저자는 여자를 들이 연구에 대 한 그들의 반응과 기증 감사 합니다. 우리 또한 조정 반응과의 컬렉션에 대 한 노동 및 배달 부 오 스 모자와 태아 연구 팀에 감사. 우리는 에릭 왕, 박사, 그리고 켈리 쿠오, MD 지원 감사 하 고 실험 방법 및 최적화에 도움이.
이 작품은 NIH HD076259A (오전)에 의해 투자 되었다와 AHA GRNT29960007 (오전).

placentae 프로토콜에서 동의와 제도적 검토 보드 오 레 곤 건강 과학 대학의 포틀랜드, 오 레 곤,에 의해 승인 아래는 노동 및 배달 단위 대학 병원에서 수집 된는 환자.
 1. 태 반 조직 컬렉션 <ol><li>준비 참고: 조직에서 발생 하는 모든 장비는 살 균 되어야 합니다.
	<ol><li>121에서 60 분 동안 압력가 마로 소독 하 여 해 장비를 소독 ° c.</li>
		<li>개인 보호 장비 (PPE) 사용: 연구실 코트/가운/스크럽, 장갑, 그리고 얼굴 방패 또는 고글 마스크.</li>
		<li>물 목욕과 37로 설정에 ° c.</li>
		<li>따뜻한 두 50 mL 원뿔 튜브, 완전 한 미디어의 각 포함 25 mL (Iscove &#39; s 수정 Dulbecco &#39; s 매체 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스, 표 3) 37 ° C 물 욕조에.</li>
		<li>정보 환자 동의 제왕 절 개에 의해 배달 직후 태 반 얻기.</li>
		<li>될 태 반에 익숙해져야 합니다. 탯 태아 측 (chorionic 접시)에 삽입 되 고 혈관은 탯 삽입 사이트에서 밖으로 발산 하는 보실 수 있습니다. 반대 측 어머니 쪽, 또는 기저 판입니다. 그것은 decidua cotyledons 라는 배 나무를 포함 하는 구조 포함.</li>
	</ol></li> <li>Villous 조직 샘플링 참고: Villous 조직을 최대한 빨리 배달, 가급적 30 분 또는 그 이하의 다음 태에서 샘플링 해야 합니다.
	<ol><li>Chorionic 플레이트 2-3 풀-두께 섹션 (약 2.5 c m x 2.5 c m 크기에서) 소비 세 위쪽으로 직면 하 고 무작위로, 사용 하 여 집게와가 위 ( 그림 1A)에 태 반의의 주변에서 2-3 cm. 
		참고: 방지 비정상적인 (즉 백색 석 회화) 나타나는 태 부.</li>
		<li>Chorionic, 기저 접시 및 어떤 큰 혈관 떨어져 트림.</li>
		<li>따뜻한 완벽 한 미디어에서 결과 villous 조직 ( 그림 1B, 총 약 80-120 g)를 배치 하 고 샘플링의 30 분 이내 trophoblast 격리 시작. 
		참고: 일부 다운스트림 분석 실험 및 응용 프로그램은 영향을 배달, 샘플링, trophoblast 격리 사이 대기 기간. 으로 가능 하 고 격리 사이 일관 된이 짧은 기간을 유지 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>단계-1.2.1, 1.2.2에에서 설명 된 기술을 사용 하 여 샘플 5 무작위 1 cm × 1 cm 섹션 villous 조직 전체에서 태 반 (를 포함 하 여 센터).</li>
		<li>컷으로 4-5 더 작은 조각 (약 30 mg 각), 각 1 cm × 1 cm villous 조직 샘플 2 mL microcentrifuge 튜브에 놓고 플래시 액체 N 2에 고정 합니다. 스토어 나중 분석에 사용 하기 위해-80 ° C에.</li>
	</ol></li></ol> 2. Trophoblasts Villous 조직에서의 격리 <ol><li>준비 참고: 살 균 장비를 사용 하 고 층 류 두건에 있는 셀을 포함 하는 절차를 수행.
	<li>해 동 <ol>4 냉동된 밀도 기울기 (표 1, 표 필수 소모품, 시 약, 장비, 보충 자료를 참조) 4 ° C 밤 태 도착 하기 전에에서. 
		참고: 또는, 밀도 기울기 만들어질 수 있다 고립의 날.</li>
		<li>차례 원심 분리기 및 20에 ° c. 
		참고: 모든 원심 분리 단계가 최대 가속과 감속에서 달리 지정 하지 않는 한.</li>
		<li>HEPES 버퍼링 소금물 (HBSS) Ca + 2와 Mg + 2 (표 3) 보완 x 준비 1.</li>
		<li>따뜻한 trypsin 37 ° c.</li>
		<li>약 2720 kilounits/mL에서 살 균을 희석 DNase 보충 HBSS.</li>
		<li>갓 태어난 송아지 혈 청 (NCS) 37 ° c의 따뜻한 50 mL</li>
		<li>37 완전 한 미디어 따뜻한 ° c.</li>
		<li>따뜻한 어 미디어 (90 %FBS, 10 %DMSO, 표 3) 37 ° c. 
		주의: DMSO 독성과 장갑으로 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>준비 소화 버퍼 (표 2와 3)의 308 mL를 혼합 하 여 보충 HBSS, Trypsin의 50 mL (3751.7 BAEE 단위/mL), 및 DNase의 0.5 mL (379.4 kilounits/mL) 무 균 병에서. 
		참고: villous 조직에서 세포를 분리 하는 데 필요한 대략적인 시간입니다 7 h.</li>
	</ol></li> <li>Villous 조직 처리 <ol><li>린스 50 mL 원뿔 튜브에서 villous 직물의 각 조각을 가득 실내 온도 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 반복 하 고 과잉 혈액 제거 될 때까지 필요한 만큼 PBS를 교체 (PBS 린스 됩니다 빛 빨간색 또는 분홍색 조직을 철저 하 게 씻어 서 때).</li>
		<li>Villous 조직 멸 균 페 트리 접시에 놓고 부드럽게 된다고 하 여 가능한 많은 혈관에서 현미경 슬라이드를 사용 하 여 혈관에서 부드러운 villous 조직 제거.</li>
		<li>정밀 하 게가 위를 사용 하 여 결과 villous 조직 말하다.</li>
	</ol></li> <li>Villous 조직 소화와 원유 절연 Trophoblasts <ol><li>trypsin의 구체적인 활동에 따라 계산 된 볼륨에 따라 소화 솔루션 불 임 병에 다진된 villous 조직 전송 그리고 DNase (165 mL, 표 2).</li>
		<li>후 35 분 70 분당 회전 (rpm)에서 떨고와 37 ° C 물 욕조에 외피의 기울기의 측면에 소화 병 고 소화 되지 않은 조각의 조직 병의 하단에 정착. 신중 하 게 정착된 조직 피하 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한 세우.</li>
		<li>분배는 상쾌한 50 mL 원뿔 관 사이 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해. 
		참고: 시간을 절약 하는 것이 좋습니다 두 번째를 시작 하는 나머지 소화 솔루션 (110 mL, 표 2)를 추가 하 여 소화 정착 조직 및 2.3.2 단계에서 설명한 대로 부 화를 다시 시작.</li>
		<li>부드럽게 천천히 튜브의 아래쪽에는 혈 청 학적인 피 펫에서 분배 하 여 긴장된 상쾌한 아래 NCS의 3-5 mL를 계층. (Trophoblasts 포함) 긴장된 상쾌한 NCS 사이 초승달 표시 ( 그림 2A) 되어야 합니다.</li>
		<li>20 ° c.에서 15 분 1250 x g에서 NCS에는 supernatants 원심 결과 펠 릿 trophoblast 셀 ( 그림 2B)를 포함 하는 흰색 레이어 뒤 가장 낮은 계층에서 붉은 혈액 세포를 포함 합니다.</li>
		<li>단계 2.3.2-각 (110 mL 및 추가 83.5 m, 각각, 조직, 표 2의 병에 소화 솔루션의) 두 번째 및 세 번째 소화의 2.3.5 반복.</li>
		<li>모든 supernatants centrifuged 되었습니다, 일단 따뜻한 완벽 한 미디어의 5 mL에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 다음 정지를 함께 풀.</li>
		<li>사이 두 50 mL 원뿔 튜브와 20 시 15 분 1250 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액을 분할 ° c.</li>
		<li>부드럽게는 상쾌한을 제거 하 고 따뜻한 성의 6 mL에 각 셀 펠 릿 resuspend죽어 야 지 미디어.</li>
	</ol></li> <li>밀도 원심 <ol><li>천천히 그리고 신중 하 게 전송 피펫으로와 밀도 그라디언트 상단 세포 현 탁 액을 레이어 링 하 여 4 개의 밀도 기울기 (각 3 mL) 사이 세포 현 탁 액을 분할.</li>
		<li>최소 가속 및 감속 20 ° C에서 20 분 1250 x g에 밀도 기울기 원심. 이 구별 밴드 sedimented 셀 (표 4)을 생산 한다.</li>
		<li>Trophoblast 셀 (35-50 %DGM) 사이 포함 하는 불투명 밴드 (표 4)에 도달할 때까지 천천히 그리고 신중 하 게 밀도 그라데이션 미디어 (DGM)의 상위 레이어를 제거.</li>
		<li>Trophoblast 밴드 두 50 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 따뜻한 완벽 한 미디어 입력.</li>
		<li>부드럽게 혼합 하 고 20 시 15 분 1250 x g에서 원심 튜브 3-6 회 반전 ° c.</li>
		<li>는 상쾌한을 제거 하 고 따뜻한 완벽 한 미디어의 5 mL에 각 셀 펠 릿 resuspend. 셀 정지를 결합 하 고 가능한 셀 hemocytometer 고 Trypan 블루를 사용 하 여 (또는 선호 셀 계산 방법).</li>
	</ol></li> <li>는 Hemocytometer 계산 셀 <ol><li>serological 피펫으로와 아래로 pipetting 또는 부드럽게 반전 튜브 여러 번 세포 현 탁 액을 혼합.</li>
		<li>별도 튜브에 세포 현 탁 액 및 Trypan 블루 (즉 20 µ L 각)의 동등한 부분을 결합 하 고 부드럽게 혼합.</li>
		<li>실 온에서 1-2 분 동안 품.</li>
		<li>부드럽게 15-20 µ L 셀 Trypan의 분배는 coverslip와는 hemocytometer 혼합물을 블루와 모 세관 작용에 의해 그리드에 걸쳐 확산 셀 수.</li>
		<li>계산 집계 카운터와 4 개의 4 x 4 사분면의 각 가능한 셀 (죽은 세포 물 들일 것 이다 깊은 파랑). 셀이 한 번 이상 계산 되지 않습니다 보장 하기 위해 계산의 시스템 사용 (즉, 계산 하지 않음 아래쪽 또는 왼쪽된 경계 셀). 
		참고: 각 4 x 4 사분면은 50-150 셀 사이의 포함 되어야 합니다. 너무 적은 또는 너무 많은 세포 이상 또는 휴대폰 번호의 과소에 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>10 곱하면 총 셀 4 x 4 사분면의 각각에서 계산 하는 평균 4, mL 당 셀의 수를 계산 하려면 희석 비율 (세포 현 탁 액을 Trypan 파랑)을 곱하면.</li>
		<li>총 양의 세포 현 탁 액 총 셀 수율을 계산 하 여 mL 당 세포의 수를 곱하면. 
		참고: 약 100 백만 셀 villous 조직의 80-120 g로 시작 하는 격리에서 예상 된다.</li>
	</ol></li> <li>도금 셀 <ol><li>3 백만 셀/잘 (3.3 c m 2 당 10 5 셀 x)는 6-잘 접시 (잘 당 서 스 펜 션의 2 개 mL) 접시 부드럽게 앞뒤로 바위 하 고 균일 하 게 배포 셀 측면에 사이드. 
		참고: Trophoblasts 제대로 준수를 취급 하는 조직 문화 접시 필요 합니다. 세포의 단층 syncytialization를 홍보 하는 데 필요한.</li>
		<li>떠나 약 30 분을 균등 하 게 배포, 정착, 인큐베이터에 배치 하기 전에 우물의 바닥에 고착 하기 시작 셀 수 있도록 층 류 두건에 도금된 셀.</li>
		<li>문화 셀 (와 매일 미디어 변화) 5% CO 2와 95%의 습도와 37 ° C 배양 기에서 최대 72 h. 
		참고: trophoblasts 문화의 모든 24 h x 10-20에 현미경으로 검사 합니다. Trophoblasts 증식 하지 않습니다 하 고 passaged 수 없습니다. 문화의 72 h 동안 라운드 개별 trophoblasts syncytium ( 그림 3A , B)를 형성 하기 위하여 융합.</li>
	</ol></li> <li>동결 세포 <ol><li>에서 1250 x g 20에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 사용 하지 않는 셀을 작은 ° c.</li>
		<li>펠 릿에서 가능한 많은 미디어를 발음.</li>
		<li>미디어 (표 3)에 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>동결 냉동 컨테이너 100% 소 프로 파 놀으로 가득-80 ° C에서 aliquots. 전송 냉동된 aliquots 액체 N 2 장기 저장에 대 한 다음 날. 
		참고: 세포는 동결 후에 경작 수.</li>
	</ol></li> <li>녹고 셀 <ol><li>냉동된 세포의 약 수를 제거 하 고 소용돌이 동안 37 ° C 물 욕조에 녹여. 바로 전에 완전히 액체에 해 동에 약 수 물 목욕에서 제거.</li>
		<li>해 동된 셀 15 ml 원뿔 튜브에 즉시 전송. 간헐적으로 혼합과 완전 한 미디어의 10 mL를 추가 시작, 처음에 둔화.</li>
		<li>혼합 튜브 여러 번 반전.</li>
		<li>20 ° c.에서 10 분 동안 200 x g에서 원심 분리기</li>
		<li>는 상쾌한 발음 하 고 따뜻한 완벽 한 미디어의 2-5 mL에 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>셀 및 앞에서 설명한 접시 계산.</li>
	</ol></li></ol> 3. 치료와 TNFα, 세포 Lysates의 컬렉션 서 부 럽 기본 Trophoblasts <ol><li>준비 <ol><li>37 완전 한 미디어 따뜻한 ° c.</li>
		<li>사용에 대 한 준비까지 완전 한 미디어에-20 ° C에 게 TNFα의 10 µ g/mL 재고 확인.</li>
		<li>완전 한 미디어 셀 치료를 준비 하는 경우에 TNFα의 작업 사진 1 µ g/mL 확인 합니다. 시리얼 TNFα 작업 사진 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 그리고 완전 한 미디어에 125 pg/mL로 희석. 
		참고: 10 4 pg/mL의 TNFα 농도 적당히 세포 독성. 테스트 TNFα 농도의 조정 원하는 다운스트림 응용 프로그램의 특성에 따라 달라 집니다.</li>
	</ol></li> <li>치료 셀 TNFα <ol><li>문화의 24 시간 후 배양 세포에서 발음 및 TNFα의 2 개 mL 바꿀 보충 6 잘 플레이트 (치료 및 차량 당 적어도 2 개의 우물에 잘 당 미디어 제어).</li>
		<li>후 24 h 문화 (48 h), TNFα-노출의 완전 한 미디어 TNFα 보충 매체 바꿉니다.</li>
	</ol></li> <li>수확 셀과 총 단백질 <ol><li>문화 (TNFα의 제거 과거 h 24)의 72 h 후 미디어 발음, 실내 온도, PBS로 세포를 부드럽게 씻어 하 고 얼음 감기 Radioimmunoprecipitation 분석 결과의 80 µ L을 추가 갓 들어 버퍼 (RIPA) 직접 각 잘 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 (표 3)을 추가.</li>
		<li>셀 스 크레이 퍼와 접시에서 셀을 제거합니다. 치료 그룹 내에서 우물을 풀링 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀 전송.</li>
		<li>Lyse 세포 vortexing에 의해 높은 튜브 15의 적어도 3 개의 간격에 대 한 s.</li>
		<li>셀 락을 15 분으로 4 ° C에서 품 어 
		참고: 또는, 후 단계 3.3.3., 셀 수 있는 알을 품을 간헐적으로 동요와 15 분 동안 얼음에 튜브, vortexing, 또는 최대 pipetting 고 할 터치 하 여wn.</li>
		<li>반복 단계 3.3.3.</li>
		<li>작은 세포질 파편을 4 ° C에서 5 분 동안 10000 x g에서 튜브 원심.</li>
		<li>이전 상쾌한 (포함 세포 단백질)는 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 스토어-80 ° c. 
		참고: 프로토콜 여기 중지 고 나중에 다시 시작 될 수 있습니다. 그것은 세포질 단백질 샘플을 여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 몇 가지 aliquots을 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>Bicinchoninic 산 분석 결과 등 원하는 방법으로 총 단백질 농도 결정 (BCA, 필수 용품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조).</li>
	</ol></li> <li>SDS 페이지와 루비콘 또는 단백질의 관심에 대 한 서 부 럽 참고: 따라 서 부 제조 업체에 따라 프로토콜 blotting &#39; 선호 실험실 시스템을 사용 하 여 s 지시.
	<ol><li>부하 12% 아크릴에 잘 당 샘플 버퍼 (표 3)에서 총 단백질의 20-40 µ g 사이 젤. 버퍼 (표 3)을 실행에 단백질 SDS-PAGE로 분리.</li>
		<li>젖은 전송 제조 업체에 따르면 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 젤에서 단백질 &#39; s 명령을 전송 버퍼 (표 3).</li>
		<li>0.1 %Tris-Buffered 염 분에 5% 우유 가루에 막 품 어 락으로 실내 온도에 적어도 1 시간에 대 한 트윈 20 (TBST, 표 3).</li>
		<li>루비콘 1 차 항 체에 멤브레인을 품 어 (필수 소모품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조) 락 4 ° C에서 하룻밤 TBST에 1% 우유 가루에 1: 500에.</li>
		<li>TBS에서 락으로 실 온에서 막 3 x 5 분 TBST 및 1 x 5 분을 부드럽게 씻어.</li>
		<li>1: 2000-1: 5000 이차 항 체에에서 멤브레인을 품 어 (HRP 연결 또는 기본 표시 켤레 필수 소모품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조) 5 %TBST 우유 분말은 실내 온도에 적어도 1 시간에 대 한 락.</li>
		<li>3.4.5 단계에서 설명 하는 세척 절차를 반복 하 고 시각화 이미징 시스템에 적절 한 시각화 (즉 chemiluminescent) 기판으로 오 점.</li>
		<li>3.4.5 단계에서 설명 하는 세척 절차를 반복 하 고 제조 업체에 따라 기본 로드 컨트롤이 나 β-걸 막 프로브 &#39; s 지침.</li>
		<li>선호 이미지 분석 소프트웨어, 분석 식 흡 광도 (밴드 농도)의 수동 정량화 하 여 루비콘의 배경 흡 광도, 및 해당 로드를 정규화의 빼기 밴드 농도 제어. 단백질 수준에서 통계적으로 중요 한 변화에 대 한 테스트를 적절 한 통계 분석 수행.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy+Regulator+Rubicon+Is+a+Feedback+Inhibitor+of+CARD9-Mediated+Host+Innate+Immunity.">The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).</li><li>Zi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rubicon+deficiency+enhances+cardiac+autophagy+and+protects+mice+from+lipopolysaccharide-induced+lethality+and+reduction+in+stroke+volume.">Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).</li><li>Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+function+in+human+placenta+with+increased+maternal+adiposity.">Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).</li><li>Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+pregnancy:+the+role+of+the+immune+system+at+the+implantation+site.">Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site.</a> Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).</li><li>Resi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+inflammation+and+adipose+tissue+matrix+remodeling+precede+physiological+adaptations+to+pregnancy.">Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. 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Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).</li><li>Sagrillo-Fagundes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Primary+Trophoblast+Cell+Culture+Model+to+Study+the+Protective+Effects+of+Melatonin+Against+Hypoxia/reoxygenation-induced+Disruption.">Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption.</a> JoVE. (113), (2016).</li><li>Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+obesity,+inflammation,+and+developmental+programming.">Maternal obesity, inflammation, and developmental programming.</a> Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+in+serum+of+patients+with+inflammatory+bowel+disease+as+measured+by+a+highly+sensitive+immuno-PCR.">Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR.</a> Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).</li><li>Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+Rubicon+to+cross+the+Rubicon.">Binding Rubicon to cross the Rubicon.</a> Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

태 반, 태아의 성장 조절에 대 한 책임6비만 환경 손상 된 기능을 전시 한다. Trophoblasts의 높은 신진 대사 요구에도 불구 하 고 산 모 비만과 반응과 미토 콘 드 리아 기능 장애 호흡6,19전시. Placental 대사에서 변화는 합병증과 비만 임신3,,67에서 관찰 된 불리 한 태아 결과의 발생률이 증가에 기여할 수 있습니다. Autophagy는 또한 산 모 비만 반응과에 손상 됩니다. 남성 태아와 비만 임신에서 반응과 기능 장애 autophagic 플럭스 autophagosomes13의 축적에 의해 입증으로 표시. 최적의 autophagic 유량을 유지 하는 것이 중요 세포 항상성 그리고 모성 비만 반응과 결함이 autophagy 비만 임신과 관련 된 불리 한 결과 중재 하는 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.
산 모 비만 손상 placental 함수의 정확한 원인을 잘 이해 되지 않는다 고 염증 신호에 그들의 기원에 있을 수 있습니다. 비만 임신 TNFα1,4,,2021순환의 높은 수준에 의해 특징 proinflammatory 상태는. TNFα는 autophagy22,23의 활성 제 이며 비만 임신에서 반응과 autophagic 유동적에서 변화를 중재할 수 있습니다. TNFα는 일반적으로 암2의 맥락에서 특히 세포에 염증의 효과 연구 하는 데 사용 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 외 인 TNFα와 기본 trophoblasts 문화에서 치료 하 여 태 반의 기능 능력에 비만 관련 염증의 효과 연구에 대 한이 접근을 적응 시킨다.
이 프로토콜 4 개의 주요 구성 요소로 구성 됩니다: 기본 trophoblasts의 문화 TNFα 치료, 및 다음 전체 세포 lysates의 컬렉션 뒤 태 반, 기본 trophoblasts villous 조직에서의 격리에서에서 villous 조직의 샘플링 서 관심의 protein(s)의 식을 측정 하는 분석 오 점. 순수한 trophoblasts를 분리 하는 chorionic, 기저 접시는 철저 하 게 해 부 villous 조직에서 태 반 (그림 1B)의 샘플링 하는 동안 중요 하다. 그것은 또한 필수적 villous 조직 (즉 배달의 30 분) 이내에 처리 됩니다. 이 프로토콜 villous 조직의 엑스트라 세포 매트릭스에서 trophoblasts 출시 각 지속적인 35 분, 3 소화 단계의 사용을 자세히 설명 합니다. Lengthier 소화 세포 표면 단백질의 trypsinization에 의해 손상 세포를 위험. 다이제스트의 수를 증가 가능한 trophoblasts의 최종 수익률 평가할 수 있 증가 되는 것은 없습니다. 그러나, 시간 및 수 소화의 감소 귀 착될 것 이다 감소 셀 생산량 (사이먼, Bucher, 및 Maloyan, 데이터를 게시). 이 프로토콜은 안정적으로 villous 조직의 80-120 그램에서 약 100 백만 셀을 생성합니다.
구별할 수 trophoblast 밴드 격리 간 밀도 기울기에 관찰 수에 변화가입니다. 다른 세포 유형에서 오염을 방지 하려면 엄격 하 게 수집 등에 trophoblasts 밀도 그라데이션 (표 4)에 포함 된 중요 하다. 여기서 설명 하는 프로토콜 최적화는 5% 미만으로 비교적 순수한 trophoblasts 항복 이전 설립된 방법에서 다른 셀에서 오염 유형10,,1112. 더 정화는 포지티브 또는 네거티브 선택24에 의해 얻을 수 있습니다. 그러나,이 접근 가능한 trophoblasts의 수확량을 감소의 위험을 실행 합니다. 기본 trophoblasts 문화 시간 72 h 대 24 셀에 syncytialization 수술 multinucleated 세포 질량의 존재에 의해 입증 확인 후 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여 격리에서 Cytokeratin-7의 Immunocytochemical 분석 72 h, trophoblast (그림 3A , B)의 수명에 각 인 이벤트. 또한, 기본 trophoblasts 72 h에 대 한 교양 Vimentin의 immunocytochemical 분석 거의 오염 섬유 아 세포를 (그림 3C)을 공개 했다. 루틴에, trophoblasts 순도 모니터링할 수 있습니다 문화에서 간단한 형태학 평가 의해. 문화 시간 24 h, 개별 cytotrophoblasts 라운드 지배 하는 문화. Cytotrophoblasts 융합된 세포의 덩어리 인 문화, 72 h 후 syncytialization를 받 다. 가장 일반적인 오염 셀 형식이이 문화에 있는 섬유 아 세포 나 내 피 세포는 길쭉한 모양에 있는 다각형 각각 이다. 이러한 기능을 모니터링할 수 있습니다 대략 밝은 현미경을 사용 하 여.
TNFα와 기본 trophoblasts 치료 trophoblasts 중요 한 통로의 규칙에 신호 한 TNFα의 효과 측정 하 수 제어 시스템을 제공 합니다. 물론, 비만 임산부 환경에서 비보에 trophoblast 함수 변조에 대 한 책임 수 있습니다 TNFα 이외의 요인이 있다. 이들은 포함 하지만 호르몬 신호, 고 지 혈 증, 및 다른 proinflammatory 요인25의 호스트에 국한 되지 않습니다. 다른 치료의 조합 더 순수 더 정확한 방법으로 비만 자궁내 환경 전 비보 을 정리 합니다. Trophoblasts이이 프로토콜까지 치료 하는 데 사용 하는 외 인 TNFα의 농도 일반적으로 생체 내에서순환 그 초과. 혈 청 농도 또는 특정 선 동적인 조건2620 ng/mL까지 보고 되었습니다. (즉 서 부 럽) 현재 실험실 방법으로 측정 가능한 응답을 얻으려면, 그것은 유전자 발현 및 관심의 경로 있는 변화를 나타내기 위해 TNFα 농도 증폭 해야 합니다. 이러한 응답에 vivo에서 조금 있을 수 있습니다. 그러나, 그들은 수 있었다 그럼에도 불구 하 고 크게 영향 trophoblasts의 기능. 유전자 발현 및 세포 독성 효과에 뿌리 수 있습니다 통로 분석에서 아티팩트를 생성의 위험을 실행 trophoblasts TNFα의 높은 농도에 노출. 적당 한 세포 독성 trophoblasts LDH 세포 독성 분석 실험 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 입증 104 pg/mL TNFα 보충 미디어 24 h에 노출에서 관찰 되었다. 그러나, 농도 103 pg/mL TNFα 이하로 어떤 감지할 세포 죽음을 생성 하지 않았습니다.
작은 간격 및/또는 그는 여기서 설명 하는 보다 낮은 TNFα 농도 테스트 수 있습니다 최고의 뒤따라갈 양적연쇄 반응 (정량) 유전자 표정 분석, 기술에 대 한 적합 유전자 발현에서 작은 변화를 감지 합니다. 정량은 특별히 transcriptional 수준에서 유전자 표현 레벨 테스트, 하는 동안 아마도 그들의 휴대 전화 작업을 수행할 수 있는 단백질 제품의 최종 레벨 감지 부 럽. TNFα 치료 식 수준에 변화는 transcriptional의 결과 확인에 관해서는 뿐만 유전자 식 레벨의 규정에의 영향을 결정 하기 위한 강력한 접근은 함께에서 두 분석 기법을 사용 하 여 post-transcriptional, 또는 포스트 번역 상 규칙. 염증 성 스트레스 trophoblast 동작, 형태, 및 syncytialization 영향을 줄 수 있습니다. 분자 분석 접근 외에 형태학 평가 (예: immunocytochemistry)를 포함 하 여 trophoblast 건강에 TNFα 노출의 효과 대 한 보다 포괄적인 분석을 제공 합니다. TNFα 농도 테스트 및 다운스트림 분석 실험 수요에 따라의 조정 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 프로토콜을 구현 하 여 TNFα 중재 염증 upregulate 인간의 trophoblasts 루비콘 식 여성 태아와 마른 임신에서 발견 된다. Trophoblast에 루비콘에 더럽혀 서 부 lysates 근처와 140 kDa (그림 4A)의 예상된 분자량 위에 두 가지 밴드 계시. 낮은 밴드 일반적인 제안 증거 (PD047 안티 루비콘 pAb, MBL 데이터 시트, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). 여성의 trophoblasts upregulate 250 pg/mL 까지의 농도의 TNFα 치료에 루비콘의 표현 하는 능력을 보여주었다. 이, 루비콘 식 보다 높은 농도에서 레벨 감소 기준 (치료 제어) 쪽으로 다시와 아래도 (그림 4B, n = 3). 이 결과 보완 루비콘은 크게 upregulated에서 플래시-냉동 villous 조직 생 검에서 발견 하는 TNFα와 마른 임신에서 trophoblasts 치료 염증 비만 자궁내 환경에서 시뮬레이션, 마른 컨트롤에 비해 여성 태아와 비만 임신에서 반응과 (그림 4C 와 D, ANOVA, n = BMI P 당 6 &#60; 0.05).
Trophoblasts 남성 태아와 비만 임신에서 형성의 활성화 및 autophagosomes 의 축적을 전시 autophagic 플럭스 마른 컨트롤에 비해 여성 태아와 비만 임신에서 trophoblasts에 다 표시 되지 않습니다, 하는 동안 13. 루비콘 어디 그것은 autophagosome 리소좀 퓨전27중단 행동 한다 autophagy의 부정적인 레 귤 레이 터 이다. 여성 trophoblasts 있습니다 upregulate를 TNFα 중재 염증, autophagy22, 유지의 설정에서 엎드려 서 같은 autophagic 플럭스를 활성화할 수 있습니다에 대 한 보상 또는 보호 메커니즘으로 루비콘의 표현 임산부 비만입니다. 태 반에이 응답 비만 자궁내 환경에서 남성 보다 더 나은 어떻게 여성 태아 요금에 한 역할을 재생할 수 있습니다. 비만 자궁내 환경에 중요 한 통로의 규정에의 효과 연구 플랫폼을 제공 합니다 산 모 비만 비보 전 통해 TNFα와 주 인간의 trophoblasts 치료와 관련 된 염증 성 환경 모델링 trophoblasts입니다. 새로운 및 조합 치료 비만 모성 환경 업과 겨냥이 프로토콜 개정 태 반 기능에의 모성 비만 효과 연구 하는 흥미로운 수단을 제공할 것입니다.

비만 과잉 지방이 많은 직물 및 양분 가용성에서 형태소 분석 만성 낮은 학년 염증이 특징 염증 성 상태입니다. 비만, proinflammatory cytokines는 상승 된 대사 조직 뿐만 아니라 체계적으로 순환. 증거의 강력한 시체는 TNFα 크게 상승 비만의 설정에서 의미와 함께 인슐린 저항성 및 대사 부전1에 보이고 있다. TNFα의 활성화는 또한 암 등 면역, 그것에 게 매력적인 치료 대상2를 만드는 조건에서 질병 병 인에 기여.
염증 비만에서 임신, 또한 proinflammatory 상태3,4에 의해 복합입니다. 그것은 이전 보였다 태 반 TNFα 콘텐츠 여성 태아와 임신에서 모성 adiposity와 증가. 또한, TNFα 처리 TNFα는 성적으로 동종이 형 방식으로5placental 신진 대사 조절에 관여 하는 것을 건의 하는 여성만 아니라 남성 trophoblast 셀에 미토 콘 드리 아 호흡을 억제. 산 모 비만 임신 동안에, 사 산를 포함 하 여 남성 태아는 가장 취약3,6,7,8 되와 관련 된 다양 한 합병증의 발생률이 증가 . 때문에 산 모 신생아 인터페이스에서의 주요 역할, 염증 신호에 대 한 응답 비만 자궁내 환경에 태 반의 기능 용량에 변화 중재 비만 임신의 결과에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.
Cytotrophoblasts 및 syncytiotrophoblasts는 태 반의의 villous 조직에 내 분 비 신호 및 어머니와 개발 태아9영양소와 산소 교환에 대 한 중요 하다. 태아 건강 및 개발 villous cytotrophoblasts (trophoblasts 라 함)의 기능 용량에 중단 위태롭게 될 수 있습니다. 이 프로토콜 멀리 trophoblasts 기본 세포 배양에 대 한 격리에 대 한 최적화 절차를 함께 chorionic 및 기저 판 해 부하 여 villous 조직의 인간의 용어 태에서 샘플링 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 기질 trophoblasts10, 을 차동 밀도 원심 분리에 의해 뒤에서 셀 출시 villous 조직의 효소 소화와 관련 된 설립된 방법론에서 파생 된 11,12. 이 프로토콜 세부 사항 산 모 비만과 관련 된 방법을 반응과 마른 임신에서에서 기본 trophoblasts 문화 미디어 TNFα 선 동적인 환경에의 한 구성 요소를 시뮬레이션 하기 위해 보충으로 취급 됩니다. 마지막으로, TNFα 처리 trophoblasts 유전자 발현에서 변화를 감지 하 더럽혀 서 뒤에서 총 세포 lysates 수확에 대 한 간단한 절차 설명 되어 있습니다.
이 모델에는 전체에서 환경에 utero obesogenic 정리 하지 않습니다, 하는 동안 trophoblasts' 응답으로 TNFα 중재 염증의 개별 기여에 밖으로 구문 분석할 수 있도록 제어 시스템 제공 임산부 비만입니다. 이 모델 발견 하거나 직접 TNFα trophoblasts에서 신호에 의해 통제 하는 분자 목표를 확인 하는 모두 기회를 월급으로 유전자 식 패턴의 변화에서 관찰 vivo에서 모자와 반응과에서 테스트 한 비만은 TNFα 중재 염증의 결과 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법은 인간의 trophoblasts autophagy의 규제에 염증 TNFα 중재의 효과 테스트 하려면 구현 되었습니다. 남성 태아 전시와 함께 비만 임신에서 trophoblasts autophagic 회전율, 또는 autophagosome 성숙13중단. 리소좀을 늦은 endosomes 지역화, 최근으로 설명 하고있다 "브레이크" autophagic 매출 과정에서 그것은으로 작동 하기 때문에 (실행 도메인 단백질 상호 작용 하는 Beclin1 및 시스테인-부자 포함), 루비콘 이라고 불리는 단백질 autophagosome 성숙14,15의 레 귤 레이 터. 사실, 루비콘 autophagy, 그것에 게 귀중 한 치료 목표를 억제 하는 단백질의 드문 예입니다. 아주 작은 정보는 microbials16,17 cardiomyocyte 보호18에 타고 난 면역 반응에 있는 그것의 역할을 제외 하면 루비콘의 병 태 생리 의미에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 루비콘 upregulated 여성 기본 trophoblasts 250 pg/mL까지 TNFα의 농도 증가 함께 치료에 대 한 응답에서에 발견 된다. 루비콘의 규제 수 역할 어떻게 여성 태아 요금에 임신에 남성 보다 더 나은 산 모 비만. 에 중요 한 통로의 규칙에 비만 자궁내 환경에 미치는 영향을 연구 플랫폼을 제공 업과 인간의 trophoblasts 외 인 TNFα 노출 하 여 비보 전 산 모 비만과 관련 된 염증 trophoblasts 및 확장, 태 반 기능.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (anhyd.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 (anhyd.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/Phosphatase inhibitors</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>88668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6228822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Calf Serum (NCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26010-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-427-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3177-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA vacutainer blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (Density Gradient Media, DGM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubicon (D9F7) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>8465S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-Actin antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a primary human trophoblast model to study the effect of inflammation associated with maternal obesity on regulation of autophagy in the placenta

산 모 비만 가능성이 autophagy의 dysregulation, 부분에서, 표시 될 수 있습니다 손상 된 태 반 기능에 의해 중재 불리 한 perinatal 결과의 위험 증가와 연결 됩니다. 비만 임신에서 반응과 autophagy 레 귤 레이 터의 식에서 벗어난 변화는 비만 및 임신과 관련 된 염증 과정에 의해 통제 될 수 있습니다. 여기서 설명 하는 것은 villous 조직의 샘플링 및 기본 세포 배양에 대 한 용어는 인간의 태 반 으로부터 villous cytotrophoblasts의 격리에 대 한 프로토콜이입니다. 이것은 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα), proinflammatory cytokine은 고가의 비만 마른 임신에서 기본 trophoblasts 치료 하 여 비만 자궁내 환경에 선 동적인 환경 시뮬레이션을 위한 방법으로 뒤 임신입니다. 여기에 설명 된 프로토콜의 구현을 통해 외 인에 노출 있다 TNFα 루비콘, 여성 태아와 마른 임신에서 trophoblasts에서 autophagy의 부정적인 레 귤 레이 터의 표현을 조절. 다양 한 비만 자궁내 환경에 생물학적 요인 trophoblasts 중요 한 통로 변조 가능성이 유지,이 비보 전 시스템은 식 패턴 vivo에서 관찰 된 경우 결정 하는 데 특히 유용 모성 비만과 인간의 반응과에서 TNFα 신호의 직접적인 결과입니다. 궁극적으로,이 방법은 월급 autophagy 및 다른 중요 한 세포 경로에 영향을 미칠 가능성이 있는 trophoblasts 모성 비만과 관련 된 염증의 규제 및 분자 의미 밖으로 구문 분석 하는 기회 태 반 기능입니다.

엎드려 서에서 인간의 반응과 용어 (임신 전 체 질량 지 (수 BMI) &#60; 25) 단순한 임신 여성 자손을 들고 어머니 수집 하 고 제왕 절 개 (노동) 배달의 15 분 이내 샘플링 했다. 반응과 석 회화 및 일반적인 개발의 부재에 대 한 조사 했다: 모양, 15-25 cm 직경, 그리고 탯 줄의 중간에 삽입 사이에서 라운드 탯 300-600 g와 막 제거 무게는 태 반입니다. Villous 조직 기초 및 chorionic 판 (그림 1), 태 반 전체에서 2-3 샘플에서 저조한 villous 조직의 기본 trophoblast 격리에 대 한 자료를 시작으로 약 100 g에서 해 부 했다. 20 분 이내 villous 조직 샘플링, 설명 된 대로 기본 trophoblasts 분리 절차 시작 되었다 여기, 0.8-사이 저조한 1 x 108 가능한 셀. 세포는 3 x 106 (3.3 c m2당 105 셀 x)의 조밀도에 6-잘 배양 배지에서 시드 했다. 문화의 24 h 후 셀 첨부 파일에 대 한 현미경 조사 됐다 하 고 적절 한 trophoblast 형태학 (개별 셀 라운드) 확인 되었다. 문화 미디어는 적어도 2 개의 우물 농도 및 차량 통제 (완전 한 미디어에만) 포함 된 있도록 125-104 pg/mL 사이 TNFα의 농도의 일련을 포함 하는 완전 한 미디어로 대체 되었습니다.
20-4 시간 다음 TNFα-치료 (48 h 문화의), 모든 TNFα 매체는 완전 한 미디어로 교체 했다. 아니 감지할 세포 죽음 103 pg/mL 이하의 농도에서 TNFα와 치료 때문에 관찰 되었다. 104 pg/mL TNFα 치료 알맞게 세포 독성 그리고 젖 산 효소 (LDH) 분석 실험 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 입증으로 미디어 변경 된 후이 TNFα 농도의 세포 독성 효과 지속 되지 않았다. 문화의 72 h에 세포는 현미경 syncytialization 위해 시험 되었다. Immunocytochemistry syncytialization 및 섬유 오염에 대 한 상대적으로 순수한 절연 trophoblasts (그림 3)의 계시. 세포 lysates 준비 BCA 분석 결과 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 결정으로 당 총 단백질의 3-8 µ g / µ L 사이 저조한 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 수확 했다. 서쪽 오 점 분석 여성 trophoblasts 큰 TNFα 최대 250 pg/mL의 농도와 TNFα 농도에 루비콘 식의 후속 downregulation 루비콘 식의 upregulation를 보였다 TNFα 치료에서 세포 lysates 250 pg/ml (그림 4A 와 B, 104 pg/mL 세포 독성 효과에 기반 하는 분석에서 제외). 마찬가지로, 루비콘은 크게 서쪽 오 점 분석에 의해 입증으로 마른 컨트롤에 비해 여성 태아와 비만 임신에서 반응과에서 플래시-냉동 villous 조직 생 검에서 upregulated (그림 4C 와 D, n = 6 BMI 당 반응과 클래스, ANOVA, P &#60; 0.05).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">농도 (%)</td>
			<td>90 %DGM (ml)</td>
			<td>1 x HBSS (ml)</td>
			<td>레이어 두께 (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 x 그라데이션</td>
			<td>4 x 그라데이션</td>
			<td>총 34.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70</td>
			<td>14</td>
			<td>4</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60</td>
			<td>8</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55</td>
			<td>7.33</td>
			<td>4.67</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>3.34</td>
			<td>2.67</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>3 (13.5 ml 마크)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>5.33</td>
			<td>6.67</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35</td>
			<td>4.67</td>
			<td>7.33</td>
			<td>3 (19.5 ml 마크)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>8</td>
			<td>16</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>2.67</td>
			<td>9.33</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1.33</td>
			<td>10.67</td>
			<td>3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. 기본 Trophoblasts의 밀도 원심 분리에 대 한 밀도 그라디언트를 만들기 위한 규격. 왼쪽에서 오른쪽, 1 열 밀도 그라데이션 미디어를 지정 합니다 (DGM, 필수 용품, 시 약, 장비, 보조 자료의 표 참조) 농도 HBSS에 DGM의 백분율로 표현. 열 2 열 3 HBSS DGM 솔루션의 적절 한 비율을 만들기 위한 필요한 볼륨을 지정 하는 동안 DGM의 볼륨을 지정 합니다. 열 4 가장 조밀한 층으로 시작 그라데이션 만들려고 50 mL 원뿔 튜브에 추가 될 볼륨을 지정 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>트립 신</td>
			<td>HBSS</td>
			<td>DNase</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소화</td>
			<td>(총 활동; BAEE 단위)</td>
			<td>볼륨 (ml)</td>
			<td>(총 활동; Kunits)</td>
			<td>총 볼륨 /digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>619037 (23.01 ml)</td>
			<td>141.76 ml</td>
			<td>62594 (0.230 ml)</td>
			<td>165 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>412691 (15.34 ml)</td>
			<td>94.51 ml</td>
			<td>41729 (0.154 ml)</td>
			<td>110 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>313270 (11.65 ml)</td>
			<td>71.74 ml</td>
			<td>31676 (0.116 ml)</td>
			<td>83.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총</td>
			<td>1345000 (50 ml)</td>
			<td>308 ml</td>
			<td>136000 (0.5 ml)</td>
			<td>358.5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2입니다. 기본 Trophoblast 격리 DNase Trypsin의 구체적인 활동에 따라 소화 솔루션의 준비에 대 한 규격. 왼쪽에서 오른쪽으로, 첫 번째 열은 소화 수를 지정 합니다, 두 번째 열 지정 소화 당 필요한 트립 신 활동, 적절 한 소화를 위한 추가 보충된 HBSS의 총 볼륨을 지정 하는 세 번째 열은 네 번째 열 소화, 필요한 DNase 활동 고 마지막 열 수 소화 솔루션의 볼륨을 지정 합니다.적절 한 소화를 위한 태 반 조직에 추가.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HBSS (Ca+ 2 와 Mg+ 2보충)</td>
			<td>샘플 버퍼</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 %10 x HBSS</td>
			<td>90 %4 X Laemmli 염료</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.26 m m CaCl2 (anhyd)</td>
			<td>10 %2-Mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.80 mM MgSO4 (anhyd)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20.77 mM HEPES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7.4 10N NaOH와를 1 L 살 균 ddH2O 최대 볼륨 무 균 병으로 살 균 필터</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>완전 한 미디어</td>
			<td>실행 버퍼</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 %v / v IMDM 제거</td>
			<td>25mm Tris 자료</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>추가 10 %v / v FBS</td>
			<td>190mm 글리신</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% 추가 10000 U/mL 페니실린/스 (100 U/mL 최종)</td>
			<td>0.1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH를 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>고정 미디어</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 %v / v FBS</td>
			<td>전송 버퍼</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 %v / v DMSO</td>
			<td>25mm Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>190mm 글리신</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소화 버퍼</td>
			<td>20% 메탄올</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL 트립 신 (26,900 BAEE 단위/mL)</td>
			<td>pH를 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL DNAse (272,000 K 단위/mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>보충된 HBSS 358.5 ml를</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20 mM Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA 버퍼</td>
			<td>150 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm Tris HCl</td>
			<td>7.6에 pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mM EDTA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mM NaCl</td>
			<td>TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% SDS</td>
			<td>0.1% Tween 20와 TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% 나트륨 deoxycholate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% 트라이 톤 X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml 당 효소/인산 가수분해 효소 억제 물의 1 태블릿 RIPA 버퍼</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3입니다. 격리에 필요한 솔루션 그리고 서 럽 뒤 기본 Trophoblasts 문화.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>% DGM</td>
			<td>ml 마크</td>
			<td>셀 유형</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>31.5-34.5</td>
			<td>파편</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>28.5 31.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>22.5-28.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35</td>
			<td>19.5 22.5</td>
			<td>Trophoblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>16.5 19.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>13.5-16.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>10.5-13.5</td>
			<td>림프 톨</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55</td>
			<td>7.5 10.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60</td>
			<td>4.5-7.5</td>
			<td>적혈구</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70</td>
			<td>4.5 below</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 4입니다. Trophoblasts 밀도 원심 분리에 의해의 침전입니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 첫 번째 열 DGM (표 1)의 백분율을 지정 합니다, 두 번째 열 지정 어디 DGM의 해당 비율 50 mL 원뿔 튜브에 발견 하 고 세 번째 열 지정 합니다에서 어떤 세포 유형 퇴적 물 mL 마크는 DGM 및 mL 50 mL 원뿔 튜브에 마크의 해당 비율. 50-35 %DGM, 뚜렷한 불투명 밴드 형성 사이 trophoblasts 앙금. 이 범위 보다 크거나 DGM을 수집 하는 것은 세포질 파편 및 다른 세포 유형 세포 등의 오염 귀 착될 것 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56484/56484fig1.jpg"> 
그림 1입니다. Villous 조직에서 격리 기간 인간 태 반 융 기저 플레이트를 제거 하 여. 
A) 는 chorionic 플레이트 (태아 쪽) 위쪽으로 향하게, 전체 두께 샘플 태에서 excised입니다. B) villous 조직 샘플 chorionic, 기저 접시를 제거 하 여 얻은 것입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56484/56484fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56484/56484fig2.jpg"> 
그림 2입니다. 갓 태어난 송아지 혈 청을 통해 소화 솔루션에 셀의 원심 다층 셀 펠 릿에 결과. 
A) 신생아 송아지 혈 청 (NCS) 다이제스트 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에서에 세포 현 탁 액 아래 계층. B) (A)의 원심 다층된 셀 펠 릿에 결과. 맨 레이어 붉은 색에 깊이 이며, 적혈구의 구성 됩니다. 위의 레이어 trophoblasts 포함 하 고 흰색 또는 베이지색 색깔에. trophoblast 위에 레이어 NCS 소화 솔루션 (표면에 뜨는) 튜브의 상단에 다음 이다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56484/56484fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56484/56484fig3.jpg"> 
그림 3입니다. Immunocytological Syncytialization 및 기본 인간의 Trophoblast 문화에서 섬유 콘텐츠 분석. 
A) cytotrophoblasts 문화의 24 시간 후에 Cytokeratin-7 (레드)의 대표 이미지. B) syncytiotrophoblasts 후 72 h 문화의 표시는 융합 하는 셀의 multinucleated 대 중에서에서 Cytokeratin-7 (레드)의 대표 이미지. C) syncytiotrophoblasts 문화의 72 h 후에 Vimentin (빨간색)의 대표 이미지. 이미지 (파란색) DAPI 핵 counterstain와 형광 현미경에 인수 했다. 10 배 확대에 시각. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56484/56484fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigi alt="Figure 4" class=""></img alt="Figure 4" class="xfigi>mg"src="/files/ftp_upload/56484/56484fig4.jpg"/ > 
그림 4입니다. 루비콘 식 비만 임신 여성의 태아와 대 린 여성 Trophoblasts에 TNFα-치료 및 Villous 조직에서 내 생 루비콘 식에 대 한 응답에서의 규칙. 건강 한 임신 여성 태아를 들고와 야 윈 어머니에서 용어 반응과에서 기본 trophoblasts 고립 되었고 125, 250, 500, 치료 103104 pg/mL TNFα (및 차량 통제). A) TNFα로 여성 trophoblast lysates에 루비콘에 대 한 대표 서양 오 점 치료. Β-말라 로드 제어로 사용 되었다. B) 루비콘 여성 trophoblasts에 TNFα 치료에 대 한 응답에서은 서 부도 말에서 계량 표현과 β-걸으로 표준화. 값은 TNFα 농도 ± 남동 n에서 당 평균 루비콘 식 3 반응과 =. C) 서 부 루비콘에 대 한 상체 비만 임신 여성의 태아와 대에서 villous 조직의 biopsies 냉동 플래시에서 전체 조직 lysates에 지우고 (F1-F12). 젖 산 효소 A (LDHA) 로드 제어로 사용 되었다. D) 루비콘 서양에서 식 (C)에서 몰아내고 정량 되었고 LDHA로 표준화. 값은 BMI 분류 ± 남동 n에서 당 평균 루비콘 식 = BMI 클래스 당 6 반응과 (ANOVA, * P &#60; 0.05). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56484/56484fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

a-primary-human-trophoblast-model-to-study-effect-inflammation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.3K 조회수.  Oregon Health and Science University. 여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

연구

의학

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

깊은 뇌 자극과 Saccadometry를 사용하여 정상 및 병적 뇌 기능을 연구하는

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

마우스에서 가속 죽상 경화증의 유도: "와이어 부상" 모델

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

인-31 자기 공명 분광학 : 측정을위한 도구<em&gt; 생체</em인간의 골격 근육에&gt; 미토콘드리아 산화 적 인산화 능력

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. Microbes have traditionally been classified based on their ability to use or tolerate oxygen. Supplemental oxygen is a common medical therapy administered to people with cystic fibrosis (pwCF); however, existing studies on oxygen and the airway microbiome have focused on how hypoxia (low oxygen) rather than hyperoxia (high oxygen) affects the predominantly aerobic and facultative anaerobic lung microbial communities. To address this critical knowledge gap, this protocol was developed using an artificial sputum medium that mimics the composition of sputum from pwCF. The use of filter sterilization, which yields a transparent medium, allows optical methods to follow the growth of single-celled microbes in suspension cultures. To create hyperoxic conditions, this model system takes advantage of established anaerobic culturing techniques to study hyperoxic conditions; instead of removing oxygen, oxygen is added to cultures by daily sparging of serum bottles with a mixture of compressed oxygen and air. Sputum from 50 pwCF underwent daily sparging for a 72-h period to verify the ability of this model to maintain differential oxygen conditions. Shotgun metagenomic sequencing was performed on cultured and uncultured sputum samples from 11 pwCF to verify the ability of this medium to support the growth of commensal and pathogenic microbes commonly found in cystic fibrosis sputum. Growth curves were obtained from 112 isolates obtained from pwCF to verify the ability of this artificial sputum medium to support the growth of common cystic fibrosis pathogens. We find that this model can culture a wide variety of pathogens and commensals in CF sputum, recovers a community highly similar to uncultured sputum under normoxic conditions, and creates different culture phenotypes under varying oxygen conditions. This new approach might lead to a better understanding of unanticipated effects induced by the use of oxygen in pwCF on airway microbial communities and common respiratory pathogens.

The goal of this protocol is to develop a model system for the effect of hyperoxia on cystic fibrosis airway microbial communities. Artificial sputum medium emulates the composition of sputum, and hyperoxic culture conditions model the effects of supplemental oxygen on lung microbial communities.

낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...