저자는 이러한 연구에 대 한 재정 지원을 제공 하는 알콘 감사.

1. 인간 각막 상피 세포 배양
<ol><li>콜라겐 코팅 75cm2 플라스크에서 불멸의 HCEC19를 성장시켰으며, 덜벡코의 수정된 이글 중간/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12)는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린/스트렙토마이신(COS)을 37°C로2%로 성장시켰다. 참고: 흔들림은 필요하지 않습니다.</li>
	<li>매 2-3 일 마다 미디어를 변경합니다.</li>
</ol>2. 테스트를 위한 세포 준비
<ol><li>세포가 거의 수렴 된 후 배양 매체를 제거합니다.</li>
	<li>각 75cm2 플라스크에 세포 분리 용액4-6 mL을 추가합니다. 세포가 분리 될 때까지 37 °C에서 세포를 배양 (약 20-30 분), 주기적으로 현미경하에서 확인.</li>
	<li>각 75cm 2 플라스크에 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12의2-6 mL을 추가합니다.</li>
	<li>플라스크의 내용을 50mL 원심분리기 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>세포를 원심분리하여 450-500 x g에서 5분 동안 분리합니다. 상체를 피우고 미리 데워진 미디어에서 셀을 다시 중단합니다.</li>
	<li>혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 총 1 x 105 셀을 포함하는 미디어의 볼륨을 계산합니다.</li>
	<li>48 웰 콜라겐-1 코팅 배양 플레이트의 각 웰에 1 x 105 셀을 추가합니다. 우물의 마지막 미디어 볼륨이 10 % FBS와 문화 DMEM / F12의 0.5 mL되도록 우물에 충분한 미디어를 추가합니다. 참고: 인공 눈물 제제는 HCEC의 대사 활성의 감소에 의해 측정될 수 있는 세포 독성을 일으키는 원인이 될 수 있다. 데이터의 일관성은 시드를 할 때 각 웰에 동일한 수의 HCEC를 추가하는 데 따라 달라집니다. 48웰 플레이트에 권장되는 배양 농도는 1 x 105입니다. 포유류 세포는 재중단 후 원심분리기 관에 정착할 수 있기 때문에 세포 현탁액이 HCEC를 동등하게 분배하도록 세포를 세포로 파종하는 동안 자주 동요하여 세포를 재중단하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>세포를 37°C및 5%CO2에서 24시간 동안 배양한다.</li>
</ol>3. 탈수 프로토콜 없음
<ol><li>제어 절차<ol>
<li>24h 배양 후 플레이트에서 배양 매체를 제거한다.</li>
		<li>테스트 제형 및 미디어 제어 솔루션의 150 μL로 즉시 처리합니다.</li>
		<li>37°C에서 세포를 배양하고 30분 동안 5%CO2를 배양합니다.</li>
		<li>셀에서 테스트 솔루션을 제거합니다.</li>
		<li>신진 대사 활성을 테스트하기 위해 10 % 대사 염료 용액의 0.5 mL을 추가하십시오. 세포를 37°C및 5% CO2에서4시간 동안 배양한다.</li>
		<li>4h 인큐베이션 기간 후, 각 우물에서 100 μL의 대사염염액을 제거하고 각 100 μL을 96웰 플레이트의 우물에 넣습니다.</li>
		<li>형광판 판독기(재료표)를 사용하여 각웰의형광을 측정합니다. 540 nm에서 흥분 파장을 설정하고 590 nm에서 방출 파장을 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>탈수 프로토콜 없음(복구 절차)<ol>
<li>3.1.1-3.1.4 단계를 반복합니다.</li>
		<li>각 웰에 DMEM/F12 용지0.5mL를 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 18h 및 5% CO2에대한 1세트의 배양을 배양한다.</li>
		<li>미디어를 제거하고 10% 대사 염료 용액의 0.5mL를 추가합니다. 3.1.6 및 3.1.7 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 탈수 프로토콜
<ol><li>제어 절차<ol>
<li>24h 인큐베이션(단계 2.8)이 끝나면 플레이트에서 배양 매체를 제거한다.</li>
		<li>테스트 제형 및 미디어 제어 솔루션의 150 μL로 즉시 처리합니다.</li>
		<li>37°C에서 세포를 배양하고 30분 동안 5%CO2를 배양합니다.</li>
		<li>셀에서 테스트 솔루션을 제거합니다.</li>
		<li>세포를 37°C 및 45% RH 챔버에 5분 동안 배치하여 세포를 담정합니다.</li>
		<li>신진 대사 활성을 테스트하기 위해 10 % 대사 염료 용액의 0.5 mL을 추가하십시오. 세포를 37°C및 5% CO2에서4시간 동안 배양한다.</li>
		<li>4h 인큐베이션 기간 후, 각 우물에서 100 μL의 대사염염액을 제거하고 각 100 μL을 96웰 플레이트의 우물에 넣습니다.</li>
		<li>형광판 판독기를 사용하여 각 우물의 형광을 측정합니다. 540 nm에서 흥분 파장을 설정하고 590 nm에서 방출 파장을 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구 절차<ol>
<li>4.1.1-4.1.5 단계를 반복합니다.</li>
		<li>각 웰에 DMEM/F12 용지0.5mL를 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 18h 및 5% CO2에대한 1세트의 배양을 배양한다.</li>
		<li>미디어를 제거하고 10% 대사 염료 용액의 0.5mL를 추가합니다. 4.1.7 및 4.1.8 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>미디어 제어의 평균 형광을 계산합니다. 다음 수식을 사용하여 샘플의 백분율 실행 가능성을 계산합니다. 샘플의 % 생존가능성 = 시험 샘플 형광/미디어 제어 형광 x 100 참고: 미디어 제어 평균은 100% 실행 가능성이 높습니다. 대사 염료 자체는 그것과 관련된 소량의 형광을 가지고 있습니다. 대사 염료 시약의 형광은 미디어 제어에 대한 테스트 샘플의 % 생존가능성을 계산하기 전에 제어 및 시험 샘플 형광으로부터 차감될 수 있다.</li>
	<li>제어 및 테스트 샘플에서 동일한 분산에 대한 정상 테스트 및 테스트를 수행합니다.</li>
	<li>정상 테스트가 통과하고 분산이 같으면 단방향 ANOVA를 수행합니다. 특정 그룹 간의 중요한 차이점을 식별하려면 호크 테스트 후 쌍별 비교(예: Tukey 또는 Dunnett의 여러 비교 테스트)를 수행합니다.</li>
	<li>정상 테스트가 통과하고 분산이 다른 경우 Welch의 ANOVA를 수행합니다. 특정 그룹 간의 중요한 차이점을 식별하려면 호크 테스트 후 쌍별 비교(예: 던넷 또는 게임-하웰 다중 비교 테스트)를 수행합니다.</li>
	<li>정상 테스트가 실패하면 비파라메트릭 테스트(즉, 크루스칼-월리스 테스트)를 사용하십시오. 특정 그룹 간의 상당한 차이점을 식별하려면 Hoc 테스트 후 쌍별 비교(즉, Dunn의 테스트)를 수행합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Maurer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+acute+corneal+injury+in+rabbits+with+surfactants+of+different+type+and+irritancy.">Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).</li><li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells.">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li><li>Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alamar+blue+reduction+for+the+in+vitro+assay+of+hepatocyte+toxicity.">Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity.</a> Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation.">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li><li>Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+artificial+tears+against+desiccation+in+cultured+human+epithelial+cells.">Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells.</a> Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).</li><li>Ubels, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+investigation+of+the+efficacy+of+an+artificial+tear+solution+containing+hydroxypropyl-guar+as+a+gelling+agent.">Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent.</a> Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).</li><li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium.">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li><li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration.">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li><li>Matsuo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+protects+corneal+epithelial+cells+from+death+by+drying.">Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying.</a> British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients.">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells.">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li><li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trefoil+factor+family+peptide+3+(TFF3)+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro.">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li><li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts:+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights.">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li><li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease.">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li><li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li><li>Zachari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Alamarblue+Assay+for+Adherent+Cell+Irradiation+Experiments.">Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments.</a> Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Benelli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systane+lubricant+eye+drops+in+the+management+of+ocular+dryness.">Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness.</a> Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).</li><li>Davis, R. 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M., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+Lipid-Based+Products+in+the+Management+of+Dry+Eye+Disease.">Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).</li><li>Lievens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+enhanced+viscosity+artificial+tear+for+moderate+to+severe+dry+eye+disease:+A+multicenter,+double-masked,+randomized+30-day+study.">Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).</li></ol>

세 작가(레카 랑가라얀, 하워드 에이 케텔슨, 락슈만 서브바라만)는 알콘의 직원이다. 알콘은 이 프로젝트의 자금 조달 및 후원자의 유일한 원천입니다. 린든 W. 존스, 지난 3 년 동안, 다음과 같은 회사에서 연구 지원 또는 강의 명예를 받은: 알콘, 알레르겐, 콘타맥, 쿠퍼 비전, GL Chemtec, 인플라맥스 연구, J&J 비전, 메니콘, 자연의 방법, 노바티스, PS 치료, 산텐, 샤이어, 시력 유리와 비전. 린든 존스는 컨설턴트이자/또는 알콘, 쿠퍼비전, J&J 비전, 노바티스 및 오브텍스의 자문 위원회에서 활동하고 있습니다. 저자의 다음 목록은 공개 할 필요가 없습니다 : 리처드 도, 데이비드 J. 맥칸나, 아델레인 수코, 대릴 엔스톤, 자야 댄탐.

이 프로토콜은 세포 건조에 대한 인공 눈물 용액의 보호 효과를 결정하도록 설계되었습니다. 처음에 세포는 세포를 코팅하기 위해 안구 안약에 노출됩니다. 다음으로, 세포는 건조되고, 대사 활성은 제형이 탈수 스트레스의 해로운 효과를 완화할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 모니터링된다. 이 단계는 안구건조기 제형이 각막 상피 세포의 전반적인 생존가능성에 미칠 수 있는 전반적인 충격을 이해하는 데 중요합니다.
대부분의 안구건조건조제가 배양 우물에서 제거된 후, 세포와 접촉하는 나머지 분자의 화학은 세포 건조에 영향을 미칩니다. 일부 제품에는 세포 증발을 최소화하는 오일의 미세에멀젼(20)이포함되어 있습니다. 헹구기 후 마찰 분석을 평가한 연구는 안구건조증제형(21)의주거 시간을 나타내는 지표가 될 수 있는 일부 안구건조증 제형에 대한 낮은 마찰유지를 보여주었다. 이 분석의 한계 중 하나는 탈수 보호가 다른 안약 제형에 비해 평가될 수 있지만 이 보호의 지속 기간은 짧은 건조 시간 으로 인해 결정될 수 없다는 것입니다. 이 시험관 내 분석에서 건조 시간이 길어지면 세포 단층보다 전반적으로 수분 함량이 더 많은 다층 배양을 사용해야 할 수 있습니다.
세포상제형에 대한 구체적인 배양 시간 및 건조 시간의 지속 시간은 온도 및 습도 값이 변경될 경우 조정될 필요가 있을 수 있다. 안구건조증에 기여할 수 있는 환경스트레스 조건을 시뮬레이션하기 위한 온도, RH 및 공기 흐름을 선택하는 것은 계절및 지역 환경 조건이 매우 가변적이기 때문에 어려울 수있다. 인간 연구를 위한 현대환경챔버는 5°C와 35°C, RH 사이의 온도를 5%에서 95%22사이로변화시킬 수 있다. 증발계와 단단히 장착된 고글을 사용하여 40-45%의 RH에서 각막으로부터의 증발율은 0.037 μL/cm2/min및RH 20-25%로 증발율은 0.065 μL/cm2/min23이었다. 시험관내 모델이비행기(15),사막, 또는 건조한 실내환경(16)과같은 매우 낮은 RH 조건하에서 제형의 보호 효과를 보고 있는 경우, 인큐베이션 시간은 세포로부터의 향상된 증발속도를 수용하기 위해 감소될 필요가 있다. 인간의 눈물액에서, 메이보미안과 다른 땀샘에서 파생된 다양한 지질이 존재하여 증발로부터 눈물을 보호합니다. 이 지질은 다른 융점24를가지고 있습니다. 온도 변화는 눈물 액의 유동성에 영향을 미칠 수 있으므로 주변 온도에서 수행 된 테스트는 37 °C에서 수행 된 테스트보다 크게 다른 증발 속도를 가질 수 있습니다. 평균 안구 표면 온도 범위는 32.9 ~ 36°C25이기때문에, 이 온도 범위 근처에서 시험을 수행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에 사용되는 대사 염료(alamarBlue) 외에도 세포 대사 활동에 대한 제품 제형의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있는 다른 화학 시약이 있다. 테트라졸륨 염(MTT, XTT, MTS, WST)은 사용할 수 있는 대체 화학물질입니다. 테트라졸륨 염의 차이는 MTT가 양전하 분자이므로 살아있는세포(26)의세포질에 들어갈 수 있다는 것입니다. MTT는 NAD(P)H27에의한 감소 후 용해되지 않게 된다. 플레이트 판독기에서 흡광도를 읽기 전에 용해성화되어야 합니다. 다른 테트라졸륨 염은28로음하로 충전된다. 그(것)들은 세포를 입력하고 세포 내 분자(29)와직접 상호 작용할 수 없기 때문에 살아있는 세포 외부의 이차 분자에 의해 감소되어야 합니다. XTT, MTS 및 WST-1 아세의 경우 전자 커플링 에이전트 1-메톡시 페나진 메토술페이트(PMS)를 첨가하면아세서(30)의성능을 향상시킬 수 있다. tetrazolium 염을 사용 하는 대사 assays와는 달리, alamarBlue 추가 용용 또는 전자 커플링 에이전트를 필요로 하지 않습니다. 또한, XTT, MTS 또는 WST-1과 달리, alamarBlue는 세포막을 관통하고 세포효소(27,29)에의해 직접 감소될 수 있다. alamarBlue를 테트라졸륨 염에 직접 비교한 결과, AlamarBlue는 HCEC3,27,31,32등 다양한 세포주의 대사 활성을 평가하기 위해 더 민감하다는 것을 보여주었다.
다른 생화학적 종점은 또한 탈수에 의한 인간 각막 상피 세포의 보호를 평가하기 위한 고려될 수 있습니다. 형광염염료는 세포막 투과성 및 세포 에스트라아제 활성1을검출하는 데 사용될 수 있다. 또한, 세포 표면에 세포 표면에 석멸 마커에 대한 염색또는 카스파제 활성1,33을측정함으로써 세포 세포 에 스테인싱하여 세포 세포증을 검출할 수 있다. 다른 assays는 HCEC 꽉 접합34에안과 제품의 효과를 결정했다. 이러한 논문은 이 문서에 설명된 탈수 절차를 활용하여 향후 평가에 포함될 수 있습니다.
안구건조증의 원인은 여러 가지가 있습니다. 안구 건조증은 눈물의 분비 감소, 안구 표면 염증 증가 또는 안구 표면의 탈수 증가로 인해 발생할 수 있습니다. 건조 조건 동안 건조에서 그들의 세포를 방지 하는 안구 건조 방울의 증발 안구건조증 사용 이 개인에 대 한 안구 건조의 증상을 완화수 있습니다. 일부 안구 건조증 제제의 문제 중 하나는 안구 표면에 해를 끼칠 수 있는 방부제의 존재입니다. 부상당한 세포가 탈수 스트레스(35)에더 취약하기 때문에 더 많은 세포가 죽을 수 있으므로 세포를 손상시키는 것은 안구 건조 환자에게 도움이되지 않습니다.
Garrigue 외.36에 의해 최근 검토 기사는 지질 기반 제품이 증발 안구건조증을 완화하기 위해 어떻게 작용하는지에 대한 현재의 지식의 평가를 제공합니다. 지질 결핍 눈물에 지질을 추가하면 증발을 방지 할 수 있으므로 세포가 건조로부터 보호됩니다. 또한, 군수제는 안구표면(37)에서물을 유치하고 유지하는 분자이다. 용액 #1 글리세린과 용액의 프로필렌 글리콜 #3 모두 부추관입니다. 용액 #3 제형 성분의 지질 및 후유성 특성 때문일 수 있는 HCEC의 더 큰 보호 효과를 보였다.
이 프로토콜은 안구건조증 제형에 노출된 후 HCEC의 대사 활성을 평가하고 건조 스트레스를 평가하도록 설계되었습니다. 이 문서에 설명된 방법을 사용하여 증발성 안구건조증을 앓고 있는 사람들을 위해 새로운 비자극성 및 보호 점안액을 개발할 수 있습니다.

다용량 안과 용액의 많은 다른 성분은 안정성, pH, 발진 및 효능을 유지하기 위해 필요합니다. 그러나, 안구 솔루션에서 방부제 또는 계면활성제와 같은 일부 화학 물질은 각막 상피1,2에손상을 일으킬 수 있다. 인간 각막 상피 세포(HCEC)를 이용한 세포 생존성 테스트는 안과 제제에서 이러한 다양한 성분에 의한 잠재적 손상을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 세포 손상을 평가하는 데 특히 유용한 체외 분석 중 하나는 alamarBlue 분석3이다. 이 분석에서, 대사 염료 (즉, alamarBlue)는 세포 생존 성 지표로 작동하는 레사쥐린을 포함합니다. 세포 호흡 동안, 레사쥐린은 전자4를받아들이면 레스소루핀으로 감소된다. 레소루핀의 감소는 비형광 분자에서 분광성계5를사용하여 검출될 수 있는 형광 분자로의 변화를 일으킨다.
이 조사는 각막 상피 세포의 2개의 다른 처리를 사용하여 안구건조구건조기 제품이 체외 모형에서 어떻게 능력을 발휘할 수 있는지 결정하기 위하여. 첫 번째 평가에서, 세포는 30 분 동안 이러한 제품으로 처리된다. 치료 후, 세포는 안구건조건조건조제품에 노출된 직후와 회복 시간 간격 이후에 대사 활성을 평가한다. 이 평가는 습도 챔버에서 건조하기 전에 세포에 이러한 제품의 효과를 결정합니다. 이러한 솔루션에서 용액 방부제, 계면 활성제 또는 완충제는 대사 염료를 사용하여 검출될 수 있는 세포에 약간의 세포독성 효과가 있을 수 있다.
두 번째 평가는 안구건조에 노출된 후 세포의 대사 활성을 결정한다. 이 평가에서, 제품 치료가 탈수 손상으로부터 세포에 대한 보호를 제공하는 경우, 세포의 대사 활성은 유지될 것이다. 건조의 유해한 영향으로부터 세포 보호는 안구 건조의 유해한 영향으로부터 발생하거나 제품이 세포에 수분을 추가하는 주변환경으로부터 액체를 흡수할 수 있는 경우 발생할 수 있다.
이 프로토콜은 세포에 대한 환경 스트레스의 심각한 조건을 시뮬레이션하도록 설계되었습니다. 다른 연구는 이 외부 응고를 만들기 위하여 각종 모형을 이용했습니다. 일부 연구는 라미나르 유동 후드6,7,8에서세포를 건조한 반면, 다른 연구는 실온 및 다양한 상대 습도(RH) 값을9,10,11로사용했다. 안구건조증 상태를 시뮬레이션하는 방법은 인큐베이팅용액(12,13)의진동을 증가시키는 것이다. 불리한 환경 조건을 시뮬레이션하기 위한 또 다른 체외 방법은 안구건조증 환자의 눈물액을 시뮬레이션하기 위해 세포 매체에 사이토카인을 첨가하여14. 이 시험은 화학 물질이 삼투압응을 감소시키는 방법을 평가하거나 면역 계통을 자극할 수 있는 흥미로운 모형이지만, 이 모형은 화학 제형이 탈수 긴장에서 세포를 보호할 수 있는 방법을 직접 보여주지 않습니다.
탈수 모델은 온도/습도 챔버 37°C 및 45% RH를 사용합니다. 안구 표면에서 증발을 일으킬 수 있는 환경 조건을 시뮬레이션합니다. 비행기캐빈(15)이나 겨울철 실내 환경에서 발견되는 습도가 낮거나16년 동안 실내 환경에서 발견되는 다른 극단적인 환경 조건의 시뮬레이션도 이 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다.
세포 배양 모델링은 인간 각막에 대한 건조 응력의 효과를 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 세포 스트레스를 감지하기 위해 세포 생존 가능성 테스트는 세포 건강에 미치는 영향을 결정하기 위해 수행됩니다. 몇몇 다른 생리학적 시험은17의스트레스를 받는지 결정하기 위하여 세포에 수행될 수 있습니다. 이 시험 절차에서 수행된 분석은 시판되는대사염(재료표)을 사용한다. 그것은 비 독성, 성장 매체에 용해하고 세포 고정없이 세포를 평가 할 수 있다는 점에서 많은 다른 세포 스트레스 테스트에 비해 장점을 갖는다18. 이 절차에서 세포는 각 치료 직후 대사 활성을 테스트하고 두 번째 세포 세트는 성장 매체로 다시 배치되고 18 h 회복 후 평가됩니다. 회복 기간 이후에 즉시 테스트하는 이유는 대사 활동과 지연된 효과를 유발하는 세포 손상에 즉각적인 영향을 미치는 세포 손상을 식별하기 때문입니다. 또한, 이러한 제제가 단기 대 장기 손상에 미치는 영향과 초기 모욕으로부터 복구/복구하지 않는 제제의 능력을 평가할 수 있는 기회를 제공한다.
이 조사는 건조유무의 HCEC 대사 활동에 미치는 영향에 대해 다양한 지질 함유 안구건조증 제품을 비교하는 데 사용됩니다. 테스트된 안구건조기 제품의 성분은 재료표에기재되어 있다. 용액 #1 성분은 카복티메틸셀룰로오스 나트륨(0.5%), 글리세린(1%), 폴리소르바테 80(0.5%), 용액#2 광광유(1.0%) 및 미네랄 오일(4.5%)과 용 #3액에서 지질은 미네랄 오일과 프로필렌 글리콜이 데물입니다. 이러한 지질은 건조로부터 HCEC의 보호를 제공할 것으로 예상되는 제형 성분이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>There is No Phenol Red in this media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169&#8211;72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity/Temperature Chamber</td>
			<td>Associated Environmental Systems</td>
			<td>LH-1.5</td>
			<td>Economy Line Humidity Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100X concentration so add 1ml to each 99ml of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Optive Advanced (solution #1)</td>
			<td>Allergan, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soothe XP (solution #2)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Complete (solution #3)</td>
			<td>Alcon Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD&#174; (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation

결핍된 눈물 지질 층의 복원에 의한 눈물 증발을 줄이기 위해 인공 지질 함유 눈물 제형이 개발된다. 세포 탈수를 방지하는 인공 눈물 제형은 안구 표면 보호 및 세포 대사 활동의 유지 를 초래할 것이다. 탈수 하는 동안, 세포 신진 대사 활동의 손실 및 이후 세포 죽음의 과정을 겪고. 이 작품은 인공 눈물 제형의 효능을 평가하는 방법을 설명합니다. 대사 염료 (즉, alamarBlue)는 낮은 형광 분자 resazurin에서 실행 가능한 세포에서 형광 분자 resorufin로 변경됩니다. 인공 눈물 제형의 생물학적 성능은 (a) 세포 생존가능성을 유지하고 (b)가 탈수로부터 세포 보호를 제공하는 제형의 능력으로 측정된다. 성장 매체와 식염수는 세포 생존/탈수 검사에 대한 컨트롤로 사용됩니다. 세포는 30분 동안 테스트 용액으로 배양한 다음 37°C에서 0 또는 5분 및 상대 습도 45%로 건조됩니다. 세포 대사 활동은 초기 노출 후 및 세포 건조 후 결정된다. 결과는 세포 대사 활동 및 탈수 보호에 안약 제형의 비교 효력을 보여줍니다. 이 방법은 증발 성 안구 건조증을 가진 개별을 취급하도록 디자인된 안구 건조제 제형을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다.

3개의 안구건조도 제형을 비교하는 연구 결과에서 결과는 도 1에도시된다. 이 수치는 3개의 제품, 솔루션 #1, 솔루션 #2 및 솔루션#3(재료표)가HCEC의 생존가능성에 미치는 영향에 차이가 있음을 보여줍니다. 해결책 #1 및 해결책 #2 건조하기 전에 HCEC의 대사 활동에 중요한 영향을 미쳤습니다. 즉, HCEC의 대사 활성을 방해할 수 있는 이러한 제품에 제형 성분이 있다. #1 용액에 노출된 세포의 18h 회복 후 발생한 세포 대사 활동의 추가 하락은 HCEC가 처음에 부상을 입었으며 18시간 이후에 는 부상이 복구되지 않았다는 것을 보여줍니다. 비교에서, 해결책 #3 HCEC의 신진 대사 활동에 온화한 효력이 있었습니다.
도 2는 이러한 지질 함유 안구건조증제의 세포 보호 효과를 나타낸다. 18h 회복 간격에서 거의 0% HCEC 대사 활성으로, 용액 #1 및 용액 #2 탈수 스트레스로부터 세포를 보호하지 못했습니다. 그러나 솔루션 #3 탈수 스트레스에 대한 일부 보호를 제공했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg"> 그림 1: 안구건조증 지질 강화 제품의 효과로 세포 생존가능성에 영향을 미칩니다. 지질 함유 안구건조증 제품으로 치료 후 HCEC 대사 활성에 의해 측정된 상대적 생존가능성. * = 적절한 복구 기간 동안 미디어 제어에 비해 용액 #3, Δ = 통계적 유의(p < 0.05)에 비해 통계적 유의(p < 0.05). 막대의 높이는 평균 값을 나타내며 오류 막대는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">SD입니다.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg"> 그림 2: 건조 방지에 대한 안구건조증 강화 제품의 효과. 지질 함유 안구건조증 제형이 세포 보호에 미치는 영향. 솔루션 #1 솔루션 #2 건조 스트레스로부터 세포를 보호하지 않았고 시간이 지남에 따라 탈수 효과에서 회복되지 않았습니다. 대조적으로, 해결책 #3 탈수 응력에 대하여 몇몇 보호를 제안했습니다. * ※ p < 0.05 용액 #3 상대적이며, Δ = p< 0.05 처리되지 않은 (대조군) 매체에 상대적 적절한 복구 시간. 막대의 높이는 평균 값을 나타내며 오류 막대는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">SD입니다.</a>

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Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

이 프로토콜의 목적은 다른 인공 눈물 제형이 체외 모델을 사용하여 건조로부터 인간의 각막 상피 세포를 보호 할 수 있는지 평가하는 것입니다. 인공 눈물 제형 및 탈수에 노출 된 후, 인간 각막 상피 세포는 대사 활성을 위해 평가됩니다.

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

effect-artificial-tear-formulations-on-metabolic-activity-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

3.8K 조회수.  Alcon Vision, LLC. 이 프로토콜의 목적은 다른 인공 눈물 제형이 체외 모델을 사용하여 건조로부터 인간의 각막 상피 세포를 보호 할 수 있는지 평가하는 것입니다. 인공 눈물 제형 및 탈수에 노출 된 후, 인간 각막 상피 세포는 대사 활성을 위해 평가됩니다.

비디오: Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating and exposing these cells to mainstream cigarette smoke (CS), in order to study epithelial cell responses to CS exposure. The protocol consists of three parts: the isolation of airway epithelial cells from mouse trachea, the culturing of these cells at air-liquid interface (ALI) as fully differentiated epithelial cells, and the delivery of calibrated mainstream CS to these cells in culture. The ALI culture system allows the culture of respiratory epithelia under conditions that more closely resemble their physiological setting than ordinary liquid culture systems. The study of molecular and lung cellular responses to CS exposure is a critical component of understanding the impact of environmental air pollution on human health. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and other tobacco-related diseases, which represent major global health problems.

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating, culturing and exposing these cells to mainstream cigarette smoke, in order to study molecular responses to this environmental toxin.

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

연구

의학

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective mining of the information in the large-scale datasets that are obtained from gene expression microarrays, deep sequencing experiments or metabolic profiling is essential to uncover and then effectively target the critical regulators of diseased cell phenotypes. Estrogen Receptor &#945; (ER&#945;) is one of the master transcription factors regulating the gene programs that are important for estrogen responsive breast cancers. In order to understand to role of ER&#945; signaling in breast cancer metabolism we utilized transcriptomic, cistromic and metabolomic data from MCF-7 cells treated with estradiol. In this report we described generation of samples for RNA-Seq, ChIP-Seq and metabolomics experiments and the integrative computational analysis of the obtained data. This approach is useful in delineating novel molecular mechanisms and gene regulatory circuits that are regulated by a particular transcription factor which impacts metabolism of normal or diseased cells.

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

콜라겐 - 유도 된 응집에 Pannexin1 억제제의 효과 브릴리언트 블루 FCF : 탁도는 인간 혈소판에 씻어

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

인간 태반 생리학의 통합 연구에 대한 4 혈관 샘플링 접근법<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

성장과 재생산 꼬마 선 충 의 화학 물질의 효과 측정

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).