이 프로토콜은 유비퀴틴과 유비퀴틴과 같은 번역 후 수정의 프로파일을 생성하고 특정 식별된 특정 단백질을 식별하고 반정화하여 쉽게 생성할 수 있는 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 1 주일 이내에 안정적인 발현주를 만들기 위해 렌티 바이러스를 사용하고, 특히 단백질을 정화하기 위해 두 개의 태그를 사용하는 것입니다. 사실, 번역 후 수정의 이 종류는 대부분의 생물학 기능에 관련되고, 이 기계장치의 변경은 대부분의 질병에서 찾아낸다.
따라서 이러한 변경 사항을 식별하는 것은 예후 및/또는 진단과 분자 표적으로서의 역할을 할 수 있습니다. 유비퀴틴은 진핵 세포에서 가장 보존된 단백질 중 하나이며 생존에 필수적입니다. 따라서 이러한 종류의 방법은 포유류에서 효모에 이르기까지 모든 진핵 모델에 적용될 수 있습니다.
그러나, 우리의 렌즈 바이러스 시스템은 세포의 연구에 국한됩니다. 전체 절차는 때때로 긴 잠복기와 함께 매우 길기 때문에, 대신 2 일 동안 그것을 할 수 있습니다. 니켈 구슬의 용루는 영하 20에서 플래그 구슬을 추가하기 전에 동결 될 수 있습니다.
이 프로토콜에는 정화의 최종 성공을 보장하기 위해 중요한 단계가 많이 포함되어 있으므로 번역 후 수정 프로파일의 정확한 확립이 포함됩니다. 절차의 시연은 미르나 스웨이덴과 아우렐리 도브릭, 실험실의 두 박사 과정 학생에 의해 수행됩니다. 우선, HEK 293T 세포의 6분의 1에 0.5배 10배, DMEM의 웰당 2밀리리터를 10%의 FBS로 넣고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%로 배양합니다.
다음 날, 50~70%의 합류가 달성됩니다. pCCL-6HF 유비퀴틴 유사 또는 pCCL-GFP의 1마이크로그램, PBS VG의 1마이크로그램, 그리고 렌티바이러스 생산을 위한 트랜스페션 시약 및 프로토콜을 사용하여 델타 도우미 벡터의 마이크로그램 1개를 혼합하여 세포를 코트랜스펙트. 6시간의 트랜스펙트 후, 배지를 세포의 배지에 대응하는 새로운 것으로 변경하여 유도한다.
다음날 10~20%의 결합을 얻기 위해 표준 배양 배지를 사용하여 6웰 플레이트에서 변환되는 세포를 시드한다. 24 시간 트랜스펙트 후, 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 회수하고 0.45 미크론 필터를 사용하여 필터를 한다. 렌티바이러스를 함유하는 여과된 배지에 의해 변형되는 세포의 배지를 교체한다.
37섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 인큐베이터에서 24~72시간 동안 렌즈티바이러스로 세포를 배양한 다음, 신선한 표준으로 배지를 변경합니다. 반전된 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하여 트랜스듀션의 효율성을 평가합니다. 형광이 발견되지 않으면 2 ~3 일 더 기다립니다.
GFP 대조군이 녹색 형광으로 양성인 경우, 면역형광에 의한 6-His-FLAG 유비퀴틴의 발현 제어를 수행하기에 충분한 때까지 모든 세포를 성장시키고, 여기에 도시된 바와 같이, 및 항플래그 항체를 이용한 서부 블롯. 15센티미터 의 접시에서 세포를 성장 한 후, 실온에서 인산염 완충 식염수로 적어도 한 번 배양 접시를 씻으라. 세포 용해를 시작하려면 실온에서 각 15센티미터 접시에 버퍼 2 밀리리터를 추가합니다.
셀 스크레이퍼를 사용하여 모든 용재를 50밀리리터 원심 분리 튜브로 복구합니다. 30초 동안 3회 를 세 번 초음파 처리하여 1분 간 일시 정지합니다. 15분 동안 15, 000배 g의 초음파 용해를 원심분리합니다.
40 미크로른 세포 여과기를 통해 새로운 튜브로 상수체를 전송합니다. 초음파 처리 및 원심 분리 후 용재를 필터링하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게 하지 않으면 많은 비특이적 단백질의 화정화가 발생할 수 있으며, 이로 인해 배경이 증가하고 PTM 프로파일의 크기를 강하게 감소시킬 수 있다.
새로운 팔콘 튜브에 50에서 100 밀리그램 사이의 동일한 양의 단백질을 전달합니다. 니켈 이온 NTA 구슬을 각 튜브에 넣고 1밀리그램당 2개의 마이크로리터의 비드를 넣습니다. 회전기에 튜브를 놓고 실온에서 2 1/2 시간 동안 30 rpm에서 회전하십시오.
그런 다음 5 분 동안 500 배 g에서 구슬을 펠렛합니다. 구슬을 완충 1밀리리터로 씻고 샘플을 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
10 밀리머 이미다졸을 함유한 얼음 차가운 버퍼 2개로 두 번 씻으시다. 엘루트 바운드 단백질에 250 밀리알라 이미다졸을 함유한 완충 제2의 600 마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전합니다. 1분 동안 500회 g에서 원심분리로 구슬을 펠트렛한 후, 상체를 1.5밀리리터 튜브로 옮기고, 안티 플래그 M2 항체-컨쥬게이트 구슬 50마이크로리터를 첨가한다.
섭씨 4도에서 2 1/2 시간 동안 30 rpm에서 회전하십시오. 그런 다음 버퍼 2의 500 마이크로 리터로 두 번 세척 한 다음 버퍼 3의 500 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오. 최종 용출의 경우, 마이크로리터 당 0.01 마이크로그램의 FLAG 펩티드를 함유한 완충제 3개 100마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 1 1/2시간 동안 회전합니다.
원심분리 후 1분 동안 500회 g에서 상주체를 새로운 미리 냉각된 튜브로 옮긴다. SDS-PAGE에 10 마이크로리터를 싣고 젤의 은색 염색을 수행하여 정제 품질을 제어합니다. 정제가 좋아 보이면 LC-MS가 남긴 90%를 분석합니다.
정규화를 수행하려면 수식을 사용하여 유비퀴틴과 GFP를 위해 약물 처리 된 세포와 치료되지 않은 세포 사이의 값을 정상화하십시오. 배경을 제거하려면, 유비퀴틴 샘플의 값에서 제어 샘플 GFP의 값을 빼서 두 조건에서 확인된 각 단백질에 대한 특정 값을 얻습니다. 유비퀴티뉴션의 변이를 얻으려면 약물에 의해 유도된 PTM의 양성 및 음극에 대해 마이너스 100과 100 사이의 점수를 얻습니다.
처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플의 특정 값 간의 차이는 컨트롤에 있는 값을 포함한 모든 값의 합으로 나누고 100을 곱합니다. PTM의 억압을 나타내는 마이너스 50 이하의 변형또는 PTM의 유도를 나타내는 50 이상은 중요한 것으로 간주됩니다. 이 수식을 사용하여 50이상의 0과 100% 값 사이의 신뢰값을 얻으려면 일반적으로 자신감을 가질 수 있는 것으로 간주됩니다.
유도 및 억압 값의 더 좋은 분포를 얻고 변형 및 신뢰 도면 변수를 모두 고려하려면 이 수식을 사용하여 분산 및 신뢰 값을 곱합니다. 이 연구에서는, 배양 포유류 세포의 변환은 GFP와 6-히스티딘 플래그 유비퀴틴 발현 세포를 만들기 위해 달성되었다. 렌티바이러스 트랜스듀션의 효능은 GFP-트랜스듀싱 된 세포의 GFP 형광을 보고 처음으로 제어되었다.
FLAG-유비퀴틴의 발현은 항 플래그 항체를 사용하여 염색된 면역 형광에 의해 수행되었으며, 이는 트랜스듀싱 된 세포의 비율을 보여줍니다. 외인성 FLAG-유비퀴틴의 발현 수준을 제어하기 위해, 변환된 세포로부터의 용액은 SDS-PAGE에 의해 분석되었고, 그 다음으로 안티 플래그 항체를 가진 서양 블롯이 뒤따랐다. 유비쿼터티드 단백질의 정제 후, 최종 용출의 10%는 SDS-PAGE 및 겔의 은 염색에 의한 정제 물질의 양과 무결성을 제어하는 데 사용되었습니다.
배경 GFP 샘플 뺄셈은 이러한 유비쿼터트 단백질의 50%A 유전자 세트 농축 분석 이상의 점수로 현저하게 유비쿼터처리된 364개의 단백질을 확인하여 그들이 참여한 생물학적 과정을 강조하기 위해 수행되었다. gemcitabine 유도 된 유비쿼터신화의 변경에 의해 형성 된 잠재적 상호 작용 네트워크. 이것은 관련 단백질의 증가 또는 감소 유비쿼터신화에 의해 강하게 영향을 받는 기능적인 상호 작용 네트워크의 식별으로 이끌어 냈습니다.
또한 gemcitabine 치료 후 PCNA의 유비퀴티니션이 증가한 것으로 확인되었습니다. 배경이 크게 증가할 수 있기 때문에 두 개의 용출 단계 후에 일부 구슬이 전송되는 것을 피하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차는 다른 조건을 비교하여 특정 변경 사항을 식별할 수 있는 특정 번역 후 수정을 생성합니다.
첫 번째 다음 단계는 생화학적 접근에 기초하여 적어도 관심의 변경을 검증할 것입니다. 우리는 췌장암세포의 새로운 방법 그리고 기계장치를 확인하기 위하여 유비퀴틴 기지를 둔, 번역 후 수정을 탐구하기 위하여 이 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜 및 그밖 개발된 세계적인 때문에 다른 생물학 프로세스를 해독하기 위하여 성공적으로 채택되었습니다.
렌즈 바이러스는 BL-2 실험실에서 적어도 사용되어야합니다. Guanidine은 강력한 데스팅 에이전트이며 신중하게 사용해야합니다. 초음파 처리기는 귀에 해로울 수 있으며 다음 권장 사항을 사용해야 합니다.
