우리 크리스티나 Pyrgaki, 타오 통, 앨리슨 북쪽에 록펠러 대학 Bioimaging 리소스 센터에서 감사 하 고 지원 합니다. 우리는 또한 영화 편집: Xiphias Ge Zhu 감사합니다. 이 작품에서 인간 프론티어 과학 프로그램 조직 (PC)를 지원 했다.

동물 관리 및 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 록펠러 대학에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1. 조직 준비
<ol><li>혈액은 조직에서 완전히 제거 될 때까지 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 ~ 20 mL와 함께 표준 intracardiac 관류를 수행 합니다.</li>
	<li>목과 꼬리는 크게 굳 어 때까지 perfusate ~ 20 mL 통 솔루션 (4 %paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS에) 4 ° C에서의 전환. 주의: PFA 독성이 있다. 피부, 눈 및 점 막과의 접촉을 피하십시오. 솔루션은 증기 두건 안쪽 여야 한다.</li>
	<li>신중 하 게 그것을 손상 하지 않고 전체 지방 패드를 제거 하는 관심의 지방 패드를 해 부. 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 곤란 또는 조직을 압박을 피하기 위해. 모든 모피와 해 부 조직을 오염 하지 마십시오.</li>
	<li>후 4% PFA 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤에 조직 수정 각 지방 패드 15 mL 원뿔 튜브에 고정 솔루션의 ~ 10 mL와 수정 후.</li>
	<li>실 온 (RT)에서 조직 1 x PBS로 3 회 (각 1 시간)을 씻어.</li>
	<li>단기 (최대 2 주)에 대 한 조직 4 ° C에서 1 x PBS에 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 장기 저장 (예를 들어, 1-2 년)에 대 한 전환 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 1 x PBS (방부 제)로. 주의: 나트륨 아 지 드 구두로 섭취 또는 피부를 통해 흡수 하는 때 매우 독성이 있다. 나트륨 아 지 드 솔루션 (5% 이상) 증기 두건에서 처리 되어야 집중.</li>
</ol>2. Delipidation 및 Permeabilization
타이밍: 1-2 일
<ol><li>20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올 그라데이션 B1n 버퍼 (표 1) (v/v), 예를 들어, 20% 메탄올/B1n 버퍼에 대 한 준비, 메탄올의 20 mL와 B1n 버퍼의 80 mL를 혼합. 4 ° c.에 모든 버퍼 저장 글리신 결정 채도 인해 60% 및 80% 메탄올/B1n 버퍼에서 침전 한다. 크리스탈;를 제거 하지 마십시오 액체 솔루션을 사용 하 여 다음 세척에 대 한. 주의: 메탄올은, 자극성, 휘발성 및 가연성. 피부 또는 눈 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 머리를 제거 합니다. 어떤 머리, 보풀, 또는 파편 샘플에 연결 된 이미징 동안 그림자를 발생 합니다. 새로운 튜브로 청소 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>달리 명시 하지 않는 한 또는 얼음에 4 ° C에서 다음 단계를 모두 수행 합니다. (예를 들어, 젊은 마른 쥐에서 후부 피하/perigonadal 지방 패드) 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 (예를 들면, 비만 쥐에서 지방 패드) 높은 지질 콘텐츠로 샘플 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.<ol>
<li>가로로 설정 궤도 셰이 커에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓고 ~ 100 rpm. 샘플 튜브 안에 자유롭게 이동할 수 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100% 메탄올/B1n 버퍼의 등급된 시리즈에서 샘플을 탈수. 이어지기 솔루션을 최소화 합니다.</li>
	<li>Delipidate 100 %dichloromethane (DCM)와 샘플 (3 회), 부 화 시간에 각각 표 2에 표시. 샘플의 두 번째 및 세 번째 DCM 세척 끝 튜브의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우 전체 delipidation를 위해 보육 시간 연장 (예를 들어, 30 분에서 1-2 시간까지). 주의: DCM 연기 후드 안에 처리 되어야 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 튜브 외피에 대 한 폴 리 프로필 렌에서 만들어집니다. Microcentrifuge 튜브 DCM의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 serological 펫 폴리스 티 렌에서 DCM와 호환 되지 않습니다. DCM은 매우 휘발성 이다. 신속 하 게 건조를 방지 하기 위해 신선한 솔루션에는 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 100% 메탄올으로 두 번 세척.</li>
	<li>옵션: 없으면 샘플 잘 perfused, 나머지 적혈구에서 헤모글로빈의 색 될 수 있습니다 강한 autofluorescence. 4 ° c.에 하룻밤 메탄올 (메탄올의 5 볼륨 30% H2O2 의 1 볼륨)에서 5% H2O2 와 표 백제</li>
	<li>반전된 메탄올/B1n 버퍼 시리즈에서 샘플 rehydrate: 80%, 60%, 40%, 20% 메탄올/B1n, 및 100 %B1n 버퍼 (2 회) 지정 된 시간 (표 2).</li>
	<li>실시간에서 PTxwH 버퍼 (표 1) 2 시간에 대 한 샘플을 씻어</li>
	<li>Delipidated 샘플 4 ° C (최대 1 년)에서 PTxwH 버퍼에 저장 하거나 immunostaining 단계로 바로 진행 합니다.</li>
</ol>3. 전체 마운트 Immunostaining
타이밍: 8-10 일
참고: 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호, 언급 하지 않는 한. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다. 먼저 조직 또는 메탄올 처리 조직 단면도의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 1 차적인 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g에서 원심</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션 delipidated 샘플을 품 어.</li>
	<li>일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 샘플을 세척: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.</li>
	<li>권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 이차 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g 에서 원심 참고: 조직 autofluorescence에 의해 발생 하는 높은 백그라운드를 방지 하려면 fluorophores 빨간색과 빨강 영역에 빛을 방출로 활용 된 이차 항 체는 권장 됩니다. 현미경에 레이저 라인 수에 따라 최대 3-4 마커 수 수 몇 군데 동시에 하나의 샘플에.</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 2 차 항 체 솔루션 샘플을 품 어.</li>
	<li>일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 세척 샘플: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.</li>
	<li>옵션: 조직 유형 연약한, 수정 얼룩진된 조직 4% PFA 1 x PBS에 조직 형태를 유지 하기 위해 4 ° C에서 하룻밤. 참고:이 단계는 이미징 배경을 증가할 수 있습니다. 지방 조직에 대 한이 단계를 수행할 필요는 없습니다.</li>
	<li>1 x PBS와 샘플 일련의 인큐베이션 단계에서 세척: 5 분, 10 분, 그리고 30 분.</li>
	<li>부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 린 트를 제거 합니다.</li>
</ol>4. 조직 개간
타이밍: 1-2 일
<ol><li>선택 사항: agarose 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한 샘플 장착을 촉진 하기에 샘플을 포함 합니다. 참고:이 단계는 좋습니다 이미징 동안 모양을 안정화를 지방 조직에 대 한.<ol>
<li>1 x PBS (w/v)에서 1 %agarose 포함 솔루션을 준비 합니다. 포함 솔루션 쿨 ~ 40 ° C ~ 샘플 과도 한 열을 노출 하지 마십시오.</li>
		<li>(예, 페 트리 접시 또는 보트 무게) 금형 청소 샘플을 배치 하 고 원하는 위치에 정렬. 어떤 액체의 carryover를 하지 마십시오. 부드럽게 샘플 포함 솔루션을 붓는 다. 어떤 공기 방울을 피하십시오.</li>
		<li>완전 실시간 컷에 샘플을 포함 하는 블록을 공고히 하는 agarose를 하자. 참고: 하룻밤 외피를 포함 하 여 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 H2소개할 25%, 50%, 75% 및 100% (3 회)와 메탄올에서에서 샘플을 탈수. 참고: 샘플 100% 메탄올 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>(3 회)을 떨고와 1 시간에 대 한 100 %DCM 샘플을 품 어. 샘플 각 DCM 세척의 끝에 관의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우에 메탄올의 완전 제거를 보장 하기 위해 보육 시간 연장. 샘플은 100 %DCM 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>일치 하는 굴절률을 달성 하기 위해 가벼운 떨고와 dibenzyl 에테르 (DBE)에 샘플 밤새 품 어. 참고: 샘플 결국 가시 광선에 투명 하 게 될 것 이다. 주의: DBE 위험입니다. 피부와 접촉을 하지 마십시오. 두 계층 장갑 연기 후드 안에 그것을 처리 합니다. 최대한 빨리 그것은 DBE와 함께 오염 된 장갑을 삭제 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 관 (폴 리 프로필 렌) 외피에 대 한. Microcentrifuge 튜브 DBE의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 폴리스 티 렌에서 혈 청 학적인 펫 DBE와 호환 되지 않습니다. 100% 에탄올으로 어떤 유출 청소.</li>
	<li>어둠 속에서 RT에서 샘플 2 h. 저장소 떨고 가벼운와 신선한 DBE와 함께 샘플을 품 어 나 영상에 직접 진행. 참고: 샘플은 한 달 내 이미지를 권장 됩니다. 특정 fluorophores 다른 사람 들 보다 더 안정 되어 있지만,이 단계에서 샘플의 장기 보관 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>5입니다. 현미경
<ol><li>빛-시트 현미경 DBE와 호환 되는 이미지입니다. 참고: 유기 용 매 기반 이미징에 대 한 승인 되 고 DBE의 굴절률과 일치 하는 유일한 목표는 DBE 몰입 이미징에서 목표를 찍기로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>Agarose 포함 샘플 영상 동안 움직임을 막을 수 있는 홀더에 탑재 합니다. DBE 채워진 챔버로 샘플을 담가.</li>
		<li>Z-스택 전체 샘플 (예를 들어, 1-2 배 확대) 전체 조직 유통/관심의 마커의 구조를 취재를 수집 합니다.</li>
		<li>(예를 들어, 4-12 배 확대) 자세한 구조를 이미지를 관심 영역을 확대 하려면 더 높은 확대와 함께 목표를 전환 합니다. 참고: 콜라겐 지방 조직, 주변 모든 지방 세포13의 기질에 큰 기여입니다. 콜라겐은 약 400에 이르기까지 일반적인 방출 스펙트럼 550 nm14nm. 488 레이저 선 (녹색)으로 샘플을 상상 하 고 내 콜라겐 (예를 들어, 525-550 nm)의 방출 스펙트럼 파장 범위에서 방출된 빛을 수집 이전에 보여 줬던 조직 autofluorescence 신호를 제공할 것입니다. 지방 세포 윤곽 및 전반적인 조직 아키텍처12를 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>거꾸로과 이미징 confocal 또는 두 광자 현미경.<ol>
<li>모든 플라스틱 부품 (또는 인감 수 있습니다 기타 DBE 호환 이미징 챔버)을 건드리지 않고 agarose 포함 샘플 챔버 슬라이드 유리 바닥에 놓습니다. DBE 밖으로 누출 되지 않는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>더 깊은 침투를 달성 하 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택 하십시오. 참고: 이미지는 챔버 슬라이드의 유리 바닥을 통해 거꾸로 또는 2 광자 공초점 현미경으로 행해져야 한다. 샘플 및 찍기 DBE 기반 이미징에 대 한 제안 하지 목표 사이의 직접 접촉을 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

Adipo 명확한 지방 조직, 일반 랩 설치에서 쉽게 실행 될 수 있는 삭제 위한 간단 하 고 강력한 방법입니다. IDISCO 등 다른 용 매 기반 개간 방법 비교 / iDISCO +10,,1112, Adipo 클리어는 특히 지방 조직 및 다른 조직 높은 지방 콘텐츠를 지우기. Delipidation 단계 완전히 지방에서 지질을 제거 합니다 및 따라서 전체 조직에 걸쳐 immunolabeling를 용이 하 게 하 고 크게 XY 해상도의 손실 없이 엔드-투-엔드 이미징 수 있도록 가벼운 살포를 최소화 합니다. 형광 빛 시트 뿐만 아니라 현미경 confocal 큰 조직의 빠른 검색을 제공 하는 및 2 광자 현미경 사용할 수 있습니다 또한 높은 해상도 더 많은 정보를 얻기 위해.
메탄올/DCM을 기반으로 delipidation는 중요 한 단계입니다. 부족 한 delipidation는 조직의 핵심으로 특히, 이미지를 흐려에 발생할 수 있습니다. DCM에서 침 몰 하는 많은 샘플을 관찰 하 여 지질의 완전 제거를 보장 하기 위해 중요 하다. 조직 유형 (예를 들어, epididymal 지방 epididymis와 연결 된 고환)의 혼합물을 포함 하는 샘플 확장된 DCM 외피와도 완벽 하 게 싱크 하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이러한 샘플 DCM에서 하룻밤 배양 완전 한 delipidation를 달성 해야 합니다. 이 유기 용 매에 있는 단백질의 변성으로 인해 특정 항 체 delipidation 단계와 호환 되지 않을 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜에 대 한 또 다른 중요 한 단계 된다 적합 한 항 체를 선택. 먼저 메탄올 처리 조직 단면도 또는 조직 Adipo 클리어 처리의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 메탄올/DCM/DBE와 화학 염료의 호환성도 응용 하기 전에 테스트 해야 합니다.
프로토콜의 한 가지 한계는 endogenously 표현된 형광 단백질의 냉각. 유기 용 매 기반 delipidation 및 개간 단계 크게 이러한 단백질 변성. 내 인 성 형광 단백질을 시각화 하기 위해 항 체 라벨를 채택 될 필요. 적합 한 항 체 조합의 가용성 높은 이미징 다중화 수행 기능을 제한 합니다. 현재 사용 가능한 빛 시트 현미경만 최대 4 채널 이미지를 우리을 허용합니다.
Adipo 명확한 filamentous 구조와 지방 조직에 상대적으로 낮은 밀도가지고 세포 인구를 시각화에 대 한 특히 유용 합니다. 그러나, 고밀도 신호 이미징이 접근으로 제한 된다. 항 체 밀도 신호를 사용 하는 조직 내부에 접근을 차단 하는 샘플의 표면에 있는 epitopes에 의해 격리 될 수 있습니다. 따라서, 작은 화학 프로브는 조밀한 구조를 얼룩 것이 좋습니다. 같은 문제로 Adipo 클리어의 갈색 지방 조직에 응용 프로그램 제한 됩니다. 갈색 지방이 조밀한 구조를 가진 지방 창 고 이다. 조밀한 혈관 및 신경 신경 분포, 그것은 또한 밀접 하 게 작은 adipocytes 미토 콘 드리 아17의 많은 수를 포함 하는 포장. CD31와 일을 적용할 때 같은 얼룩 갈색 지방, 샘플의 표면에만 위에서 설명한 절차 분류 됐다 (데이터 표시 되지 않음). 또한, 갈색 지방 강한 조직 autofluoresence, 이미징 동안 낮은 신호 대 잡음 비율에 지도 생성 합니다. 갈색 지방이 더 작은 조각으로 잘라 하 고 가능 하면 화학 프로브를 사용 하는 것이 좋습니다.
전반적으로, Adipo 지우기 관심의 여러 구조의 동시 프로 파일링 수 전체 지방 조직에서 고해상도. 이 방법을 사용 하 여, 하나의 신경 예측, 맥 관 구조, 면역 세포, adipocytes 등 구조 전체 지방 패드를 통해 작용 하는 방법을 분석할 수 있습니다. 그것은 방지 단면 또는 관심 영역을 선택 하 여 편견된 이미징 데이터를 제공 합니다. Adipo 명확한 계보 추적 연구에서 체형 시 조 및 전조 세포의 분포 뿐만 아니라 초기 morphogenesis 이벤트 등 많은 개발 연구에 적용할 수 있습니다. 지방, 뿐만 아니라 Adipo 명확한 수 있습니다 또한 높은 지질 콘텐츠 또는 지방, 유선, 지방 림프절 등으로 둘러싸인 다른 조직의 3D 전체 산 분석을 촉진 한다. 이 메서드는 또한 생리 및 병 적인 조건에서 인간의 지방 조직 조직학을 공부 하는 기회를 제공 합니다.

최근까지, 지방이 많은 직물 지방 세포의 비정 질 컬렉션으로의 잉태 했다. 지난 몇 년간 우리의 이해 지금 adipocytes, 체형 선구자의 종류, 면역 세포, 섬유 아 세포, 맥 관 구조, 및 신경 예측을 포함 하는 복잡 한 기관 수를 인식 하는 지방으로 더 정교한 성장 했습니다. 이 지방 주민 세포 간의 상호 작용 효과 지방 조직 및 organismal 생리학 및 이상1발음 있다. 신흥 연구 기본 특정 상호 작용 하는 중요 한 분자 메커니즘 unraveled 있다, 하지만 더 포괄적인 이해 안정적인 구조 프로 파일링 3 차원 (3D)에 전체 조직의 필요 합니다.
지방이 많은 직물 형태학의 우리의 현재 지식은 기반 상대적으로 높은 확대 화상 진 찰 (10 X) 가진 얇은 단면도 (5 μ m)의 조직학 분석2,3. 그러나,이 방법은 몇 가지 중요 한 제한이 있다. 첫째, 복잡 한 등 교감 신경 맥 관 구조, 많은 기능4,5,,67에 중요 한 역할을 알려져 있습니다 filamentous 구조는 평가 하기 어려운 통해 얇은 섹션입니다. 둘째, 겉보기 무 조직 모양 및 대표적인 구조 단위에 초점의 부족, 그것은 지방 조직 구조 섹션 얼룩에 기반으로 감사 어렵다. 셋째, 지방 조직 취득 3D 해 부 재건, 전체 두뇌 형태학8을 연구 하는 데 사용 하는 기존의 방법에 대 한 적합 한 일관 된 직렬 섹션에 과제를 만드는 매우 높은 지질 내용을 있습니다. 이러한 요소를 감안할 때, 아직도 세포 해상도 달성 하면서 전체 지방 서비스 센터의 3D 시각화를 제공할 수 있는 전체-마운트 접근에 대 한 중대 한 필요가 있다.
전체 장기의 3 차원 체적 영상 도전 가벼운 살포의 가려지는 효과 때문 이다. 생물 학적 조직의 빛 분산의 주요 원천이 지질 수성 인터페이스에서 온다. 지질을 제거 하 여 피해를 제거 하는 노력에 대 한 지속적인 세기 왔다, 하지만 많은 수의 최근 혁신9되었습니다. 하나 같은 새로 개발 조직-개간 방법은 용 매 허가 기관의 immunolabeling 기반 3D 이미징 (iDISCO / iDISCO +)10,11. 그러나 지방 조직 특정 도전 주어진 지질 높은 수준을 제공 하는, 따라서는 iDISCO 추가 수정 / iDISCO + 프로토콜 완전히 붕괴에서 조직을 보호 하면서 지질을 추출 하는 데 필요한. 수정된 프로토콜을 개발 했습니다, 지금은 Adipo 클리어 라는 고해상도 체적 영상12에 적합 최적의 투명도 달성 하기 위해 지방이 많은 직물의 메탄올/dichloromethane 기반 delipidation를 사용 합니다. delipidation 단계 크게 표현 endogenously 냉각 형광 단백질 GFP와 RFP, 때문에 immunolabeling에 의해 이러한 단백질의 시각화를 달성 해야 합니다. 전반적으로,이 간단 하 고 강력한 프로토콜 지방 주민 세포의 조직 수준 조직 연구에 적용할 수 있는 개발 하는 동안 체형 조상 세포, 그리고 지방 morphogenesis의 혈통 추적.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

지방 조직 에너지 항상성 및 체온 조절에 중심 역할을 한다. 그것은 다른 유형의 adipocytes, 뿐 아니라 체형 선구자, 면역 세포, 섬유 아 세포, 혈관 및 신경 예측 구성 됩니다. 셀 형식 지정의 분자 제어 하 고 이러한 세포의 상호 작용 점점 입각, 비록이 지방 주민 세포의 보다 포괄적인 이해 그들의 배포 아키텍처를 시각화 하 여 달성 될 수 있다 통해 전체 조직. 기존 immunohistochemistry 면역 형광 접근 지방 조직학 분석을 얇은 파라핀 포함 된 섹션에 의존 합니다. 그러나, 얇은 섹션 조직;의 작은 부분만 캡처 그 결과, 결론 조직의 어떤 부분을 분석 하 여 편견 수 있습니다. 따라서 전체 adipose 조직에 분자 및 세포 패턴의 포괄적인 3 차원 시각화를 허용 기법, Adipo-명확 하 고, 삭제 하는 지방 조직 개발 했습니다. Adipo 클리어 iDISCO에서 적응 / iDISCO +, 특정 수정에 게 완전히 제거 하는 기본 조직 형태를 유지 하면서 조직에 저장 된 지질. 함께 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 여기는 전체 지방 조직의 고해상도 체적 이미지를 Adipo Clear 메서드를 사용 하 여를 설명 합니다.

Adipo 명확한 준비 전체 지방 패드 조직 형태 및 세포질 상호 작용 고 비만 상태에 영향을 분석 하는 차원에서 몇 군데 있습니다. 이 메서드는 녹색 채널에 조직 autofluorescence 신호를 수집 하 여 일반 지방 구조 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리가 이전 것으로 나타났습니다는 autofluorescence 지방 오버레이 perilipin 얼룩, 성숙한 adipocytes12개요 일반적으로 사용 되는 마커와 호의에 신호. 예를 들어 후부 피하 지방 패드 (psWAT) 낮은 확대 (1.3 X)와 함께 빛 시트 현미경을 사용 하 여 스캔 (그림 1A 및 B) adipocytes의 lobular 조직 보여 줍니다. Adipocytes, 크기 등의 자세한 정보 (그림 1 c 와 D) 높은 확대 (4 배)와 함께 관심의 영역으로 확대 하 여 계시 될 수 있다.
Adipo 클리어 도전 캡처 또는 얇은 섹션에서 추적 하는 혈관, 신경 예측 등 filamentous 구조를 시각화에 대 한 특히 유용 합니다. 교감 신 경계 (SNS) lipolysis 및 지방 조직4,5thermogenesis에서 중요 한 역할을 한다. 티로신 hydroxylase (TH)로 얼룩진 psWAT 패드 이미징, SNS에 대 한 마커 큰 신경 번들, 혈관 신경 분포, 뿐만 아니라 조직 실질 (그림 2A-H)에 밀도 터미널 arborization로 표시 되는 구조를 보여준다. 또한, 일 + parenchymal 예측 (그림 2E-H; dorsolumbar 부분에 상대적으로 높은 밀도 데 사 타 구니 부분 psWAT, 내 지역 편차 표시 보충 영화 1)입니다. SNS 터미널 arborization 연산을 추적 될 수 있다 고 innervation12의 밀도 평가 하기 위해 Imaris 소프트웨어의 FilamentTracer 도구를 사용 하 여 재구성 된 우리의 이전 작품 시연 하고있다.
지방 조직 무 겁 게 나가도록 알려져 있다. 지방의 대사 요구에 변화는 종종 그것의 맥 관 구조6,7의 개장 하는 동적 연결 됩니다. 강력 하 고 빠른 전체 조직 맥 관 구조의 프로 파일링 혈관 개장에 대 한 추가 편견된 분석을 제공할 수 있습니다. 우리 모든 adipocytes 접촉 (그림 3A-H;의 전체 조직에 걸쳐 모세 혈관은 관찰 라벨 혈관을 표식으로 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 (PECAM-1, 일컬어 CD31)를 사용 하 여, 보충 영화 2) 지방에서 교환 효율적인 영양소와 산소에 대 한 높은 수요를 지 원하는.
면역 세포는 지방 조직의 또 다른 중요 한 구성 요소입니다. 비만 상태는 죽은 adipocytes15,16주변 "크라운-같은" 구조를 형성 하는 프로-염증 성 세포의 침투와 함께 지방 조직이 염증이 된다. 비만 동물에서 지방 패드는 특히 그들의 큰 크기 및 높은 지질 내용을 지우기 어렵다. 그러나, Adipo 클리어 (큰 조직 또는 높은 지방 콘텐츠 조직 표 2 에 설명 된)의 확장된 버전 전체 높은 지방 라덴 조직의 일관 된 청소를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 높은 지방 다이어트의 16 주를 품고 마우스에서 epididymal 지방 밀도 "왕관 모양의 구조", (그림 4A 와 B) 전체 조직에 걸쳐 CD68에 의해 immunolabeled를 보여 줍니다. 중요 한 것은, 광학 섹션 전체 깊이 조직의 다양 한 위치에서 점령 (~ 4-5 m m) 보기 동일 하 게 선명한 이미지, 보여주는 조직 (그림 4C-F)의 완전 한 개간.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig1.jpg"> 그림 1: 지방 조직 형태 autofluorescence 신호를 사용 하 여 분석. 모든 패널은 실시간에서 지 내게는 8 주 된 C57Bl/6J 남성 마우스에서 분리 한 Adipo 명확한 준비 psWAT 패드의 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 이미지 Autofluorescence 신호는 녹색 채널 삭제 샘플을 검색 하 여 수집 됩니다. Dorsolumbar 지역 (A) 와 (B) 1.3 X 목표에 의해 사 타 구니 지역의 광학 섹션 (샘플의 중간에서 횡단면)입니다. (C, D) 고배율 (4 배) 박스형된 지역 A 와 B에서 광학 섹션입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig2.jpg"> 그림 2: 3D 지방 조직에 동 정적인 신경 분포의 이미징. 모든 패널은 티로신 hydroxylase (일) ( 그림 1과 같이 동일한 샘플)으로 표시 하는 psWAT의 LSFM 이미지입니다. 복원된 dorsolumbar 지역 (A) 와 사 타 구니 지역 (B) 1.3 X 목표에 의해 최대 예측 (C, D) A 와 B의 중간에서 광학 섹션입니다. (E, F) 고배율 (4 배)에서 C 와 D박스형된 지역의 광학 섹션입니다. (G, H) TH (녹색) 및 autofluorescence (마젠타) 사이의 오버레이의 고배율 광학 섹션입니다. 화살촉 표시 동 정적인 신경 분포의 뚜렷한 패턴: (1) 신경 번들; (2) 혈관 신경 분포; (3) parenchymal arborization입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig3.jpg"> 그림 3: 지방 조직에서 혈관의 영상 3D. 모든 패널은 LSFM psWAT ( 그림 1과 같이 동일한 샘플) 라는 CD31의 이미지입니다. (A, B) 복원된 dorsolumbar 지역 (A) 와 사 타 구니 지역 (B) 1.3 X 목표에 의해 최대 예측 (C, D) A 와 B의 중간에서 광학 섹션입니다. (E, F) 고배율 (4 배)에서 C 와 D박스형된 지역의 광학 섹션입니다. (G, H) CD31 (빨간색)와 autofluorescence (사이안) 사이의 오버레이의 고배율 광학 섹션입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig4.jpg"> 그림 4: "왕관 모양의 구조" 지방 조직에서의 3D 영상. 모든 패널은 16 주 동안 높은 지방 다이어트를 먹이 하는 남성 마우스에서 분리 한 Adipo 명확한 준비 eWAT 패드의 LSFM 이미지입니다. 샘플은 CD31와 CD68 immunolabeled 했다. (A, B) 4. (A) X-Y 보기 보다는 더 많은 것의 총 깊이 가진 복원된 샘플의 최대 예측 (B) Y-Z 보기. (C-F) B에 표시 된 깊이에서 광학 섹션. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>버퍼</td>
			<td>화학</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1n 버퍼</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>글리신</td>
			<td>0.3 M</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>트라이 톤 X-100</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>H2O</td>
			<td>용 매</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>나트륨 아 지 드 (방부, 옵션)</td>
			<td>0.01% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>7 NaOH로 pH를 조정</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PTxwH 버퍼</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>10 x PBS</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>트라이 톤 X-100</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>트윈 20</td>
			<td>0.05% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>헤 파 린</td>
			<td>2 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>H2O</td>
			<td>용 매</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>나트륨 아 지 드 (방부, 옵션)</td>
			<td>0.01% (w/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 버퍼 솔루션의 목록. 이 표에서 Adipo 클리어에 사용 되는 버퍼에 대 한 요리법 합니다. 버퍼의 장기 저장을 위한 방부 제로 나트륨 아 지 드를 추가 하는 것이 좋습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>버퍼</td>
			<td>작은 조직</td>
			<td>큰 조직 (또는 고 지방 내용)</td>
			<td>온도</td>
		</tr>
<tr>
<td>20% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>60% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>80% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% 메탄올</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2-3 h, 또는 하룻밤</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM</td>
			<td>30 분</td>
			<td>2 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% 메탄올</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% 메탄올</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>선택 사항: 5% H2O2/methanol</td>
			<td>하룻밤</td>
			<td>하룻밤</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>80% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>60% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>20% 메탄올/B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1n 버퍼</td>
			<td>30 분</td>
			<td>1 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1n 버퍼</td>
			<td>하룻밤</td>
			<td>하룻밤</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTxwH 버퍼</td>
			<td>2 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTxwH 버퍼</td>
			<td>스토리지</td>
			<td>스토리지</td>
			<td>4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 차적인 항 체 외피</td>
			<td>3 일</td>
			<td>4-5 일</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>이차 항 체 외피</td>
			<td>3 일</td>
			<td>4-5 일</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 보육 시간 delipidation 및 immunostaining. 이 테이블에 대 한 프로토콜의 delipidation 및 immunostaining 단계 보육 시간을 포함 되어 있습니다. 작은 조직의 대략적인 무게 < 300 밀리 그램입니다.
보충 영화 1: 지방 조직에 동 정적인 신경 분포의 이미징 3D. (같은 그림 2)는 psWAT 샘플의 티로신 hydroxylase (일) immunostaining. 영화 플라이 쓰루 광학 섹션 (4 X는 dorsolumbar에서)와 psWAT의 사 타 구니 지역 보여줍니다 ~ 2 m m.의 총 깊이 일에에서 표시 됩니다 녹색. Autofluorescence는 자홍색으로 표시 됩니다. Dorsolumbar 부분에서 지역 SNS 저밀도 나타납니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/JoVE_movie_1_R1.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 2: 3D 이미징의 지방 조직에서 맥 관 구조. CD31 (같은 그림 3) psWAT 샘플의 immunostaining. 영화 플라이 쓰루 광학 섹션 (4 X는 dorsolumbar에서)와 psWAT의 사 타 구니 지역 보여줍니다 ~ 2 m m.의 총 깊이 CD31 표시 됩니다 빨간색. Autofluorescence는 청록색에 표시 됩니다. 모든 adipocytes 밀접 하 게 모세 혈관으로 둘러싸여 나타납니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/JoVE_movie_2_R1.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K 조회수.  The Rockefeller University. 높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

비디오: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.