은 초록색은 높은 초기 염증 지수를 반영, 블랙은 염증을 나타냅니다. 이것은 간략하게 다음 추가 데이터 분석에서 제외됩니다 실패한 실험의 신속한 식별을 허용합니다. 2. 컨트롤의 평균 각 실험 음식을 반영하는 320 화합물이 포함되어 있습니다단일 데이터는 각각 화합물 및 시간 - 포인트뿐만 아니라 32 긍정적이고 부정적인 통제에 따라 지적한다. 32 제어 복제는 평균과 표준 편차를 계산합니다. 컨트롤의 2 표준 편차 이내에만 데이터 포인트가 포함되어 있습니다. 3. 표준화 정상화는 스프레드 시트 분석을 통해 이루어집니다. 부정적인 제어되는 DMSO의 평균 값은, 0으로 설정되고 구리 컨트롤에 대한 높은 평균 Paol은 긍정적이고 부정적인 통제 사이의 최대 차이가 1로 설정되어 있도록 1로 설정됩니다. 각 화합물의 Paol는 선형적으로 보정이나 실험용 접시에 각각의 컨트롤로 추정된다. 4. 최종 읽기 아웃 : 염증성 지수 충분한 복제 실험 (즉 15)이 실시되고 나면, 복제 실험에서 표준 원시 데이터 읽기 아웃 최종 결과, 평균값이된다 - 염증색인. 구리 컨트롤의 초기 염증 지수는 시간이 포인트 제로를위한 100 % 시작과 이미지 수집 시작 시간 (90분 초기 구리 치료 후)에 연결합니다. 5. Monotonic 지수 회귀 피팅 시간의 경과에 염증 해상도로 인해 우리가 사용하여 초기 염증 향해 monotonic 지수 비선형 회귀 피팅을 수행 <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="등식 1" /> - 0 t = 0에서 초기 대응을위한 조치이며, 1 시간에 따른 규모의 슬로프와 관련되어 있습니다. 6. 2-D 기능 공간 계획 (그림 4) 기능 공간을 생성하려면 비선형 회귀가 적용되고 클러스터 분석은 따라서 다른 면역 - modulatory 카테​​고리에서 재미있는 후보자의 자동 식별 (안티 inflammat 수 있도록, 특색있는 지역으로 기능 공간을 분할ory, 안티 해상도, 프로 - 염증, 프로 해상도). 모든 화합물은 매개 변수가 0과 1을 바탕으로 2 차원 플롯에 표시됩니다. 13. 데이터 처리 및 저장 우리의 데이터는 루틴과 같이 &#39;결과뿐만 아니라, 사용자가 10 요청 상세한 전망을 처리 빠르게 이미지의 개요 및 데이터를 제공하는 등 마약 화면을 시각화하고 표현하는 웹 페이지를 만드는 처리. 기타 관련 이종 생물 학적 및 화학적 데이터베이스에 대한 소프트 링크는 비교과 소설 연구 11 귀중한 자원을 제공하기 위해뿐만 아니라 통합되었습니다. 이러한 루틴으로, 적절한 데이터 표준 및 metainformation이 데이터의 장기 보관을 위해 설정됩니다. 14. 대표 결과 파일럿 화면에서 우리는 640로 구성된 라이브러리를 분석 FDA는 granul의 개시, 진행이나 ​​해상도에 대한 영향에 대해 알려진 bioactive 화합물을 승인ocytic 염증 반응. 우리는 행동 다른 모드는 지표가 될 수 있습니다 면역 modulatory의 phenotypes의 4 가지 유형 분류 관찰된 효과를 바탕으로 : 안티 - 염증성를 (1), 안티 해상도 (2), 프로 - 염증 (3) 및 프로 해상도 (4) 어느 monotonic 비선형 회귀 피팅 (E AO + alx -)에서 발생하는 매개 변수가 0과 1로 표현할 수있는 초기 염증 큰 기여를했다. 1 곡선의 기울기를 특징 때문에 염증 해상도를 설명 반면 0 염증 반응의 정도를 나타냅니다. 2-D 기능 공간 줄거리 (0 대 1)에있는 모든 성분을 표시하는 것은 다른 면역 modulatory 카테고리에서 충돌 후보자 (그림 3)의 자동 식별을 허용합니다. 640 화합물의 밖으로 45 50 % 이하로 초기 염증성 인덱스를 줄임으로써 상당한 안티 - 염증성 효과를 진력. 생 이내의 범주 우리는 6 화합물 우리 접근법의 유효성을 확인하는 비 steroidal 안티 - 염증성 약물 (NSAIDs)의 pharmacological 클래스에 속하는 발견. 그러나, NSAIDs는 가장 강력한 항정 염증성 약물끼리 위를 기록했다. 이외 NSAIDs에서 우리는 이러한 예제 안지오텐신 수용체 차단제 (ARBs), 항생제 및 프로톤 펌프 억제제에 대한 같은 몇 가지 추가 pharmacological 약물 클래스를 발견. 7 화합물은 잠재적 프로 해상도 의약품에 대한 경험적으로 정의된 임계값 기준을 만났습니다. 18 마약 긍정적인 컨트롤에 비해 부상 neuromasts로 과장 백혈구 모집 결과, 프로 - 염증 효과를 진력. 오직 두 화합물은 염증 반응의 적시 해상도를 못했습니다. 파일럿 화면 coul에서 여러 히트 후보자의 안티 - 염증성 효과 (위에서 언급한 pharmacological 약물 클래스에서 모범적인 후보자)D는 이후 보조 턱 assays (데이터가 표시되지 않음)에 복용 종속적인 방식으로 확인됩니다. 기본 화면에 진력으로 4 잠재적인 프로 해상도 의약품의 Retesting 행동의 지정된 모드를 확인하지 않았다. 약물 2는 높은 농도 (20 μm의)에서 약간의 안티 - 염증성 잠재력을했다. 20 μm의 - 세번째 약물은 5에서부터 약물 농도에 한계가 아닌 선량 종속 항 염증 효과를 전시. 네 번째 약물 테스트 농도에서 염증 반응에 아무런 영향을 미치지 않았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> 1 그림. 친 분석의 워크플로우. 개별 화합물 유전자 변형 cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 애벌레 (3 dpf)을 수동으로 384 잘 microtiter 접시에 배포됩니다. 약물이 잘 제퍼 컴팩트 액체 처리 워크 스테이션을 사용하여 각에 동시에 추가됩니다. 검정 접시 그러면 29에서 1 H 위해 incubated있다 ° C. CuSO 4 치료 </sub&gt; - 1 H가 남긴 상처를 고행과 급성 염증 반응을 시작을위한 솔루션 (10 μm의 최종 농도). 마지막으로, 구리 솔루션과 약물은 씻어되고 자동화된 이미지 수집가 (초기 구리 치료 후 90 분) 시작됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> 그림 2. . 채널을 각각 Cy3 (왼쪽)와 GFP (오른쪽)이 50 μm의의 거리에서 - 개요 RAW 이미지의 그림은 그림 4 초점 비행기 (3 Z = 0)의 RAW 이미지를 보여줍니다. 화살표 (Z = 1,2) neuromasts 주변 클러스터된 leukocytes의 모범 neuromasts, 화살촉 (Z = 1,2) 지점을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> 그림 3. 염증지도 (iMaps) 각 실험의 성공은 색상 코드의 염증성 반응 (원시 데이터) 반영 iMaps로 평가하실 수 있습니다. 밝은 녹색은 높은 초기 infla을 반영<html> mmatory 반응, 블랙이 더 염증을 나타냅니다 timepoint 0 (왼쪽)와 시간 - 포인트 5 (오른쪽)에서 iMaps 분명 실험이 추가로 데이터 처리에 포함해야하는지 여부를 보여줍니다.. DMSO 제어 우물 (행 1, 12) 녹색의 어두운 또는 검은색에 나타나는 반면 구리 컨트롤 (행 13, 24), 녹색의 음영 변화에 표시됩니다. 시간 - 포인트 5, 염증이 거의 지금 녹색 또는 검은색의 어두운 그늘에 나타나, 구리 컨트롤에서 해결되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> 4 그림. FDA는 320 화합물의 2 차원 기능 공간 줄거리는 라이브러리 및 각각의 컨트롤을 승인했습니다. 모든 화합물 우물은 비선형에서 발생하는 매개 변수를 0과 1을 기반으로 2 차원 기능 공간 계획에 표시할 수 있습니다 회귀 피팅 (d/4203/4203eq1.jpg &quot;고도 =&quot;초기 염증을 향해 / 수식 1 &quot;&gt;가).이 기능은 공간 줄거리는 마약을 나타내는 수도 있습니다 다음 4 면역 - modulatory 범주 중 하나에 속하는 흥미로운 후보자의 자동 식별을 허용 행동 &#39;모드 :. 안티 염증성 (1), 안티 해상도 (2), 프로 - 염증 (3) 및 프로 해상도 (4) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> .

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	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

<p class="jove_content"&gt; 여기에서 우리는 전체 동물의 컨텍스트에서 면역 - modulatory 화합물의 식별을 가능하게하는 완전 자동화된 높은 처리량 검사 전략을 제시한다. 급성 염증 반응에 따라서 허용 모니터링<em&gt; 생체내에서</em&gt; 실시간 인치</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 상처로 백혈구 모집에 대한 약물 효과가 완전히 작동 타고난 면역 체계의 맥락에서 상대적으로 쉽게 공부 할 수 있기 때문에, 약물 발견이나 약물 repurposing 노력에 대한 가치있는 모델 생물로 zebrafish를 적용하는 프로토콜을 제공합니다. 우리의 접근 방식의 독특한 장점은 화학 남긴 상처로 이렇게 높은 처리량 형식으로 자동화 및 심사 허용, 수동 애벌레 조작 오래된을 렌더링한다는 사실입니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 또한 불리한이나 독성 약물 효과뿐만 아니라 강력한 오프 타겟 효과는 쉽게 설정 제안된으로 평가 할 수 있습니다. FDA 승인된 라이브러리 그러나 주어진 심사 농도에서 어떠한 독성 화합물을 포함하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 우리는 테스트 라이브러리에서 동일한 pharmacological 물질 클래스 선물의 구성원 사이에 사용 가능한 데이터 세트 (예 : 면역 modulatory의 표현형, 약물 농도)를 비교하는 명백한 독성 물질에 대해 제안합니다. 필요가있을 경우 별도로 유망 면역 modulatory의 표현형을 미치는 약물 가족의 유독성 회원, 낮은 농도에서 retested 수 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 그들의 진력 면역 - modulatory 효과에 따라 자동으로 분류하는 의약품의 가능성을 증명하고있다. 안티 - 염증성 화합물의 범주에 속하는 약물은 독립적인 실험, 복용량에 의존 방식으로 그들의 효과를 exerting 화합물의 대부분에서 확인 수있다. 잠재적인 프로 해상도 약물로 식별 포 화합물은 지금까지와 같은 확인되지 않았습니다. 전적 해상도에 영향을 미치는 어떤 약품이 지금까지 문헌에서 설명되지 않은 이후로 그것은 또한,이 특정 면역 modulatory 분류는 설명하기 어렵다는 것을 나타냅니다. 그러나 4 retested 의약품의 3 높은 어금니 농도에서 안티 염증성 경향을 보여주었다. 경험적으로 정의된 임계값 기준을 최적화하면 거짓 - 반응의 수를 줄이기 위해 도움이 될 것입니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 또한, 제시된 기법 백혈구 철새 행동에 영향을 미치는 유전자 변이의 식별을 위해 활용하기위한 가능성을 제공합니다<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 결론, 제안된 방법은 촉진 및 약물 내성, 독성, 투약뿐만 아니라 잠재적인 오프 타겟 효과에 쉽게 이용할 수있는 정보와 함께 잠재적인 새로운 단서 구조를 항복하여 노력을 repurposing 약물 발견이나 약물을 가속하실 수 있습니다. 그러므로, 약물 개발의 초기 단계에서 간단한 비용 및 시간 절약 전략으로 봉사.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulphoxide </td><td> 칼 로스 게엠베하 &amp; 주식 KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> 구리 (II) 황산염 무수 </td><td> 칼 로스 게엠베하 &amp; 주식 KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA는 약물 라이브러리를 승인 </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 microwell 플레이트 구속력, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781,906 </td><td> 검정 </td></tr><tr><td> 올림푸스 스캔 ^ R </td><td> 올림포스 산 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 제퍼 컴팩트 액체 처리 워크 스테이션 </td><td> 캘리퍼스 </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Zebrafish의 애벌레는 작은 크기와 조작과 관찰의 상대적 용이성뿐만 아니라 시행 때 화합물은 단순히 입욕 물에 추가할 수 있으며, 쉽게 흡수되고있다는 사실로 인해 작은 분자 스크린 1,2 전체 동물에 특히 의무가 있습니다 &lt;1 % DMSO 솔루션입니다. zebrafish 애벌레와 leukocytes에 형광 단백질을 표현 형질 전환 라인의 가용성의 광학 선명도 때문에 zebrafish는 생체내에 급성 염증 반응을 모니터링의 독특한 장점을 제공합니다. 따라서, 높은 처리량과 면역 - modulatory 화합물의 식별을 목표로 우수한 컨텐츠 작은 분자 화면에 대한 zebrafish을 활용하면, 염증 유도 시나리오 지느러미 조직에서화된 닉스를 예의 노른자 표면으로 이동 레이저 손상을 제안, 3-6 제안되었습니다 배아 7 tailfin 절단 3,5,6. 이러한 방법의 주요 단점은 있지만였다수동 유충 조작의 요구하므로 높은 처리량 검사를 방지할 남긴 상처를 유발합니다. 화학적으로 유도된 염증 (친) 분석 8 도입은 이러한 장애물을 제거. 남긴 상처를 입은 있기 때문에 화학적으로 동시에 치료할 수 배아의 개수는 거의 제한이 없습니다. 구리 황산과 zebrafish 애벌레의 임시 치료 선택 측면 라인 시스템 및 부상 neuromasts에 대한 신속한 과립 모집 결과의 세포에서 세포 죽음을 유도합니다. 염증성 반응은 화합물 유전자 변형 cldnB :: GFP / lysC :: neuromast 세포뿐만 아니라 빨간 형광 단백질 상표 granulocytes에 녹색 형광 단백질을 표현 DsRED2 6,9 zebrafish 애벌레를 사용하여 실시간으로 따라 할 수 있습니다. 모두 높은 컨텐츠와 높은 처리량 분석을 허용 심사 전략을 고안하기 위하여 우리는 로봇 액체 핸들링과 결합된 자동 micr을 도입사용자 정의 개발 소프트웨어 스크립트 oscopy. 이 스크립트는 부상 녹색 형광 neuromasts를 둘러싼 경험적으로 정의된 영역 내에 빨간색 형광 leukocytes에 의해 점령 %의 영역을 채점하여 염증 반응의 자동 부량 수 있습니다. 또한, 자동 데이터 처리, 처리, 시각화, 스토리지는 MATLAB과 파이썬 스크립트를 개발 정의에 기초. 간단한에서는 granulocytic 염증 반응의 개시, 진행이나 ​​해상도에 미치는 영향에 대한 화학적 화합물의 테스트를 허용 자동 HC / HT 화면을 소개합니다. 이 프로토콜은 타고난 면역 반응의 오케스트 레이션에 관련된 약물 메커니​​즘과 경로보다 심층적인 분석을위한 좋은 출발점을 제공합니다. 앞으로, 그것은 약물 발견의 초기 단계에서 참을 독성이나 오프 타겟 효과를 식별하는 데 도움함으로써 약물 개발을위한 절차적 위험과 비용을 절감할 수 있습니다.

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K 조회수.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. 여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

연구

면역학 및 감염병학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...