Protokolümüz önemli, çünkü model olmayan mantarlar üzerinde çalışan araştırmacılara laboratuvarlarında en ileri genom düzenleme teknolojilerini kurma fırsatı veriyor. İfade sistemleri gibi varolan tekniklere dayanmadığı için, bu protokol model olmayan sistemlerde daha kolay oluşturulma avantajına sahiptir. Bu yöntem farklı mantar türleri arasında kullanılabilir ve yol uzaması, büyüme ve patojenite ile ilgili genlerin işlevlerini açıklamak için kullanılabilir.
Bu nedenle, bu yordamı gerçekleştirirken, protokolün duraklatıldığı deneyde yalnızca birkaç nokta olduğu için, protokolle rekabet edebilmek için arka arkaya yeterli güne sahip olunduğundan emin olmak gerekir. Konidia hasat etmek için, santrifüj için 50 mililitrelik santrifüj tüpler içine steril laboratuvar bezi bir tabaka ile sıvı kültürü filtre. Beş mililitre suda konidia peletini yeniden askıya alın ve sadece konidianın kurtarıldığını doğrulamak için 40X büyütmede ışık mikroskobu altında konidia çözeltisinin 10 mikrolitrelik aliquot'u görüntüleyin.
Daha sonra, 500 mililitrelik bir şişeye 200 mililitre taze malt özü suyu ekleyin ve konidianın tüm hacmini şişeye aktarın. Daha sonra sıvı kültürünü dakikada 120 devirde 25 derece santigrat derece ye kadar inkübatörsal olarak 12 saate kadar kuluçkaya yatırın. Mikropları hasat etmek için, santrifüj için 50 mililitrelik santrifüj tüplere kültür aktarın ve bir molar sorbitol 10 mililitrekadar germlings resuspend.
Enzim çözeltisinin çeşitli konsantrasyonlarına bir mililitre germling çözeltisi ekleyin ve spor enzim solüsyonunu dakikada 80 devirde sallayarak kuvözde 2-3 saat kuluçkaya yatırın. Protoplastları hasat etmek için enzim çözeltisini steril laboratuvar bezi tabakasından filtreleyin ve protoplastları santrifüj le toplayın. Daha sonra 200 mikrolitre STC tamponundaki protoplast peletini dikkatlice yeniden askıya alın ve sadece protoplastların kurtarıldığını doğrulamak için mikroskop altında çözeltinin 10 mikrolitrelik aliquot'unu kontrol edin.
Dönüşüme başlamak için, tek bir rionükleoprotein çözeltisi hacmi ve donör DNA parçasının yaklaşık altı mikrogramı ile altı protoplasta yaklaşık beş kat 10'u birleştirin. Daha sonra, protoplastlar üzerinde hidrofobik bir tabaka oluşturmak ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca çözelti kuluçkaya yatmaktadır. Kuluçka sonunda, protoplast süspansiyona beş mililitre ozmotik kontrol ortamı ekleyin, çözeltiyi iyice karıştırmak için yavaşça ve yavaşça pipetleme.
Karıştırma sonra, bir gecede dakikada 80 devrimler sallayarak inkübatör protoplast çözeltisi inkübül. Ertesi sabah, beş 60 milimetrelik kültür plakaları arasında çözüm bölün. Her plaka hygromycin B mililitre başına 30 mikrogram ile desteklenen ozmotik kontrol orta agar 10 mililitre ekleyin ve yavaş yavaş karıştırmak için her plaka döndürün.
Hygromycin B iki her plaka mililitre başına 40 mikrogram ile desteklenen ozmotik kontrol orta agar 10 mililitre eklemeden önce ayarlamak için agar ilk katmanı izin verin. Agar ikinci tabaka ayarlamak için izin sonra, tek izole agar her iki tabaka ile büyüyen görülebilir kadar 25 santigrat derece kültürleri kuluçka. Başarılı bir şekilde dönüştürülmüş izole kurtarmak için, hygromisin mililitre başına 50 mikrogram ile desteklenen taze malt özü agar plakaları bireysel büyüme yeteneğine sahip izole transferi B.To mantar heterothallic yetenekleri üzerinde hedeflenen gen bozulması etkilerini değerlendirmek, co-inoculate taze malt özü agar orta bir mutant zorlanma yanı sıra karşı cinsten bir gerginlik ile.
H.omanensis ile çalışırken, kapak ama plakaları mühür yok. Tabakları yedi gün oda sıcaklığında yerleştirin. Kuluçka sonunda, cinsel yapıların üretimi için görsel olarak değerlendirilir.
Mutant suş homotoritmik yeteneklerini test etmek için, ilgi mutant zorlanma ile taze malt özü agar orta aşılamak ve gösterildiği gibi bir hafta boyunca oda sıcaklığında plaka kuluçka. Çalışılan mantar büyüme hızı üzerindeki bozulmaetkilerini değerlendirmek için, misel kaplı agar fişleri oluşturmak ve taze malt özü agar orta aşılamak için ilgi her mutant ve yabani tip zorlanma kültürünün aktif büyüyen kenarlarına büyük bir steril pipet ucu arka eklemek. Kültür türübaşına en az üç çoğaltma yapılmalıdır.
20 santigrat derece büyüme üç gün sonra, iki dik çapları her plaka büyüme ölçmek. Protokol için başlangıç malzemesi olarak kullanılan Conidia çimlenme ve genç mikroplar haline gelene kadar büyümeye izin verilir. Bu gibi olgun misel iplikçiklerinin bozulmaiçin çok olgun olduğunu ve kullanılmaması gerektiğini unutmayın.
Hücreler artık hücre duvarları olmadığında, mekanik bozulmaya karşı çok hassas hale gelirler ve dönüşüm için hasat edilebilen yuvarlak protoplastları serbest bırakmalarını sağlarlar. Protokolün başarısı mutant suşlarının testotipik analiziyle doğrulanabilir. Bu mutant MAT 127 izole için, vegetatif radyal büyüme hızı önemli ölçüde azaldı, yeni çiftleme geni için pleiotropik bir etki düşündüren.
Ayrıca, mutant izole kuluçka birkaç gün içinde tüm cinsel döngü tamamlanan vahşi tip izole göre cinsel sporlar üretmek vermedi sadece olgunlaşmamış cinsel yapılar üreten bir cinsel döngü tamamlayarak aciz oldu. RNA çok hassastır ve çok kolay bozulur. Bu nedenle, temiz bir çalışma ortamı ve buz üzerinde hızlı bir şekilde çalışmak bu deneyin başarısı için de gereklidir.
Mutant izole başarılı bir şekilde üretildikten sonra, karakterize edilen gen için uygun olarak henotibik veya RNA-seq analizine tabi tutulabilirler.
