이 작품은 ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 및 Institut de 컨버전스 Q-life ANR-17-CONV-0005에 의해 지원되었습니다. CJ는 인스티투트 큐리의 지원을 받고 있습니다. 프랑스 국립연구청(ANR)은 ANR-12-BSV2-0007 및 ANR-17-CE13-0021, 인스티투트 국립 뒤암(INCA) 교부금 2014-PL BIO-11-ICR-1, 그리고 퐁당 부어 라 레쉐메디컬(FRM) 교부금 DEQ2010.30.16. MMM은 퐁도크 알츠하이머 보조금 FR-16055p에 의해 지원되며, 프랑스 알츠하이머 는 AAP SM을 부여 2019 n ° 2023. JAS는 마리 Skłodowska-Curie 보조금 협정 No 675737에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원되었으며, FRM 보조금 FDT201904008210. SB는 FRM 보조금 FDT201805005465에 의해 지원되었다.
우리는 Janke 연구소의 모든 구성원, 특히 J. 수프론뿐만 아니라 G. 라키치 (Institut MICALIS, AgroParisTech) 및 A. Gautreau (에콜 폴리 테크닉대학)의 프로토콜 설립 기간 동안 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 마우스 사육과 관리에 도움을 준 Institut Curie의 동물 시설에 감사드립니다.
J. 프랑켈과 M. 넬슨에 의해 개발 된 항체 12G10은 NICHD의 후원하에 개발된 개발 연구 하이브리드 종 은행에서 얻어졌고 아이오와 대학에 의해 유지되었습니다.

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여기에 설명된 방법은 세포주 및 단일 마우스 뇌에서 중량으로 고품질의 조립 능력이 있는 튜룰린을 신속하게 생성하는 플랫폼을 제공한다. 그것은 오랜 년 동안 분야에서 사용되는 소 뇌에서 튜룰린 정제의 금 표준 프로토콜을 기반으로16,17. 접근법의 한 가지 특별한 장점은 HeLa S3 세포의 현탁액 배양을 사용하는 것입니다. 이는 프로토콜이 임의의 세포생물학 실험실에서 비교적 쉽게 수행될 수 있게 하는 반면, 다른 튜룰린 정제방법(18,19,32,37)은 특정 장비와 전문 지식이 필요하며, 따라서 단백질 정제에 대한 강한 배경을 가진 실험실에서 주로 사용된다. 부착 된 세포주에서 소량의 튜룰린을 생산할 때 다양한 세포주를 사용할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 HeLa에서 튜룰린을 정제, U-2 OS, 그리고 HEK-293 세포. 대규모 정화가 필요한 경우, 수확된 세포 또는 뇌는 -80°C에 저장되어 용해 완충제에서 스냅 냉동및 저장될 수 있으며, 다중 세포 펠릿 또는 뇌를 함께 풀링하여 더 많은 양의 튜룰린을 정화할 수 있다.
세포주에서 정제된 투불린은 튜룰린 PTM이 거의 없습니다. 이 티르 튜부린은 쉽게 하나의 간단한 단계25에서detyrosined (deTyr-) 튜룰린으로 변환 할 수 있습니다. 다른 PTM을 사용하여 튜룰린을 생산하기 위해, 특정 튜룰린 변형 효소는 튜룰린 정화 전에 세포에서 과발현될 수 있다. 더욱이, 물질의 근원으로 인간 기원의 세포주를 사용하는 것은 microtubules와 인간 적인 MAPs 사이 상호 작용을 공부할 때 잠재적인 교차 종 문제를 피하는 것을 돕습니다. 또한, 변형되지 않은(HEK293) 또는 변형(HeLa 등) 세포로부터의 튜룰린은 정상 대 종양 세포 소과비에 대한 미세투필 지향 약물(예를 들어, taxanes)의 효과에 대한 정보를 제공할 수 있다.
마지막으로, 우리의 프로토콜은 단일 마우스 뇌에서 튜룰린의 정화를 용이하게. 튜룰린 돌연변이 및 수정의 마우스 모델수가 증가함에 따라, 이 프로토콜은 변경된 튜툴린 동종조성물(38,39,40 또는 튜룰린 PTM31, 41)과마이크로튜블러의 성질 및 상호작용의 직접적인 분석을 허용한다.
접근은 중합화 및 비합화의 주기를 기반으로 합니다. 따라서, 특정 튜룰린 동소형 또는 마이크로투블러의 조립 및 분해 특성에 영향을 미치는 특정 PTM을 가진 튜룰린은 정화 과정에서 그러한 튜룰린 형태의 불균형한 손실 또는 감소를 초래할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 우리는 아세틸화, 황량화, 글루타밀화 및 글리시네이션과 같은 주요 튜룰린 PTM이 튜룰린 정화공정(24)을통해 마이크로튜부에 유지되는 것을 보여주었습니다. 그러나, 세포 또는 조직에서 튜룰린 조성물의 정량적 분석을 위해, TOG 컬럼 계 튜룰린 정제 접근법은 편견, 중합-독립적인 튜룰린정제(18)를허용하기 때문에 더 적절하다는 점에 유의해야 한다. 그 한계에도 불구하고, 우리의 프로토콜은 체외 재헌법 실험에서 세심하게 사용할 수있는 고품질 튜룰린의 큰 양을 생성에 큰 이점을 제공합니다. 특히, 일상적인 실험에서 PTM이 풍부한 뇌 튜룰린의 사용을 용이하게한다.

마이크로튜브는 많은 세포 프로세스에서 중요한 역할을 합니다. 그(것)들은 세포에게 그들의 모양을 주고, 염색체 분리를 위한 메이오제 및 미토Tic 스핀들을 만들고, 세포내 수송을 위한 트랙역할을 합니다. 이러한 다양한 기능을 수행하기 위해 마이크로 튜버는 다른 방식으로 자신을 구성합니다. 이 분야의 흥미로운 질문 중 하나는 구조적으로 진화적으로 보존된 마이크로투블러가 조직과 기능의 이 과다에 적응할 수 있도록 하는 분자 메커니즘을 이해하는 것입니다. 한 가지 잠재적 메커니즘은'튜룰린코드'1,2,3로알려진 개념에 의해 정의되는 마이크로투부의 다양화이다. tubulin 코드는 두 가지 주요 구성 요소를 포함: α-및 β-tubulin 유전자 제품의 차동 통합 (tubulin 등색형) 마이크로 튜부 및 튜룰린 번역 후 수정 (PTM).
1970년대 부터 진화하는 빛 현미경 기술과 결합된 체외 재헌법 실험은 미세투부의 특성에 대한 중요한 발견의 길을 열어주었습니다: 동적 불안정4 및 러닝머신5,그리고 그들의 다른메커니즘및 기능6,7,7,9,11,12,13, 14,14,15. 지금까지 수행된 거의 모든 체외 실험은 중합및 중합제의 반복주기를 사용하여 뇌 조직에서 정제된튜룰린(tubulin)에기초해 왔다16,17. 뇌 조직에서 정제하는 것은 대량(보통 그램 양)으로 고품질 튜룰린을 얻는 이점을 부여하지만, 뇌 조직에서 정제된 튜룰린이 다른 튜룰린 동종형의 혼합물이며 많은 튜룰린 PTM이 풍부하기 때문에 한 가지 중요한 단점은 이질성입니다. 이러한 이질성은 마이크로튜블러 특성 및 기능의 제어에서 특정 튜룰린 PTM 또는 동소형의 역할을 묘사하는 것을 불가능하게 합니다. 따라서, 조절된 튜룰린 PTM 및 균질동형 조성물을 가진 조립 유능한 튜룰린을 생산하는 것은 튜룰린 코드의 분자 메커니즘을 해결하는 데 필수적이다.
최근에는 효모 Stu2p의 마이크로투블러 결합 TOG(종양 과잉 발현 유전자) 도메인을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 튜블러린을 정화하는 접근법이개발되었다. 이 방법에서, 세포 또는 조직의 조잡한 용해의 튜룰린은 주어진, 심지어 아주 작은, 샘플의 전체 tubulin 풀의 분석을 허용하는 매트릭스 고정 TOG 도메인에 결합하는 컬럼을 통해 전달된다. 재조합 튜룰린을 정화하기 위한 대망의 접근법도 최근 몇 년 동안 설명되어 있습니다. 그것은 α 및 β-tubulin 유전자를 포함하는 bi-cistronic 벡터가 곤충세포(19)에서발현되는 바쿨로바이러스 시스템을 기반으로 한다. 그러나, 이 방법은 매우 번거롭고 시간이 많이 소요되며, 따라서 주로 체외에서 튜룰린 돌연변이20 및 튜룰린 동소형21,22,23의 충격을 연구하기 위해 사용됩니다.
현재 프로토콜에서, 우리는 잘 확립되고 널리 사용되는 중합체-중합화 접근법을 세포주 또는 마우스 뇌조직(24)으로부터다른 수준의 변형으로 튜룰린을 생성하는 청사진으로 사용하는 방법을 설명한다. 이 절차에서, 튜룰린은 수용성(4°C의 튜룰린 이머)과 중합형(구아노신 5'-triphosphate[GTP]의 존재시 30°C의 마이크로튜블러)를 순환한다. 각 형태는 원심분리의 연속단계를 통해 분리된다: 튜룰린 조광기는 감기(4°C) 스핀 후 상부체에 남아 있는 반면, 마이크로튜부는 30°C에서 펠릿화된다. 더욱이, 하나의 중합 단계는 높은 piperazine-N,N-fis(2-에탄설포닉산) (PIPES) 농도에서 수행되며, 이는 마이크로투부에서 마이크로튜버 관련 단백질을 제거할 수 있게 해주며, 따라서, 최종 적으로 정제된 튜룰린으로부터 수행된다. 정지 또는 부착 배양으로 성장 한 HeLa S3 세포로부터 정제 된 Tubulin은 임의의 튜룰린 PTM이 거의 없으며 최근 시험관 내 재분학 실험25,26,27,28에서사용되어 왔다. 우리는 더 하나의 마우스 뇌에서 튜룰린을 정화하는 방법을 적응했다, 이는 튜룰린 등색형 및 PTM의 변화와 마우스 모델의 큰 숫자에 사용할 수 있습니다.
프로토콜에서, 우리는 먼저 원료의 생성을 설명 (세포 질량 또는 뇌 조직), 그것의 lysis(도 1A),튜룰린 중합 및 비합화의 연속 단계 다음 튜룰린정화(도 1B). 우리는 정제된 튜룰린의순도(도 2A, B)및 수량(도3A, B)을평가하는 과정을 더 설명한다. 상기 방법은 튜룰린정제(도 4B)에앞서 세포내 변형 효소를 과발현함으로써 선택된 PTM으로 농축된 튜룰린을 생성하도록 조정할 수 있다. 대안적으로, 튜룰린 변형 효소는 정화 과정에서 튜룰린에 첨가될 수 있다. 마지막으로, 해당 튜룰린 변형효소(도 4B)29에서부족한 쥐의 뇌로부터 특정 동소형 또는 PTM이 부족한 튜룰린을 정화할 수 있다.
여기서 설명하는 방법에는 두 가지 주요 장점이 있습니다: (i) 비교적 짧은 시간에 충분히 많은 양의 튜룰린을 생산할 수 있으며, (ii) 특정 튜룰린 동형 조성물 또는 PTM을 사용하여 고품질의 순수 튜룰린을 생성합니다. 이 원고의 관련 비디오에서는 이 절차와 관련된 몇 가지 중요한 단계를 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>1&amp;nbsp;M MgCl2&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M1028</td><td></td></tr><tr><td>1-L cell culture vessels</td><td>Techne F7610&amp;nbsp;</td><td></td><td>Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator&amp;rsquo;s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.</td></tr><tr><td>1.5- and 2-ml tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14-ml round-bottom tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-cm-diameter sterile culture dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-ml screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#M3148</td><td>2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.</td></tr><tr><td>4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A8456</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>5-, 10- 20-ml syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-ml screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10&amp;nbsp;</td><td>Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa</td><td></td><td>dilution: 1/500</td></tr><tr><td>Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335&amp;nbsp;</td><td>AdipoGen&amp;nbsp;</td><td>#AG-20B-0020</td><td>dilution: 1/20,000</td></tr><tr><td>Aprotinin&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A1153</td><td></td></tr><tr><td>Balance (0.1 &amp;ndash; 10 g)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 1-l polypropylene bottles&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For collecting spinner cultures</td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-26 XP centrifuge</td><td></td><td></td><td>For collecting spinner cultures</td></tr><tr><td>Biological stirrer&amp;nbsp;</td><td>Techne MCS-104L&amp;nbsp;</td><td></td><td>Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells</td></tr><tr><td>Bis N,N&amp;rsquo;-Methylene-Bis-Acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>#161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Blender IKA Ultra-Turrax&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#1.08122</td><td></td></tr><tr><td>Carboxypeptidase A (CPA)</td><td>Sigma</td><td>#C9268</td><td>Concentration: 1.7&amp;nbsp;U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator set at 37&amp;deg;C, 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>&amp;nbsp;Sigma&amp;nbsp;</td><td>#D8418</td><td>DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.</td></tr><tr><td>DMEM medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#41965062</td><td></td></tr><tr><td>DTT, DL-Dithiothreitol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#D9779</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Euromedex</td><td>#EU0007-C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>#E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#F7524</td><td></td></tr><tr><td>French pressure cell press&amp;nbsp;</td><td>Thermo electron corporation</td><td>&amp;nbsp;#FA-078A</td><td>with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>&amp;nbsp;VWR Chemicals&amp;nbsp;</td><td>#24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>#G8898</td><td></td></tr><tr><td>GTP&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#G8877</td><td></td></tr><tr><td>Heating block&amp;nbsp;</td><td>Stuart&amp;nbsp;</td><td>#SBH130D</td><td></td></tr><tr><td>Hela cells&amp;nbsp;</td><td></td><td>ATCC&amp;reg; CCL-2&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Hela S3 cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg; CCL-2.2&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl )</td><td>VWR</td><td>#20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>With fluorescence if cell transfection is to be verified</td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>#20842.298</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus&amp;nbsp;</td><td>#101</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 rotor&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For collecting spinner cultures</td></tr><tr><td>KOH&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#P1767</td><td>KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.</td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#25030123</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory centrifuge for 50-ml tubes</td><td>Sigma</td><td>4-16 K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#L2884</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropestles</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120.973</td><td></td></tr><tr><td>Mouse brain tissue&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.</td></tr><tr><td>Needles 18G X 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; (1.2 X 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#18G</td><td></td></tr><tr><td>Needles 20G X 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; (0.9 X 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#20G</td><td></td></tr><tr><td>Needles 21G X 4 &amp;frac34;&amp;rdquo; (0.8 X 120 mm</td><td>B.Braun</td><td>#466 5643</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#14190169</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#15140130</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#P7626</td><td>PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.</td></tr><tr><td>PIPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#P6757</td><td></td></tr><tr><td>Pipette-boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotors</td><td>Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE electrophoresis equipment&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>#1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>SDS, Sodium dodecyl sulphate&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>#442444H</td><td>For preparing Laemmeli buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SDS, Sodium dodecyl sulphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#L5750</td><td>For preparing &#039;TUB&#039; SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Sonicator&amp;nbsp;</td><td>Branson</td><td>#101-148-070</td><td>Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at &amp;ldquo;Output control&amp;rdquo; 1, &amp;ldquo;Duty cycle&amp;rdquo; 10% and time depending on the cell type used.</td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>5417R&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED, N, N, N&amp;prime;, N&amp;prime;-Tetramethylethylenediamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#9281</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A (TSA)</td><td>Sigma</td><td>#T8552</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base (Tris)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#15090046</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotors&amp;nbsp;</td><td></td><td>TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors</td><td>Set at 4&amp;deg;C or 30&amp;deg;C based on the need of the experiment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckman</td><td>#357448&amp;nbsp;</td><td>for using with TLA-55 rotor</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckman</td><td>#349622</td><td>for using with TLA-100.3 rotor</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckman</td><td>#355631&amp;nbsp;</td><td>for using with 70.1 Ti rotor</td></tr><tr><td>Ultracentrifuges</td><td>Beckman</td><td>Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent)</td><td>Set at 4&amp;deg;C or 30&amp;deg;C based on the need of the experiment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath equipped with floaters or tube holders</td><td></td><td></td><td>Set at 30&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles

미세 투외 세포 골격의 연구의 한 가지 중요한 측면은 체외 재구성 실험에서 미세 tubule 행동의 조사입니다. 그(것)들은 역학과 같은 microtubules의 본질적인 속성의 분석및 microtubule 관련 단백질 (MAPs)와의 상호 작용을 허용합니다. "tubulin 코드"는 마이크로 튜블러 특성 및 기능의 조절자로서 다양한 튜룰린 동종 형 및 다양한 번역 후 변형 (PTM)을 가리키는 새로운 개념입니다. 튜룰린 코드의 분자 메커니즘을 탐구하려면 특정 동종 및 PTM을 사용하여 정제 된 튜룰린을 사용하여 체외 재구성 실험을 수행하는 것이 중요합니다.
현재까지, 이것은 널리 체외 실험에서 사용되는 뇌 튜룰린으로 기술적으로 도전했다, 많은 PTM을 항구하고 정의 된 동종 조성을 가지고. 따라서, 우리는 중합 및 비합화 주기의 고전적인 접근 방식을 사용하여, 다른 소스와 다른 등류 조성 및 제어 된 PTM로 튜룰린을 정화하기 위해이 프로토콜을 개발했다. 선호도 정화에 기초한 기존 방법에 비해, 이러한 접근법은 중합또는 중합화에 내성이 있는 튜룰린이 연속정화 단계에서 버려짐에 따라 순수하고 중합화능력이 있는 튜룰린을 산출한다.
우리는 현탁액또는 부착 배양으로 성장한 세포주에서 튜룰린의 정제를 설명하고 단일 마우스 뇌에서 설명합니다. 이 방법은 먼저 서스펜션 및 부착 설정 모두에서 세포 질량의 생성을 설명하고, 용해 단계, 중합-폴리머화 주기에 의한 튜룰린 정화의 연속적인 단계를 설명한다. 우리의 방법은 관련 단백질과의 마이크로 튜부 및 마이크로 튜블러 상호 작용의 본질적인 특성에 대한 튜룰린 코드의 영향을 다루는 실험에 사용할 수있는 tubulin을 산출합니다.

이 방법의 주요 목표는 정제 된 구성 요소와 함께 반복 된 체외 실험을 수행하기에 충분한 수량으로 고품질의 조립 능력이있는 튜룰린을 생산하는 것입니다. 이 튜룰린에서 조립된 마이크로튜블러는 동적 또는 안정적인 마이크로튜부를 이용한 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 기술, 미세투부역학, MAP 또는 분자 모터와의 상호 작용 및모터(25)에의한 힘 발생을 테스트하는 실험에서 재구성 된 해석에 사용될 수 있다. 그들은 또한 마이크로 튜블러-MAP 공동 펠릿 분석 및 고체 상태 NMR 분광법28에서사용할 수 있습니다.
정화 공정 전반에 걸쳐 튜룰린의 농축및 순도는 쿠마시 염색 된 SDS-폴리 아크라이알라미드 젤 전기 포근 (PAGE) 젤을 사용하여 모니터링 할 수 있으며, 바람직하게는 'TUB' SDS-PAGE 젤을 사용하여 단일 반밴드로 공동 이동하는 α 및 β 튜룰린의분리를허용합니다. 다양한 단계에서 수집된 용해(최후의 비합화를 제외하고, 프로토콜 참조)는 튜룰린 정제의 성공을 평가하기 위한 비교 가능한 양으로 젤에 적재된다(도2A)24. 매우 귀중한 최종 튜룰린 샘플은 튜부린 농도의 측정을 위해 젤에만 로드됩니다. 중합 및 비합화의 반복 사이클의 과정에서 일부 튜룰린을 잃는 것은 정상입니다. 최종 정제 된 튜룰린의 예상보다 낮은 수율은 (i) 마이크로 투블러의 불완전한 비합화로 인해 될 수 있으며, 분수 P3, P5 및 P7, 또는 (ii) 마이크로튜부로비효율적인 튜룰린 중합화가 존재하는 중요한 양의 튜룰린의 존재에 의해 시각화되며, 이 경우 더 적은 양의 튜룰린이 분획 P2, P4 및 P6 이상분획 SN2, SN4 및 SN6(그림2B)에서존재한다. 중합 단계(P2 및 P4의 더 적은 양)(i)가 중합(ii) GTP의 신선한 알리쿼트를 사용하는 동안 충분한 튜룰린 농도를 보장하고,또는(iii) 중합 반응의 온도를 재확인한다. 투룰린이 비합합 단계(SN3 및 SN5의 더 적은 양)에서 분실되면, 얼음에 혼합의 시간뿐만 아니라 파이펫팅을 증가시면.
정제된 튜룰린의 정량화를 위해, SDS-PAGE에서 소 세럼 알부민(BSA, 0.5 μg – 1 μg – 2 μg – 4 μg)(그림 3A)의알려진 수량과 함께 샘플을 실행한다. 젤은 쿠마시 블라스트 블루, 스캔, BSA 및 튜룰린 밴드의 강도로 염색되어 https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ 설명된 정량적밀도(도 3B)에의해 측정됩니다. 동일한 분석은 피지에서 수행 할 수 있습니다, ImageJ33의업그레이드 된 버전. BSA 대역의 값은 튜룰린 대역에서 단백질의 양을 계산하는 데 사용되었던 선형 회귀 방정식을 결정하는 데 사용되었습니다. BSA 곡선 범위 내에서 튜룰린 밴드 강도만 사용하여 튜룰린 농도를 결정합니다. 계산된 튜룰린 농도에 기초하여, 원하는 부비의 알리쿼트(aliquots)가 액체 질소로 제조되고, 스냅 냉동되어 -80°C에 저장된다. 우리는 일반적으로 HeLa S3 서스펜션 배양물 4 개 스피너 병 (세포의 ~ 15 g), 10 15cm 직경의 요리 (세포 1.2 g)에서 - 250 μg의 튜룰린과 마우스 뇌 조직 1 g에서 - 1 mg의 튜룰린을 얻습니다.
특정 튜불린 이소타입 또는 수정의 농축을 확인하기 위해, 정제된 튜불린의 ~0.1 μg는 각각의 항체를 사용하여 면역블레드될 수 있다34,35. 컨트롤 튜룰린은 관심의 튜룰린에 따라 달라집니다. 변형 효소로 체외에서 변형된 튜룰린의 경우 비처리 된 튜룰린을 제어로 사용하십시오. 변종의 과발현에 의해 셀룰로에서 변형된 튜불린의 경우, 효소를 대조군으로 표현하지 않는 세포로부터 정제된 튜불린을 사용한다(도4A). 녹아웃 마우스 뇌로부터 정제된 튜룰린에 대한 제어 튜룰린은 야생형마우스(도 4B)로부터튜룰린이 될 것이다. 모든 면역블롯 분석에서, PTM 독립적인 α-투룰린 항체(12G10)를 사용하여 동일한 부하의 튜불린이 검증된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61826/61826fig01.jpg"> 도 1: 중합-중합 주기를 사용하여 다른 소스로부터 의 투룰린 정제. (A)튜룰린의 다른 소스는 특정 전략을 사용하여 lysed. 현탁액에서 배양된 HeLa S3 세포는 프랑스 언론을 사용하여 용액을 제거합니다. HEK-293 세포는 반복적인 파이펫팅에 의해 용해된다. 부착 세포는 조직 균질화를 사용하여 초음파 처리 및 마우스 뇌 조직의 짧은 펄스를 사용하여 용해되었다. (B)냉중합 및 온수 중합의 주기를 이용한 튜룰린 정화 프로토콜의 연속단계의 회로도 표현. 용액과 용액 설명 후, 마이크로 투튜브는 중합및 펠릿화된다. 마이크로튜블은 그 때 중합화되고 그 후에 고어도 완충제에서 중합하게 허용되고, 마이크로튜버와 함께 마이크로투알 관련 단백질(MAP) 공동 침전을 방지합니다. MAP-free 마이크로튜블은 그 후 중합화-중합제의 제3주기를 더 거쳐 고약함 버퍼의 미량을 제거할 수 있다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61826/61826fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61826/61826fig02.jpg"> 그림 2: 튜룰린 정화의 성공 평가. 튜룰린 정화 프로토콜의 다른 단계에서 수집된 샘플은 'TUB' 나트륨 도데딜설라테-폴리아크라이알라미드 젤 전기포아증(SDS-PAGE) 젤(자세한 내용의 프로토콜 참조)에서 실행되었으며 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. (A)성공적인 튜룰린 정화에서 α 및 β 튜룰린은 과정 전반에 걸쳐 점진적으로 풍부합니다. 제2 중합 후, 마이크로튜브 펠릿(P4)은 다른 단백질 또는 마이크로튜트 관련 단백질(MAP)으로부터 거의 오염이 없다. 절차 중에 튜룰린을 잃는 것은 정상입니다. (B)실패한 튜룰린 정제에서 최종 튜룰린 수율은 낮으며, 투룰린은 중합 후 또는 중합 후 상부체(red box)에 남아 있다. 여기에 나타난 예에서, 튜룰린은 두 중합 단계에서 효율적으로 중합하지 않았다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61826/61826fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61826/61826fig03.jpg"> 그림 3: 쿠마시 염색 나트륨 도데실설페이트-폴리아크라이알라미드 젤 전기포레시스(SDS-PAGE) 젤 및 밀도를 사용하여 정제된 튜룰린의 정량화. (A)쿠마시 스테인드 SDS-PAGE 젤은 소 세럼 알부민(BSA; 0.5, 1, 2 및 4 μg, 회색 그라데이션 라인) 및 정제된 튜룰린의 다른 부피(각각 0.5 및 1 μL, 빛 및 어두운 색상)의 알려진 수량을 가진 겔. 표시된 예에서, 티로시네이트 튜룰린(HeLa S3 tubulin, 밝고 다크 오렌지) 및 탈티로시네이트 튜룰린(Carboxypeptidase A로 처리된 HeLa S3 tubulin, 가볍고 진한 파란색)이 젤에 적재되었다. (B)B) BSA 대역으로부터 (A)는 ImageJ(임의 단위, AU)를 사용하여 정량화하고 적재된 단백질의 양(회색에서 검은 색 점에)에 대하여 플롯하였다. 이러한 점은 겔에 로드된 튜룰린 샘플(빛과 진한 주황색 및 파란색 점)에서 단백질의 양을 계산하는 데 사용된 선형 회귀 선(회색 그라데이션 라인) 및 방정식을 계산하는 데 사용되었습니다. 이것은 튜룰린 샘플의 농도의 계산을 용이하게. BSA 표준 곡선을 초과하는 점을 사용하여 농도(짙은 주황색 및 파란색 점)를 결정해서는 안 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61826/61826fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61826/61826fig04.jpg"> 그림 4: 다른 PTM을 가진 정제 된 튜불린의 면역 블롯 분석. (A)HEK-293 세포로부터 정제된 투굴린: GT335 항체를 이용한 폴리글루타밀화의 특이적 농축을 위해 TTLL5 또는 TTLL7을 과발현하는 세포가 분석되었다. TTLL5 과발현은 α 및 β 튜룰린에서 폴리글루타밀레이션을 증가시지만 TTLL7 과발현은 특히 β-튜룰린 글루타밀레이션을 풍부하게 합니다. (B)투툴린은 야생형 및 ttll1-/-마우스의 뇌 조직으로부터 정제된 글루타밀화 의 패턴을 분석하였다. 주요 뇌 글루타밀라제 TTLL136이부족한 ttll1-/-마우스로부터 튜룰린의 폴리글루타밀화의 강력한 감소를 주목한다. 'TUB' 젤은 α 및 β 튜룰린을 분리하는 데 사용되었습니다. 12G10, 항-α-튜룰린 항체에 의해 동일한 양의 튜룰린 하중이 확인되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61826/61826fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

이 프로토콜은 중합 및 중합 주기를 사용하여 배양 된 세포 또는 단일 마우스 뇌와 같은 중소 규모의 소스에서 튜룰린 정제를 설명합니다. 정제 된 튜룰린은 특정 동종형으로 풍부해지거나 특정 번역 후 변형을 가지며 체외 재관체 검사에서 미세 tubule 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

purification-tubulin-with-controlled-posttranslational-modifications

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.0K 조회수.  Institut Curie. 이 프로토콜은 중합 및 중합 주기를 사용하여 배양 된 세포 또는 단일 마우스 뇌와 같은 중소 규모의 소스에서 튜룰린 정제를 설명합니다. 정제 된 튜룰린은 특정 동종형으로 풍부해지거나 특정 번역 후 변형을 가지며 체외 재관체 검사에서 미세 tubule 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

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Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

연구

생화학

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

공학

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is especially the case during mitosis or meiosis, where the microtubules form the spindle during cell division. The spindle is the machinery used to segregate genetic material during cell division. Toward creating self-organized spindles in vitro, we recently developed a technique to reconstitute microtubules into spindle-like assemblies with a minimal set of microtubule-associated proteins and crowding agents. Specifically, MAP65 was used, which is an antiparallel microtubule crosslinker from plants, a homolog of Ase1 from yeast and PRC1 from mammalian organisms. This crosslinker self-organizes microtubules into long, thin, spindle-like microtubule self-organized assemblies. These assemblies are also similar to liquid crystal tactoids, and microtubules could be used as mesoscale mesogens. Here, protocols are presented for creating these microtubule tactoids, as well as for characterizing the shape of the assemblies using fluorescence microscopy and the mobility of the constituents using fluorescence recovery after photobleaching.

This article presents a protocol for the formation of microtubule assemblies in the shape of tactoids using MAP65, a plant-based microtubule crosslinker, and PEG as a crowding agent.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the posttranslational modifications, microtubules can form complexes with various interacting proteins. These microtubule-protein complexes are often implicated in human diseases. Understanding the structure of such complexes is useful for elucidating their mechanisms of action and can be studied by cryo-electron microscopy (cryo-EM). To obtain such complexes for structural studies, it is important to extract microtubules containing or lacking specific posttranslational modifications. Here, we describe a simplified protocol to extract endogenous tubulin from genetically modified mammalian cells, involving microtubule polymerization, followed by sedimentation using ultracentrifugation. The extracted tubulin can then be used to prepare cryo-electron microscope grids with microtubules that are bound to a purified microtubule-binding protein of interest. As an example, we demonstrate the extraction of fully tyrosinated microtubules from cell lines engineered to lack the three known tubulin-detyrosinating enzymes. These microtubules are then used to make a protein complex with enzymatically inactive microtubule-associated tubulin detyrosinase on cryo-EM grids.

Here, we describe a protocol to extract endogenous tubulin from mammalian cells, which can lack or contain specific microtubule-modifying enzymes, to obtain microtubules enriched for a specific modification. We then describe how the extracted microtubules can be decorated with purified microtubule-binding proteins to prepare grids for cryo-electron microscopy.

초저온 전자 현미경으로 미세소관-단백질 복합체를 연구하기 위해 포유류 세포에서 변형된 미세소관 추출

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit dynamic instability as tubulin heterodimer subunits undergo repetitive polymerization and depolymerization. Precise control of microtubule stability and dynamics, achieved through tubulin post-translational modifications and microtubule-associated proteins, is essential for various cellular functions. Dysfunctions in microtubules are strongly implicated in pathogenesis, including neurodegenerative disorders. Ongoing research focuses on microtubule-targeting therapeutic agents that modulate stability, offering potential treatment options for these diseases and cancers. Consequently, understanding the dynamic state of microtubules is crucial for assessing disease progression and therapeutic effects.
Traditionally, microtubule dynamics have been assessed in vitro or in cultured cells through rough fractionation or immunoassay, using antibodies targeting post-translational modifications of tubulin. However, accurately analyzing tubulin status in tissues using such procedures poses challenges. In this study, we developed a simple and innovative microtubule fractionation method to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues.
The procedure involved homogenizing dissected mouse tissues in a microtubule-stabilizing buffer at a 19:1 volume ratio. The homogenates were then fractionated through a two-step ultracentrifugation process following initial slow centrifugation (2,400 &#215; g) to remove debris. The first ultracentrifugation step (100,000 &#215; g) precipitated stable microtubules, while the resulting supernatant was subjected to a second ultracentrifugation step (500,000 &#215; g) to fractionate labile microtubules and soluble tubulin dimers. This method determined the proportions of tubulin constituting stable or labile microtubules in the mouse brain. Additionally, distinct tissue variations in microtubule stability were observed that correlated with the proliferative capacity of constituent cells. These findings highlight the significant potential of this novel method for analyzing microtubule stability in physiological and pathological conditions.

Microtubules, which are tubulin polymers, play a crucial role as a cytoskeleton component in eukaryotic cells and are known for their dynamic instability. This study developed a method for fractionating microtubules to separate them into stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin to evaluate the stability of microtubules in various mouse tissues.

마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 정량적 미세소관 분획 기술

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

<meta charset="utf8"></head><body>신경 조직에서 효율적인 Tubulin 분리

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we present a procedure for extracting tubulin that can be employed, with minor modifications, for neural tissue from multiple sources. In the presented protocol, a new clarification step of the crude lysate has been introduced, which led to a significant reduction in the initial amount of insoluble debris before the first polymerization step occurred. This additional step allowed the processing of additional tissue while using the same instrumentation and, thus, increasing the relative volume of the processed homogenate. The newly introduced step has no significant effect on the quality of purified tubulin, as confirmed by in vitro activity assays and transmission electron microscopy. The described procedure contains all crucial steps, including tissue collection, transport, tissue homogenization, tubulin isolation cycles, and final polishing by ion exchange chromatography using FPLC and subsequent activity measurement assays. The homogeneity of purified tubulin was more than 97%, as confirmed by MS/MS analysis utilizing electrospray ionization and MALDI-TOF.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 단백질 역학 및 치료 응용 분야를 연구하기 위한 고품질 튜불린 정제

This protocol describes a technique for the high-yield isolation of tubulin from the porcine brain optimized for small-scale instrumentation. The isolation procedures are complemented by procedures for determining tubulin polymerization activity in vitro using co-sedimentation assays and transmission electron microscopy.

돼지 뇌 조직에서 Tubulin 수율 최적화

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화

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단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

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Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

미세 소관 선인장체의 자체 조립

초저온 전자 현미경으로 미세소관-단백질 복합체를 연구하기 위해 포유류 세포에서 변형된 미세소관 추출

마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 정량적 미세소관 분획 기술

돼지 뇌 조직에서 Tubulin 수율 최적화

돼지 뇌 조직에서 Tubulin 수율 최적화

돼지 뇌 조직에서 Tubulin 수율 최적화