필라멘트 아콤유세테 헌티엘라 오만시스에서 CRISPR-Cas9 중재 게놈 편집

우리의 프로토콜은 비 모델 곰팡이에서 일하는 연구원이 실험실에서 최첨단 게놈 편집 기술을 확립 할 수있는 기회를 허용하기 때문에 중요합니다. 식 시스템과 같은 기존 기술에 의존하지 않으므로 이 프로토콜은 비모델 시스템에서 쉽게 설정할 수 있다는 장점이 있습니다. 이 방법은 다른 곰팡이 종에 걸쳐 사용할 수 있으며 경로 짝짓기, 성장 및 병원성에 관련된 유전자의 기능을 해명하는 데 사용할 수 있습니다.

따라서 이 절차를 수행할 때는 일시 중지할 수 있는 실험에 몇 점만 있으므로 프로토콜과 경쟁하기 위해 충분한 연속 일이 있어야 합니다. 코니디아를 수확하려면 멸균 실험실 천층을 통해 액체 배양을 원심분리를 위해 50밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링합니다. 코니디아 펠릿을 5밀리리터의 물로 재중단하고 40X 배율에서 가벼운 현미경으로 코니디아 용액의 10 마이크로리터 알리쿼트를 보고 코니디아만 회수되었는지 확인합니다.

다음으로, 신선한 1% 맥아 추출물 국물 200밀리리터를 500밀리리터 플라스크에 넣고 전체 코니디아 를 플라스크로 옮킨다. 그런 다음 분당 120 회전에서 25도 흔들림 인큐베이터에서 최대 12 시간 동안 액체 문화를 배양하십시오. 세균을 수확하려면 원심분리를 위해 50 밀리리터 원심분리관으로 문화를 옮기고 어금니 소르 비톨10밀리리터의 세균을 재보습한다.

다양한 효소 용액에 1밀리리터의 배아 용액을 추가하고 분당 80회전에서 흔들리는 인큐베이터에서 2~3시간 동안 포자 효소 용액을 배양합니다. 프톱서를 수확하려면 멸균 실험실 천층을 통해 효소 용액을 걸레게 하고 원심분리에 의해 프톱서스트를 수집합니다. 그런 다음 STC 버퍼의 200 마이크로 리터에서 프토프스트 펠릿을 조심스럽게 재중단하고 현미경으로 용액의 10 마이크로 리터 알리쿼트만 회수되었는지 확인합니다.

변환을 시작하기 위하여는, 리보뉴클레오단백질 용액의 단 하나 부피및 기증자 DNA 단편의 대략 6 마이크로그램과 6개의 protoplasts에 대략 5 회 10을 결합합니다. 다음으로, 파이펫을 사용하여 프로토프스트 서스펜션에 새로 준비된 30% PTC 용액의 1밀리리터를 천천히 고르게 드립시켜 프토플라스트 위에 소수성 층을 생성하고 실온에서 20분 동안 용액을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 5밀리리터의 삼투압 제어 매체를 프스토플라스트 서스펜션에 추가하여 천천히 부드럽게 파이프를 사용하여 용액을 완전히 혼합합니다.

혼합 후, 하룻밤 동안 분당 80 회전에서 흔들리는 인큐베이터에서 프토플라스트 솔루션을 배양합니다. 다음 주 아침에는 용액을 60mm 배양 플레이트 5개로 나눕니다. 각 접시에 Hygromycin B의 밀리리터 당 30 마이크로그램으로 보충된 삼투약 제어 매체 한천 10밀리리터를 넣고 각 접시에 천천히 회전합니다.

Hygromycin B의 밀리리터 당 40 마이크로그램으로 보충 된 삼투성 제어 매체 한천의 10 밀리리터를 추가하기 전에 한천의 첫 번째 층을 설정합니다. 한고의 두 번째 층을 설정한 후, 단일 분리가 한천의 두 층을 통해 성장하는 것을 관찰 할 때까지 섭씨 25도에서 배양. 성공적으로 변형된 분리를 복구하기 위해, Hygromycin의 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 보충된 신선한 맥아 추출물 한천 플레이트로 개별 성장 가능 분리물을 전송하여 곰팡이의 헤트로살능력, 상응성 신선한 맥아 추출물 농어 배지의 효과를 평가할 B.To, 한 가지 돌연변이 균주와 함께 신선한 맥아 추출물 을 결합하여 매트 배지의 결합을 결합하는 배지를 공동 접종한다.

H.omanensis와 함께 작업 할 때, 커버하지만 플레이트를 밀봉하지 않습니다. 7일 동안 접시를 실온에 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 시각적으로 성적 구조의 생산에 대한 평가.

돌연변이 균주의 균주균의 호모탈릭 기능을 테스트하기 위해, 신선한 맥아 추출물 에마배지를 관심있는 돌연변이 균주로 접종하고 1주일 동안 실온에서 플레이트를 배양한다. 연구 중인 곰팡이의 성장 속도에 대한 중단의 영향을 평가하기 위해, 각 돌연변이 및 야생식 스트레인의 배양에 대한 활발한 성장 가장자리에 큰 멸균 파이펫 팁의 뒷면을 삽입하여 균천으로 덮인 한천 플러그를 만들고 신선한 맥아 추출물 천지 매체를 접종하십시오. 문화권 유형당 적어도 세 개의 복제를 수행해야 합니다.

섭씨 20도에서 3일간 성장한 후, 두 개의 수직 직경에서 각 플레이트의 성장을 측정합니다. 프로토콜의 시작 재료로 사용되는 Conidia는 발아하고 젊은 세균이 될 때까지 성장할 수 있습니다. 이와 같은 성숙한 신비의 가닥은 저하에 너무 성숙하고 사용해서는 안된다는 점에 유의하십시오.

세포가 더 이상 세포벽을 갖지 않을 때, 기계적 중단에 매우 민감해지고 변환을 위해 수확할 수 있는 둥근 프톱서를 방출합니다. 프로토콜의 성공은 돌연변이 균주의 현상 분석시 확인할 수 있다. 이 돌연변이 매트 (127) 분리를 위해, 식물 방사형 성장 속도크게 감소되었다, 새로운 짝짓기 유전자에 대한 흉부 효과를 제안.

더욱이, 돌연변이 분리는 잠복의 5 일 이내에 전체 성적 주기를 완료 야생 형 격리에 비해 성적 포자를 생산하지 않은 미숙한 성적 구조를 생산하는 성적 주기를 완료 할 수 없었다. RNA는 매우 민감하고 매우 쉽게 저하됩니다. 따라서 깨끗한 작업 환경과 얼음에서 신속하게 작업하는 것은 이 실험의 성공에 필수적입니다.

돌연변이 분리가 성공적으로 생성되면, 그(것)들은 특징화되는 유전자를 위해 적당하게 표면 또는 RNA-seq 분석을 복종할 수 있습니다.