著者らは、これらの研究のための財政的支援を提供してくれたアルコンに感謝する。

1. ヒト角膜上皮細胞培養
<ol><li>コラーゲンコーティングされた75cm2フラスコで不死化HCEC19を成長させ、ダルベックの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)の10%の胎児血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを5%CO2で37°Cで含有する。 メモ:振る必要はありません。</li>
	<li>メディアを 2~3 日ごとに変更します。</li>
</ol>2. 検査用細胞の調製
<ol><li>細胞がほぼコンフルエント除去培養培地後。</li>
	<li>各75 cm2 フラスコに4-6 mLの細胞の解離液を加えます。細胞が剥離するまで(約20〜30分)、顕微鏡で定期的にチェックするまで、細胞を37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>10% FBS を含む DMEM/F12 の 2-6 mL を各 75 cm2 フラスコに追加します。</li>
	<li>フラスコの内容物を50 mL遠心管に移します。</li>
	<li>450~500 x g で5分間遠心分離します。上清をパイプアウトし、事前に温められた媒体で細胞を再中断します。</li>
	<li>ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。合計 1 x 105 個 のセルを含むメディアの量を計算します。</li>
	<li>48ウェルコラーゲン-1コーティングされた培養プレートの各ウェルに1 x 105 細胞を加えます。井戸内のメディアの最終容積が10%FBSで培養DMEM / F12の0.5 mLになるように十分なメディアを井戸に追加します。 注:人工涙液製剤は、HCECの代謝活性の低下によって測定することができる細胞毒性を引き起こす可能性があります。データの整合性は、シード時に各ウェルに同じ数の HCEC を追加することに依存します。48ウェルプレートに推奨される培養濃度は1 x 105です。哺乳動物細胞は再懸濁後に遠心分離管に沈着する可能性があるため、細胞懸濁液が均一に分布するようにプレートに細胞を播種しながら、頻繁に撹拌することによって細胞を再懸濁することが推奨される。</li>
	<li>細胞を37°Cで、CO2 を24時間5%インキュベートします。</li>
</ol>3. 乾燥プロトコルなし
<ol><li>制御手順<ol>
<li>24時間インキュベーション後、プレートから培養培地を取り出す。</li>
		<li>150 μLの試験製剤およびメディア制御ソリューションですぐに処理します。</li>
		<li>37°Cで細胞をインキュベートし、30分間CO2 を5%で培養します。</li>
		<li>セルからテスト ソリューションを削除します。</li>
		<li>代謝活性をテストするために10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。37°Cおよび5%CO2で細胞を別の4時間インキュベートする。</li>
		<li>4時間のインキュベーション期間の後、各ウェルから100μLの代謝染料溶液を取り除き、各100 μLを96ウェルプレートのウェルに入れる。</li>
		<li>蛍光プレートリーダー(材料表)を用いて各ウェルの蛍光を測定する。励起波長を540nm、発光波長を590nmに設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>デシケーションプロトコルなし(回復手順)<ol>
<li>ステップ 3.1.1-3.1.4 を繰り返します。</li>
		<li>各ウェルに0.5 mLのDMEM/F12メディアを追加します。</li>
		<li>37°Cおよび5%CO2で18時間培養1セットをインキュベートする。</li>
		<li>培地を取り除き、10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。ステップ 3.1.6 と 3.1.7 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. デシネーションプロトコル
<ol><li>制御手順<ol>
<li>24時間インキュベーション(ステップ2.8)後、プレートから培養培地を取り出す。</li>
		<li>150 μLの試験製剤およびメディア制御ソリューションですぐに処理します。</li>
		<li>37°Cで細胞をインキュベートし、30分間CO2 を5%で培養します。</li>
		<li>セルからテスト ソリューションを削除します。</li>
		<li>細胞を37°Cおよび45%RHチャンバーに5分間置き、細胞を脱生物する。</li>
		<li>代謝活性をテストするために、10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。37°Cおよび5%CO2で細胞を別の4時間インキュベートする。</li>
		<li>4時間のインキュベーション期間の後、各ウェルから100μLの代謝染料溶液を取り除き、各100 μLを96ウェルプレートのウェルに入れる。</li>
		<li>蛍光プレートリーダーを用いて各ウェルの蛍光を測定します。励起波長を540nm、発光波長を590nmに設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>回復手順<ol>
<li>手順 4.1.1~4.1.5 を繰り返します。</li>
		<li>各ウェルに0.5 mLのDMEM/F12メディアを追加します。</li>
		<li>37°Cおよび5%CO2で18時間培養1セットをインキュベートする。</li>
		<li>培地を取り除き、10%の代謝染料溶液の0.5 mLを加えます。ステップ 4.1.7 と 4.1.8 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. データ分析
<ol><li>メディアコントロールの平均蛍光を計算します。次の式を使用して、サンプルの生存率の割合を計算します。 サンプルの生存率=蛍光/培地制御のサンプルの蛍光/培地制御 x 100 注: メディア制御の平均は 100% 実行可能性です。代謝染料自体は、それに関連する少量の蛍光を有する。代謝色素試薬の蛍光は、培地制御に対する試験試料の生存率を計算する前に、コントロールおよび試験サンプル蛍光から差し引くことができる。</li>
	<li>コントロールとテストサンプルで正規性検定と等分散検定を実行します。</li>
	<li>正規性検定が合格し、分散が等しい場合は、一方向の分散を実行します。特定のグループ間の有意な違いを特定するために、ペアワイズ比較後のテスト(すなわち、TukeyまたはDunnettの複数比較検定)を実行します。</li>
	<li>正規性検定が合格し、分散が異なる場合は、ウェルチのANOVAを実行します。特定のグループ間の有意な違いを特定するために、臨時テスト(つまり、ダネットまたはゲームハウエルの複数比較テスト)をペアワイズ比較を行います。</li>
	<li>正規性検定が失敗した場合は、ノンパラメトリック検定(つまり、クルスカル-ウォリス検定)を使用します。特定のグループ間の有意な違いを特定するために、ペアワイズ比較後のテスト(すなわち、ダンの検定)を実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Maurer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+acute+corneal+injury+in+rabbits+with+surfactants+of+different+type+and+irritancy.">Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).</li><li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells.">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li><li>Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alamar+blue+reduction+for+the+in+vitro+assay+of+hepatocyte+toxicity.">Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity.</a> Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation.">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li><li>Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+artificial+tears+against+desiccation+in+cultured+human+epithelial+cells.">Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells.</a> Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).</li><li>Ubels, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+investigation+of+the+efficacy+of+an+artificial+tear+solution+containing+hydroxypropyl-guar+as+a+gelling+agent.">Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent.</a> Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).</li><li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium.">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li><li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration.">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li><li>Matsuo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+protects+corneal+epithelial+cells+from+death+by+drying.">Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying.</a> British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients.">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells.">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li><li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trefoil+factor+family+peptide+3+(TFF3)+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro.">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li><li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts:+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights.">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li><li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease.">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li><li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li><li>Zachari, M. 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L., Blazquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+salts+and+formazan+products+in+Cell+Biology:+Viability+assessment,+fluorescence+imaging,+and+labeling+perspectives.">Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives.</a> Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Rampersad, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Applications+of+Alamar+Blue+as+an+Indicator+of+Metabolic+Function+and+Cellular+Health+in+Cell+Viability+Bioassays.">Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays.</a> Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).</li><li>Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+disulfide+as+an+efficient+metabolic+assay+for+cell+viability+in+vitro.">Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).</li><li>Uzunoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+XTT+and+Alamar+blue+assays+in+the+assessment+of+the+viability+of+various+human+cancer+cell+lines+by+AT-101+(-/-+gossypol).">Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol).</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).</li><li>McIlwain, D. 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3人の著者(レカ・ランガラジャン、ハワード・A・ケテルソン、ラクシュマン・サブバラマン)はアルコンの従業員です。アルコンは、このプロジェクトの唯一の資金源であり、スポンサーです。リンドン・W・ジョーンズは、過去3年間にわたり、アルコン、アレルガン、コンタマック、クーパービジョン、GLケムテック、インフラマックスリサーチ、J&Jビジョン、メニコン、ネイチャーズウェイ、ノバルティス、PSセラピー、サンテン、シャイア、視力ガラス、ヴィジョニアリングの研究支援または講義賞を受賞しています。リンドン・ジョーンズはコンサルタントでもあり、アルコン、クーパービジョン、J&Jビジョン、ノバルティス、オフテックスのアドバイザリーボードを務めています。著者の次のリストは何も開示していません:リチャード・ドー、デビッド・J・マッキャンナ、アデリーン・スコ、ダリル・エンストーン、ジャヤ・ダンタム。

このプロトコルは、細胞乾燥に対する人工涙液の保護効果を決定するように設計されています。最初に、細胞は、細胞をコーティングするためにドライ点眼薬にさらされます。次に、細胞を乾燥させ、代謝活性をモニタリングして、製剤が乾燥ストレスの有害な影響を軽減できるかどうかを評価する。これらのステップは、ドライアイ製剤が角膜上皮細胞の全体的な生存率に及ぼす全体的な影響を理解するために重要である。
ドライアイ製剤の大部分が培養井戸から除去された後、細胞と接触している残りの分子の化学は細胞乾燥に影響を与える。一部の製品には、細胞の蒸発を最小限に抑える油のマイクロエマルジョンが含まれています20.リンス後の摩擦分析を評価した研究では、ドライアイ製剤21の滞留時間の向上を示す指標となり得るドライアイ製剤の低摩擦の維持を示した。このアッセイの限界の1つは、乾燥保護は他の眼球低下製剤と比較して評価することができるが、この保護の持続時間は評価された短い乾燥時間のために決定することができないということである。このインビトロアッセイにおける乾燥時間が長い場合、細胞単層よりも全体的に多くの水分含有量を有する多層培養物の使用が必要となる。
細胞上の製剤の特定のインキュベーション時間と乾燥時間の持続時間は、温度および湿度値が変化した場合に調整する必要があります。乾燥した眼に寄与できる環境ストレス条件をシミュレートするための温度、RHおよび空気流量を選択することは、季節的および局所的な環境条件が非常に可変的である21となって困難であり得る。人間の研究のための現代の環境室は5°Cと35°Cの間の温度を変えることができる、および5%と95%22の間のRH。気化計としっかりと取り付けられたゴーグルを使用して、40-45%のRHで角膜からの蒸発速度は0.037 μL/cm2/minであり、20-25%のRHでは蒸発速度は0.065 μL/cm2/分23であると判断した。in vitroモデルが飛行機15、砂漠、乾燥室内環境16のような極めて低いRH条件下での製剤の保護効果を見ている場合、細胞からの蒸発速度の向上に対応するためにインキュベーション時間を短縮する必要がある。ヒトの涙液中には、涙を蒸発から守る、マイボミアンや他の腺に由来する様々な脂質が存在する。これらの脂質は、融点が異なって24.温度変化は涙液の流動性に影響を与える可能性があるため、周囲温度で行われたテストは37°Cで行われたテストとは大幅に異なる蒸発速度を持つことができます。 平均眼表面温度範囲は32.9~36°C25であるため、この温度範囲付近で試験を行うことをお勧めします。
このプロトコルで使用される代謝色素(alamarBlue)に加えて、細胞代謝活性に対する製品製剤の効果を評価するために使用できる他の化学試薬があります。テトラゾリウム塩(MTT、XTT、MTS、WST)は、使用することができる代替化学物質です。テトラゾリウム塩の違いは、MTTが正に荷電した分子であるため、生細胞26の細胞質に入ることができる点である。MTTはNAD(P)H27による減少後に不溶性になる。プレートリーダー上の吸光度を読み取る前に可溶化する必要があります。他のテトラゾリウム塩は負に帯電する28.それらは細胞に入ることができず、細胞内分子29と直接相互作用できないため、生細胞外の二次分子によって減少しなければならない。XTT、MTS、およびWST-1アッセイに関しては、電子カップリング剤1-メトキシフェナジンメトサルフェート(PMS)を添加することで、アッセイ30の性能を向上させることができる。テトラゾリウム塩を使用する代謝アッセイとは対照的に、alamarBlueは追加の可溶化剤または電子結合剤を必要としない。また、XTT、MTSまたはWST-1とは異なり、alamarBlueは細胞膜に浸透し、細胞酵素27、29によって直接減少させることができる。alamarBlueとテトラゾリウム塩を直接比較すると、alamarBlueはHCEC3、27、31、32を含む様々な細胞株の代謝活性を評価する場合に感度が高いということが示されている。
他の生化学的エンドポイントは、乾燥によるヒト角膜上皮細胞の保護を評価するためにも考慮することができる。蛍光色素は、細胞膜透過性および細胞エステラーゼ活性1を検出するために使用することができる。また、アポトーシスは、細胞表面上のアポトーシスマーカーの染色またはカスパーゼ活性1,33の測定によって検出できる。他のアッセイは、HCECタイトジャンクション34に対する眼科製品の影響を決定している。これらのアッセイは、本稿に記載されている乾燥手順を利用した将来の評価に組み込まれる可能性がある。
ドライアイの原因はたくさんあります。ドライアイは、涙の分泌の減少、眼表面の炎症の増加、または眼表面での脱水の増加によって引き起こされる可能性があります。乾燥状態の間に細胞が乾燥するのを防ぐドライアイドロップの蒸発ドライアイ使用を有する個人のために、ドライアイの症状を緩和することができる。いくつかのドライアイ製剤の問題の1つは、眼表面に害を与える可能性のある防腐剤の存在である。負傷細胞は、負傷した細胞が乾燥ストレス35の影響を受けやすいため、より多くの細胞が死滅する可能性があり、ドライアイ患者には役に立たない。
Garrigueら36 の最近のレビュー記事は、脂質ベースの製品が蒸発ドライアイを緩和するためにどのように作用するのかの現在の知識の評価を提供する。脂質欠乏性涙に脂質を加えることは、蒸発を防ぎ、細胞を乾燥から守ることができる。また、保湿剤は、眼表面37で水を引き付け、保持する分子である。溶液中のグリセリン#1と溶液中のプロピレングリコール#3はいずれも保湿剤である。溶液#3は、製剤成分の脂質および保湿特性に起因する可能性のあるHCECのより大きな保護効果を示した。
このプロトコルは、ドライアイ製剤への暴露後のHCECの代謝活性と乾燥ストレスを評価するように設計されています。この記事で説明した方法を使用することで、蒸発ドライアイに苦しむ人々のために新しい非刺激性および保護点眼薬を開発することができます。

複数用量の眼科溶液中の多くの異なる成分は、安定性、pH、浸透性、および有効性を維持するために必要とされる。しかしながら、眼溶液中の防腐剤や界面活性剤のようないくつかの化学物質は、角膜上皮1、2に損傷を与える可能性がある。ヒト角膜上皮細胞(HCEC)を用いた細胞生存率試験は、眼科製剤中のこれらの様々な成分によって引き起こされる潜在的な損傷を評価するために行うことができる。細胞損傷を評価するのに特に有用であるインビトロアッセイの1つは、alamarBlueアッセイ3である。このアッセイでは、代謝染料(すなわち、alamarBlue)は、細胞生存率指標として機能するレサズリンを含有する。細胞呼吸中、レサズリンは電子4を受け入れることによってレゾルフィンに還元される。レソルフィンの還元は、非蛍光分子から分光フルオロメーター5を用いて検出できる蛍光分子への変化を引き起こす。
この調査は、角膜上皮細胞の2つの異なる治療法を使用して、ドライアイ製品がインビトロモデルでどのように行われるかを決定する。最初の評価では、細胞は30分間これらの製品で処理されます。治療後、細胞はドライアイ製品への暴露直後および回復時間間隔の後に代謝活性について評価される。この評価は、湿度チャンバ内の乾燥前の細胞に対するこれらの製品の効果を決定します。これらの溶液中の溶液保存剤、界面活性剤または緩衝剤は、代謝染料を用いて検出することができる細胞に対して何らかの細胞毒性作用を有し得る。
第2の評価は、ドライアイ産物および乾燥物への曝露後の細胞の代謝活性を決定する。この評価では、製品治療が乾燥障害から細胞に保護を提供する場合、細胞の代謝活性が維持される。乾燥の有害な影響からの細胞保護は、ドライアイ製品が脂質で細胞をコーティングすることができる場合、または製品が細胞に水分を加える周囲から液体を吸収する可能性がある場合に発生する可能性があります。
このプロトコルは、細胞の環境ストレスの厳しい条件をシミュレートするように設計されています。他の研究では、この外部応力を作成するためにさまざまなモデルを使用しています。いくつかの研究は、層流フード6、7、8の細胞を乾燥させたが、他の研究は室温および様々な相対湿度(RH)値9、10、11を使用している。ドライアイ条件をシミュレートする方法は、インキュベート溶液12,13の浸透率を高めることである。有害な環境条件をシミュレートするためのもう一つのin vitro方法は、乾燥眼患者14の涙液をシミュレートするために細胞培地にサイトカインを添加するものである。これらのテストは、化学物質が浸透ストレスを軽減したり、免疫系を刺激したりする方法を評価できる興味深いモデルですが、これらのモデルは、化学製剤が乾燥ストレスから細胞を保護する方法を直接示していません。
乾燥モデルは温度/湿気の部屋37 °Cおよび45%RHを使用する。これは、眼表面からの蒸発を引き起こす可能性のある環境条件をシミュレートします。航空機のキャビン15 や冬季16 の屋内環境で見られる低湿度などの他の極端な環境条件のシミュレーションもこの方法を使用して行うことができる。
細胞培養モデリングは、乾燥ストレスがヒト角膜に及ぼす影響をシミュレートするために使用されます。細胞ストレスを検出するために、細胞の生存率試験を行い、細胞の健康への影響を判断します。細胞に対していくつかの異なる生理学的検査を行い、ストレスが17個あるかどうかを判断することができる。この試験手順で行った分析は、市販の代謝色素(材料表)を使用する。それは、非毒性であり、増殖培地に可溶であり、細胞固定18なしで細胞を評価できるという点で、他の多くの細胞ストレス試験に対して利点を有する。この手順では、細胞は各処置の直後に代謝活性について試験され、2番目のセットの細胞は成長培地に戻され、18時間の回復後に評価される。直ちに、そして回復期間の後にテストする理由は、代謝活性および遅延効果を引き起こす細胞損傷に即時の影響を引き起こす細胞損傷を特定することです。また、これらの製剤が短期的な損傷と長期的な損傷に及ぼす影響、および製剤が最初の侮辱から回復/回復しない能力を評価する機会を提供する。
この調査は、乾燥の有無にかかわらずHCEC代謝活性に及ぼす影響について、様々な脂質含有ドライアイ製品を比較するために使用されます。テストしたドライアイ製品の成分は、 材料表に記載されています。溶液中の#1成分は、カルボキシメチルセルロースナトリウム(0.5%)、グリセリン(1%)、ポリソルベート80(0.5%)、溶液中の軽い鉱物油(1.0%)#2そして、ミネラルオイル(4.5%)、および溶液中で脂質#3は、鉱油およびプロピレングリコールがデマルセントである。これらの脂質は、脱湿からHCECの保護を提供することが期待される製剤成分である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>There is No Phenol Red in this media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169&#8211;72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity/Temperature Chamber</td>
			<td>Associated Environmental Systems</td>
			<td>LH-1.5</td>
			<td>Economy Line Humidity Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100X concentration so add 1ml to each 99ml of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Optive Advanced (solution #1)</td>
			<td>Allergan, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soothe XP (solution #2)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Complete (solution #3)</td>
			<td>Alcon Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD&#174; (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation

人工脂質含有涙液製剤は、欠損した涙液脂質層の回復によって涙液蒸発を低減するために開発される。細胞乾燥を防ぐ人工涙液製剤は、眼表面保護および細胞代謝活性の維持をもたらす。脱水の間、細胞は代謝活性の喪失と、その後の細胞死の過程を受ける。本研究は、人工涙液製剤の有効性を評価する方法を説明する。代謝色素(すなわち、alamarBlue)は、低蛍光分子レサズリンから生細胞における蛍光分子再ソルフィンに変化する。人工涙液製剤の生物学的性能は、(a)細胞生存能を維持する製剤の能力として測定され、(b)乾燥から細胞保護を提供する。増殖培地と生理乾燥は、細胞の生存率/乾燥試験のコントロールとして使用されます。細胞は30分間の試験溶液でインキュベートされ、37°Cおよび45%の相対湿度で0または5分間乾燥する。最初の曝露後および細胞乾燥後の細胞代謝活性が決定される。結果は、細胞代謝活性および乾燥保護に対するアイドロップ製剤の比較効果を示す。この方法は、蒸発ドライアイで個人を治療するように設計されたドライアイ製剤をテストするために使用することができます。

3つのドライアイ製剤を比較した研究の結果を 図1に示す。この図は、3つの製品、溶液#1、ソリューション#2、ソリューション#3(材料表)がHCECの実行可能性に及ぼす影響に違いがあることを示しています。溶液#1および溶液#2は、乾燥前のHCECの代謝活性に有意な影響を及ぼした。これは、HCECの代謝活性を破壊することができるこれらの製品に製剤成分があることを意味します。溶液#1にさらされた細胞の18時間の回復後に起こった細胞代謝活性のさらなる低下は、HCECが最初に負傷し、18時間後に傷害が修復されないことを示している。それに比べて、溶液#3 HCECの代謝活性に軽度の影響しか及ぼしていなかった。
図2 は、これらの脂質含有ドライアイ製剤が細胞保護に及ぼす影響を示す。18時間の回復間隔で約0%HCEC代謝活性を有し、溶液#1および溶液#2は、乾燥ストレスから細胞を保護しなかった。しかし、#3解決策は、乾燥ストレスに対してある程度の保護を提供した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg"> 図1:ドライアイ脂質強化産物が細胞生存率に及ぼす影響 脂質含有ドライアイ産物による治療後のHCEC代謝活性により測定された相対的な生存率。* = #3 適切な回復期間のメディア制御に対するΔ=統計的有意性(p<0.05)に対する統計的有意性(p<0.05)。バーの高さは平均値を表し、誤差範囲は SD です <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg"> 図2:乾燥防止に対するドライアイ脂質増強製品の効果 細胞保護に対する脂質含有ドライアイ製剤の効果溶液#1および溶液#2は、乾燥ストレスから細胞を保護しておらず、時間の経過とともに乾燥効果から回復しなかった。対照的に、溶液#3は、乾燥ストレスに対するいくつかの保護を提供した。* = p <溶液#3に対して 0.05、Δ = p < 0.05 を適切な回復時間に対して未処理(制御)メディアと比較して行います。バーの高さは平均値を表し、誤差範囲は SD です <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">。</a>

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Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

このプロトコルの目的は、異なる人工涙液製剤が、インビトロモデルを用いてヒト角膜上皮細胞を乾燥から保護できるかどうかを評価することです。人工涙液製剤および乾燥液への曝露後、ヒト角膜上皮細胞は代謝活性について評価される。

乾燥した後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす人工涙液製剤の効果

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

effect-artificial-tear-formulations-on-metabolic-activity-human

Research

JoVE Journal

Medicine

3.8K ビュー.  Alcon Vision, LLC. このプロトコルの目的は、異なる人工涙液製剤が、インビトロモデルを用いてヒト角膜上皮細胞を乾燥から保護できるかどうかを評価することです。人工涙液製剤および乾燥液への曝露後、ヒト角膜上皮細胞は代謝活性について評価される。

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating and exposing these cells to mainstream cigarette smoke (CS), in order to study epithelial cell responses to CS exposure. The protocol consists of three parts: the isolation of airway epithelial cells from mouse trachea, the culturing of these cells at air-liquid interface (ALI) as fully differentiated epithelial cells, and the delivery of calibrated mainstream CS to these cells in culture. The ALI culture system allows the culture of respiratory epithelia under conditions that more closely resemble their physiological setting than ordinary liquid culture systems. The study of molecular and lung cellular responses to CS exposure is a critical component of understanding the impact of environmental air pollution on human health. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and other tobacco-related diseases, which represent major global health problems.

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating, culturing and exposing these cells to mainstream cigarette smoke, in order to study molecular responses to this environmental toxin.

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

医学

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

齧歯尿生殖洞間充織とヒト幹細胞の組織の組換えを用いたヒト前立腺上皮の形成

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective mining of the information in the large-scale datasets that are obtained from gene expression microarrays, deep sequencing experiments or metabolic profiling is essential to uncover and then effectively target the critical regulators of diseased cell phenotypes. Estrogen Receptor &#945; (ER&#945;) is one of the master transcription factors regulating the gene programs that are important for estrogen responsive breast cancers. In order to understand to role of ER&#945; signaling in breast cancer metabolism we utilized transcriptomic, cistromic and metabolomic data from MCF-7 cells treated with estradiol. In this report we described generation of samples for RNA-Seq, ChIP-Seq and metabolomics experiments and the integrative computational analysis of the obtained data. This approach is useful in delineating novel molecular mechanisms and gene regulatory circuits that are regulated by a particular transcription factor which impacts metabolism of normal or diseased cells.

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

乳癌におけるエストロゲン受容体シグナル伝達によって代謝制御のシステムバイオロジー

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

コラーゲン誘発凝集に対するPannexin1阻害剤の効果ブリリアントブルーFCF：比濁法は、人間に洗浄血小板を

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

ヒト胎盤生理学の統合研究への4容器サンプリングアプローチ<em&gt;インビボ</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

成長および線虫の繁殖に対する薬剤の効果を測定

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

胎盤におけるオートファジーの制御の母性的な肥満に関連付けられている炎症の影響を検討する主なひと胎盤絨毛細胞モデル

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).