Wir bedanken uns bei Christina Pyrgaki, Tao Tong und Alison North aus Bioimaging Resource Center an der Rockefeller University für Hilfe und Unterstützung. Wir danken auch Xiphias Ge Zhu zum Film bearbeiten. Diese Arbeit wurde von Human Frontier Science Programm Organisation (PC) unterstützt.

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren genehmigt durch die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss an der Rockefeller University durchgeführt.
(1) Gewebe-Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie standard intrakardialen Perfusion mit ~ 20 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C, bis das Blut aus dem Gewebe vollständig entfernt wird.</li>
	<li>Wechseln Sie die Perfusat zu ~ 20 mL Fixativ Lösung (4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer) bei 4 ° C, bis der Hals und Schweif deutlich versteift haben. Achtung: PFA ist giftig. Berührung mit Haut, Augen und Schleimhäute. Lösungen sollten in einem Abzug erfolgen.</li>
	<li>Sezieren Sie die Fettpolster von Interesse sorgfältig, um die gesamte Fettpolster zu entfernen, ohne es zu beschädigen. Verwenden Sie stumpf endete Zangen um Kneifen oder Quetschen des Gewebes zu vermeiden. Vermeidung einer Kontamination der sezierten Gewebes mit jedem Fell.</li>
	<li>Nach dem Beheben des Gewebes bei 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° c Für jedes Fettpolster Post-mit ~ 10 mL Fixierung-Lösung in einem 15 mL konische Rohr befestigen.</li>
	<li>Waschen Sie das Gewebe 3 mal (1 h) mit 1 X PBS bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Speichern Sie das Gewebe für kurzfristige (bis zu 2 Wochen) mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C und vor Licht geschützt werden. Für langfristige Lagerung (z.B.1-2 Jahre) wechseln Sie den Puffer zu 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid (als Konservierungsmittel). Achtung: Natriumazid ist hochgiftig, wenn oral oder über die Haut aufgenommen. Konzentriert Natriumazid Lösungen (bei 5 % oder mehr) unter einer Abzugshaube behandelt werden sollte.</li>
</ol>2. Delipidierung und Permeabilisierung
Timing: 1-2 Tage
<ol><li>Bereiten Sie 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol Steigung mit B1n Puffer (Tabelle 1), (V/V), z. B.für 20 % Methanol/B1n Puffer, mischen Sie 20 mL Methanol und 80 mL B1n Puffer. Speichern Sie alle Puffer bei 4 ° C. Von 60 % und 80 % Methanol/B1n Puffer aufgrund der Sättigung werden Glycin Kristalle ausgefällt. Zu vermeiden, entfernen die Kristalle; Verwenden Sie die flüssige Lösung für folgenden Waschungen. Achtung: Methanol ist flüchtig, reizend und brennbar. Vermeiden Sie Haut- oder Augenkontakt.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Haare aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion. Haare, Flusen oder Fremdkörper befestigt zum Beispiel verursacht Schatten während der Bildgebung. Übertragen Sie die gereinigte Probe in einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Führen Sie alle folgenden Schritte auf dem Eis oder bei 4 ° C, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie für kleine Proben (z.B. posterior subkutanen/Perigonadal Fettpolster von jungen schlanken Mäusen) 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben oder Proben mit hohem Fettgehalt (z.B., Fettpolster von fettleibigen Mäusen) 5 mL Röhrchen mit 4 mL der Lösung.<ol>
<li>Legen Sie die Rohre mit den Proben horizontal auf einem Orbitalschüttler festgesetzt ~ 100 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Inneren der Röhre frei bewegen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entwässern Sie die Probe in einer abgestuften Reihe von 20 %, 40 %, 60 %, 80 % und 100 % Methanol/B1n-Puffer für die angegebene Zeit (Tabelle 2). Minimieren Sie die Carry-over-Lösung.</li>
	<li>Delipidate der Probe mit 100 % Dichlormethan (DCM) (3 mal), jeweils mit der Inkubationszeit in Tabelle 2angegeben. Die Probe sollte auf den Boden des Röhrchens am Ende des zweiten und dritten DCM Waschungen sinken. Wenn nicht, erweitern die Inkubationszeit zu vollen delipidierung zu gewährleisten (z.B.reichen von 30 min bis 1-2 h). Achtung: DCM sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Röhren, die aus Polypropylen für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DCM verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DCM. DCM ist sehr volatil. Übertragen Sie die Probe in frische Lösung schnell um Austrocknung zu verhindern.</li>
	<li>Waschen Sie sich zweimal mit 100 % Methanol für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Optional: Wenn die Probe nicht gut PERFUNDIERTEN ist, kann die Farbe des Hämoglobins aus den verbleibenden Erythrozyten stark Autofluoreszenz führen. Bleichen Sie mit 5 % H2O2 in Methanol (1 Volumen von 30 % H2O2 bis 5 Bände von Methanol) über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Die Probe in einer umgekehrten Methanol/B1n Puffer Serie rehydrieren: 80 %, 60 %, 40 %, 20 % Methanol/B1n und 100 % B1n Puffer (2 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer (Tabelle 1) für 2 h bei RT</li>
	<li>Die Delipidated Probe in PTxwH Puffer bei 4° C (bis zu 1 Jahr) speichern oder sofort mit dem Immunostaining Schritt fortfahren.</li>
</ol>(3) ganze Mount Immunostaining
Timing: 8-10 Tage
Hinweis: Die folgenden Schritte sollten bei RT erfolgen soweit, mit schütteln und vor Licht geschützt. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung. Es empfiehlt sich, zuerst die Antikörper auf kleine Stücke des Gewebes oder Methanol behandelten Gewebeschnitte validieren.
<ol><li>Den primäre Antikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Delipidated Probe mit dem primären Antikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.</li>
	<li>Der Sekundärantikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern. Hinweis: Zur Vermeidung von hohen Hintergrund verursacht durch Gewebe Autofluoreszenz sind mit Fluorophore, die Licht in den Regionen rote und dunkelrote emittieren konjugierten Sekundärantikörper empfohlen. Abhängig von der Anzahl der Laserlinien auf ein Mikroskop zur Verfügung kann bis zu 3-4 Marker in einer Probe gleichzeitig dargestellt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe mit der Sekundärantikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Waschen Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.</li>
	<li>Optional: Für Gewebetypen, die zerbrechlich sind, beheben Sie die gefärbte Gewebe mit 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C zur Erhaltung der Gewebe Morphologie. Hinweis: Dieser Schritt kann Bildgebung Hintergrund erhöhen. Es ist nicht notwendig, führen Sie diesen Schritt für Fettgewebe.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe mit 1 X PBS in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min und 30 min.</li>
	<li>Fusseln entfernen Sie vorsichtig aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion.</li>
</ol>(4) Gewebe Clearing
Timing: 1-2 Tage
<ol><li>Optional: Einbetten der Probenmaterials in Agarose Probe Halterung für Licht-Blatt Mikroskopie zu erleichtern. Hinweis: Dieser Schritt ist dringend empfohlen für Fettgewebe, seine Form während der Aufnahme zu stabilisieren.<ol>
<li>Bereiten Sie die einbettende Lösung mit 1 % Agarose in 1 X PBS (w/V). Cool die einbettende Lösung für ~ 40 ° C zu vermeiden, dass die Probe übermäßiger Hitze.</li>
		<li>Legen Sie die gereinigte Probe in eine Form (z.B., Petrischale oder mit einem Gewicht von Boot) und ordnen sie in die gewünschte Position. Vermeiden Sie jede flüssige Übertragung. Die Einbettung Gemisch sanft über die Probe. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Lassen Sie die Agarose voll an RT. Schnitt aus einem Block mit der Probe zu festigen. Hinweis: Die folgenden Schritte einschließlich Übernachtung Inkubationen sollte bei RT, mit schütteln und vor Licht geschützt erfolgen. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entwässern Sie die Probe in Methanol Farbverlauf mit H2o: 25 %, 50 %, 75 % und 100 % (3 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2). Hinweis: Probe kann über Nacht bei 100 % Methanol Schritt gelassen werden.</li>
	<li>Inkubation der Probe in 100 % DCM 1 h unter Schütteln (3 mal). Probe sollte auf der Unterseite des Rohres am Ende von jedem DCM waschen sinken. Wenn dies nicht der Fall ist, erweitern die Inkubationszeit zur vollständigen Entfernung von Methanol zu gewährleisten. Probe kann über Nacht bei 100 % DCM Schritt gelassen werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in Dibenzyl Äther (DBE) über Nacht mit leichten schütteln um Brechungsindex passend zu erreichen. Hinweis: Probe wird schließlich im sichtbaren Licht transparent. Achtung: DBE ist gefährlich. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Im Inneren einer Abzugshaube mit doppellagige Handschuhe damit umgehen. Verwerfen Sie die Handschuhe, sobald es mit DBE verunreinigt ist. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Rohre (Polypropylen) für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DBE verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DBE. Reinigen Sie alle Spill mit 100 % Ethanol.</li>
	<li>Inkubation der Probe mit frischen DBE mit leichtem Schütteln für 2 h. Store die Probe bei RT im Dunkeln oder gehen Sie direkt zu Bildgebung. Hinweis: Proben sollten innerhalb eines Monats abgebildet werden. Obwohl bestimmte Fluorophore stabiler als andere sind, ist langfristige Lagerung der Proben in diesem Stadium nicht empfohlen.</li>
</ol>(5) Mikroskopie
<ol><li>Bildgebung mit einem Licht-Blatt-Mikroskop, das mit DBE kompatibel ist. Hinweis: Nur Ziele, die für organische Lösungsmittel Bildgebung zugelassen und abgestimmt mit dem Brechungsindex von DBE können verwendet werden, als Ziele in der DBE eingetaucht Bildgebung eintauchen.<ol>
<li>Montieren Sie die Agarose eingebettet Probe auf eine Halterung, die Bewegung während der Bildgebung verhindern kann. Tauchen Sie die Probe in einer DBE-gefüllte Kammer.</li>
		<li>Sammeln Sie einen Z-Stack für die gesamte Probe (z.B. 1-2 X Vergrößerung), ganze-Verteilung/Gewebestruktur des Markers von Interesse zu erhalten.</li>
		<li>Wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (z.B. 4-12 X Vergrößerung) der Regionen von Interesse für feine Strukturen Bild vergrößern. Hinweis: Kollagen ist ein wesentlicher Faktor für die extrazelluläre Matrix des Fettgewebes, die alle Fettzellen13umgibt. Kollagen ist ein typisches Emissionsspektrum reichen rund 400 nm bis 550 nm14. Bildgebung der Probe mit 488 Laserlinie (grün) und sammeln das emittierte Licht in einem Wellenlängenbereich, der in das Emissionsspektrum von Kollagen (z.B. 525-550 nm) liegt liefern das Gewebe Autofluoreszenz Signal, die bisher gezeigt wurde Fettzelle Kontur und allgemeine Gewebe Architektur12abzugrenzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildgebung mit einer invertierten konfokale oder ein zwei-Photonen-Mikroskop.<ol>
<li>Legen Sie die Probe Agarose eingebettet in eine Kammer-Folie mit einem Glasboden, ohne alle Kunststoffteile (oder andere DBE-kompatible bildgebende Kammer, die versiegeln kann). Stellen Sie sicher, DBE nicht austreten.</li>
		<li>Wählen Sie die Ziele mit längeren Arbeitsabstand, tieferes Eindringen zu erreichen. Hinweis: Bildgebung sollte mit einem inversen konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskop durch den Glasboden der Kammer Folie erfolgen. Vermeiden Sie direkten Kontakt zwischen der Probe und Dippen Ziele, die nicht für die DBE-basierte Bildgebung vorgeschlagen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis.">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li><li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure.">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation.">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity.">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets.">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adipo-Clear ist eine einfache und robuste Methode für das clearing von Fettgewebe, die leicht in eine reguläre Laboraufbau durchgeführt werden kann. Im Vergleich zu anderen lösemittelhaltigen Clearing-Methoden wie iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear ist besonders optimiert für das clearing von Fettgewebe und andere Gewebe mit hohem Fettgehalt. Der delipidierung Schritt vollständig entfernt Lipide aus Fettgewebe, und daher erleichtert Immunolabeling durch das ganze Gewebe und weitgehend minimiert Streulicht, End-to-End-Bildgebung ohne Verlust der XY-Auflösung ermöglicht. Neben Licht-Blatt Fluoreszenz Mikroskope, die bieten schnelle Scannen von großen Gewebe, konfokale und zwei-Photonen-Mikroskope auch einsetzbar, höhere Auflösung und mehr Details zu erhalten.
Methanol/DCM-basierten delipidierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende delipidierung kann zu unscharfen Bildern, vor allem gegen den Kern des Gewebes führen. Es ist wichtig, die vollständige Entfernung von Lipiden zu gewährleisten, durch die Beobachtung von adipöser Proben im DCM versinken. Die Proben, die eine Mischung aus Gewebetypen (z.B. epididymal Fett mit Nebenhoden und Hoden befestigt) enthalten können nicht vollständig selbst mit erweiterten DCM Inkubationen sinken. Jedoch sollten Bebrüten diese Proben über Nacht in DCM komplette delipidierung erreichen. Aufgrund der Denaturierung von Proteinen in diesen organischen Lösungsmitteln möglicherweise bestimmte Antikörper nicht kompatibel mit der delipidierung Schritt. Daher wird die Auswahl eines geeigneten Antikörpers ein weiterer wichtiger Schritt für dieses Protokoll. Es empfiehlt sich, zuerst die Antikörper auf Methanol behandelten Gewebeschnitte oder kleine Stücke des Gewebes durch Adipo-Clear verarbeitet zu validieren. Ebenso sollte die Kompatibilität von chemischen Farbstoffen mit Methanol/DCM/DBE auch vor der Anwendung getestet werden.
Eine Einschränkung des Protokolls ist das abschrecken der endogen ausgedrückten fluoreszierende Proteine. Die organischen Lösungsmittel basierenden delipidierung und Clearing Schritte denaturieren weitgehend solcher Proteine. Um endogene fluoreszierende Proteine zu visualisieren, braucht Antikörper Kennzeichnung eingesetzt werden. Die Verfügbarkeit von geeigneten Antikörper Kombinationen schränkt die Fähigkeit, führen hoch gemultiplext imaging. Die aktuelle verfügbare Licht-Blatt Mikroskope erlauben uns nur Bild bis zu 4 Kanäle.
Adipo-Clear eignet sich besonders zur Visualisierung von faserigen Strukturen und Zell-Populationen, die relativ geringen Dichte im Fettgewebe haben. Imaging-dichten Signale wird jedoch mit diesem Ansatz beschränkt. Wenn Antikörper verwendet werden, um dichten Signale zu beschriften, können sie durch die Epitope befindet sich auf der Oberfläche der Probe, blockiert den Zugriff auf das innere Gewebe abgesondert werden. Daher sind kleine chemische Sonden empfohlen, Dichte Strukturen zu beflecken. Aufgrund der gleichen Ausgabe beschränkt sich die Anwendung der Adipo-Clear auf braunen Fettgewebe. Braune Fett ist ein adipöser Depot mit dichten Strukturen. Neben dichten Blutgefäße und Nerven Innervation ist es auch mit kleinen Fettzellen dicht, die eine große Anzahl von Mitochondrien17enthalten. Bei der Anwendung CD31 und TH war Färbung mit dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben, braune Fett, nur die Oberfläche der Probe (Daten nicht gezeigt) bezeichnet. Darüber hinaus produziert braune Fett starken Gewebe Autofluoreszenz, führt zu niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis während der Bildgebung. Es wird empfohlen, braune Fett in kleinere Stücke schneiden und chemische Sonden wenn möglich verwenden.
Insgesamt Adipo-Clear ermöglicht gleichzeitige profiling von mehreren Strukturen mit hoher Auflösung im gesamten Fettgewebe. Mit diesem Ansatz kann man analysieren, wie Strukturen wie Nerven Projektionen, Gefäßsystem, Immunzellen und Adipozyten während der gesamten fettlappen interagieren. Freuen Sie sich auf unvoreingenommene Bilddaten durch Schneiden oder Auswahl der Regionen von Interesse zu vermeiden. Adipo-Clear kann auch angewendet werden, um adipöse Entwicklung z. B. Ereignisse während der frühen Morphogenese sowie die Verteilung der Adipocyte Vorläuferzellen und Vorläufer Zellen in Linie Ablaufverfolgung Studien zu studieren. Neben Fettgewebe kann Adipo-Clear auch 3D vollständig-hängen Analyse anderer Gewebe erleichtern, die hohen Fettgehalt oder sind umgeben von Fett, wie Brustdrüse und fetthaltige Lymphknoten. Diese Methode bietet auch die Möglichkeit, die Histologie der menschlichen Fettgewebe unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu studieren.

Bis vor kurzem war Fettgewebe als eine amorphe Sammlung von Fettzellen konzipiert. In den vergangenen Jahrzehnten hat unser Verständnis mit Fett jetzt erkannt, um ein komplexes Organ, enthält verschiedene Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, das Gefäßsystem und Nerv Projektionen werden anspruchsvoller, gewachsen. Interaktionen zwischen diesen Fettgewebe-Resident-Zellen haben Auswirkungen auf Fettgewebe und organismal Physiologie und Pathophysiologie1ausgesprochen. Obwohl neue Studien wichtigere molekularen Mechanismen, die bestimmte Interaktionen entwirrt haben, erfordert ein umfassenderes Verständnis zuverlässige strukturelle Profilierung des gesamten Gewebes in drei Dimensionen (3D).
Unseren derzeitigen Kenntnissen von Fettgewebe Morphologie basiert größtenteils auf histologische Analyse von Dünnschliffen (5 μm) mit relativ hoher Vergrößerung Bildgebung (mehr als 10 X)2,3. Dieser Ansatz hat jedoch einige erhebliche Einschränkungen. Erste, komplizierte faserigen Strukturen wie sympathischen Nerven und das Gefäßsystem, die bekanntermaßen die adipösen Funktion4,5,6,7eine wichtige Rolle spielen, sind schwer zu bewerten durch dünne Abschnitte. Zweitens aufgrund seiner scheinbar amorphe Form und das Fehlen von repräsentativen strukturelle Einheiten zu konzentrieren, ist es schwierig, Fettgewebe Strukturen basierend nur auf Abschnitt Färbung zu schätzen wissen. Drittens, Fettgewebe hat einen sehr hohen Fettgehalt, schaffen Herausforderungen bei der Beschaffung konsequent Serienschnitte, die geeignet sind für 3D anatomische Rekonstruktion, einer konventionellen Methode verwendet, um ganze Gehirn Morphologie8zu studieren. Angesichts dieser Faktoren gibt es ein großer Bedarf für einen ganzen-Mount-Ansatz, der 3D-Visualisierung eines gesamten Fettgewebe-Depots und noch eine zelluläre Auflösung bieten kann.
Volumetrische 3D-Bildgebung eines ganzen Organs ist schwierig wegen der verhüllenden Auswirkungen der Lichtstreuung. Eine wichtige Quelle der Lichtstreuung in biologischen Geweben kommt von Lipid-wässrige Schnittstellen. Obwohl die Bemühungen um die Streuung zu beseitigen, indem Sie Lipide entfernen laufende für über ein Jahrhundert gewesen, gab es eine große Anzahl von jüngsten Innovationen9. Eine solche neu entwickelte Gewebe-Clearing-Methode ist Immunolabeling-fähigen 3D-Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO / iDISCO +)10,11. Fettgewebe stellt jedoch eine besondere Herausforderung dar, die aufgrund ihrer hohen Lipide, und daher zusätzliche Änderungen an der iDISCO / iDISCO + Protokoll sind erforderlich, um vollständig die Lipide extrahieren und schützt das Gewebe vor dem Kollaps. Das geänderte Protokoll, die, das wir entwickelt haben, jetzt genannt Adipo-Clear, beschäftigt Methanol/Dichlormethan-basierte delipidierung von Fettgewebe, geeignet für hochauflösende Volumetrische Bildverarbeitung12optimalen Transparenz zu erreichen. Da die delipidierung Schritt weitgehend Quenchen endogen ausgedrückt fluoreszierende Proteine wie GFP und RFP, muss Visualisierung solcher Proteine durch Immunolabeling erzielt werden. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um Gewebe-Organisation von Fettgewebe ansässige Zellen untersuchen Abstammung Rückverfolgung Adipocyte Vorläuferzellen und adipösen Morphogenese während der Entwicklung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Fettgewebe spielt eine zentrale Rolle im Energie-Homöostase und Thermoregulation. Es besteht aus verschiedenen Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, Blutgefäße und Nerven Projektionen. Obwohl die molekularen Steuerung der Zelle Typspezifikation und wie diese Zellen interagieren zunehmend abgegrenzt, ein umfassenderes Verständnis dieser Fettgewebe-Resident-Zellen lässt sich durch die Visualisierung ihrer Verteilung und Architektur durch das ganze Gewebe. Bestehenden Immunohistochemistry und Immunfluoreszenz Ansätze für adipöse Histologie analysieren setzen auf Paraffin-eingebetteten Dünnschliffe. Dünnschliffe erfassen jedoch nur einen kleinen Teil des Gewebes; Infolgedessen können die Schlussfolgerungen voreingenommen sein, durch welchen Teil des Gewebes analysiert wird. Daher haben wir ein Fettgewebe, clearing-Technik, Adipo-Clear, um umfassende dreidimensionale Visualisierung der molekularen und zellulären Muster in ganze Fettgewebe zu ermöglichen. Adipo-Clear wurde von iDISCO / iDISCO +, mit spezifischen Änderungen gemacht, um vollständig zu entfernen die Lipid unter Beibehaltung der nativen Gewebe Morphologie im Gewebe gespeichert. In Kombination mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie zeigen wir hier die Verwendung von der Adipo-Clear-Methode, um hochauflösende volumetrischen Bilder von einer gesamten Fettgewebe zu erhalten.

Adipo-Clear bereit ganze Fett Pads abgebildet werden können, in 3D zu analysieren, wie Gewebe Morphologie und zellulären Interaktionen in den mageren und fettleibigen Staaten betroffen sind. Diese Methode kann leicht angewendet werden, um allgemeine adipösen Struktur zu analysieren, durch das Sammeln von Gewebe Autofluoreszenz Signal in den grünen Kanal. Wir haben bereits gezeigt, dass die Autofluoreszenz Signal in adipösen Überlagerungen günstig mit Perilipin Färbung, eine häufig verwendete Markierung Reifen Adipozyten12zu skizzieren. Scannen einer posterioren subkutane Fettpolster (PsWAT) mit einem Licht-Blatt-Mikroskop mit geringer Vergrößerung (1.3 X) zeigt beispielsweise die lobuläre Organisation der Adipozyten (Abb. 1A und B). Weitere detaillierte Informationen, wie die Größe der Fettzellen, kann durch Zoomen in die Regionen von Interesse mit stärkerer Vergrößerung (4 X) (Abbildung 1 und D) aufgedeckt werden.
Adipo-Clear eignet sich besonders zur Visualisierung von faserigen Strukturen wie Nerven Projektionen und Blutgefäße, die schwierig zu erfassen oder auf Dünnschliffen Spur sind. Das sympathische Nervensystem (SNS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Lipolyse und Thermogenese im Fettgewebe4,5. Imaging eine PsWAT Pad gebeizt mit Tyrosin-Hydroxylase (TH), zeigt ein Marker für SNS, die Strukturen, die als große Nervenbündel sowie Blutgefäß Innervation und dichten terminal Arborization in das Gewebe Parenchym (Abbildung 2A-H) angezeigt. Darüber hinaus zeigen die TH + parenchymatösen Projektionen regionale Variation innerhalb PsWAT, mit der inguinalen Teil mit höherer Dichte im Verhältnis zu der Dorsolumbar Teil (Abbildung 2E-H; Ergänzende Film 1). Unsere bisherige Arbeit hat gezeigt, dass SNS terminal Arborization rechnerisch zurückverfolgt werden und mit dem FilamentTracer-Tool Imaris Software um zu beurteilen, die Dichte der Innervation12rekonstruiert.
Fettgewebe ist bekanntermaßen stark durchblutet werden. Die Veränderungen in metabolischen Anforderungen von Fettgewebe sind oft verbunden mit der dynamischen Umgestaltung von seinem Gefäßsystem6,7. Robuste und schnelle Profilierung des gesamten Gewebes Gefäßsystem bieten zusätzliche objektive Analyse für die Umgestaltung der Blutgefäße. Verwendung von Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül (PECAM-1, auch bekannt als CD31) als Marker für Label Blutgefäße, beobachteten wir, dass alle Fettzellen in Kontakt mit den Kapillaren durch das ganze Gewebe (Abbildung 3A-H sind; Ergänzende Movie 2), unterstützt die hohe Nachfrage nach effizienten Nährstoff und Sauerstoff im Fettgewebe auszutauschen.
Immunzellen sind eine weitere wichtige Komponente des Fettgewebes. Im adipösen Zustand wird Fettgewebe entzündet, die durch das Eindringen von Pro-inflammatorischen Makrophagen begleitet wird, die "Krone" Strukturen rund um tote Adipozyten15,16bilden. Fettpolster von adipösen Tieren sind besonders schwierig, aufgrund ihrer Größe und höheren Lipidgehalt klar. Allerdings kann die erweiterte Version des Adipo-Clear (siehe Tabelle 2 für große Gewebe oder Gewebe mit hohem Fettgehalt) konsistent Räumung der ganz hohen Fett-beladenen Gewebe erreichen. Beispielsweise zeigt epididymal Fett von einer Maus mit 16 Wochen der fettreichen Diät gefüttert Dichte "Krone-ähnliche Strukturen", Immunolabeled durch CD68, durch das ganze Gewebe (Abb. 4A und B). Wichtig ist, optische Teile aus verschiedenen Positionen über die gesamte Tiefe des Gewebes genommen (~ 4-5 mm) zeigen ebenfalls gestochen scharfe Bilder, zeigen komplette Lichtung des Gewebes (Abbildung 4-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig1.jpg"> Abbildung 1: Analyse der Fettgewebe Morphologie der Autofluoreszenz-Signal verwendet. Alle Platten sind leichte Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Bilder von ein Adipo-Clear bereit PsWAT Pad isoliert von einem 8 Wochen alten C57Bl/6J männlichen Maus untergebracht bei RT Die Autofluoreszenz-Signal wird durch das Scannen der geräumten Probe mit den grün-Kanal gesammelt. Optische Teile (Querschnitte aus der Mitte der Probe) der Dorsolumbar Region (A) und der inguinalen Region (B) von 1,3 X Objektiv genommen. (C, D) Hoch-Vergrößerung (4 X) optischen Abschnitte der geschachtelten Regionen von A und B. Lymphknoten sind durch Sternchen angezeigt. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig2.jpg"> Abbildung 2: 3D imaging der sympathische Innervation im Fettgewebe. Alle Platten sind LSFM Bilder von einem PsWAT beschriftet mit Tyrosin-Hydroxylase (TH) (das gleiche Beispiel wie in Abbildung 1). Maximale Projektionen der rekonstruierten Dorsolumbar Region (A) und inguinalen Region (B) von 1,3 X Ziel getroffen. (C, D) Optische Teile aus der Mitte der A und B. (E, F) Hoch-Vergrößerung (4 X) optischen Abschnitte der geschachtelten Regionen von C und D. (G, H) Hohe Vergrößerung optischer Abschnitte der Überlagerung zwischen TH (grün) und Autofluoreszenz (Magenta). Pfeilspitzen zeigen unterschiedliche Muster der sympathische Innervation: (1) Nervenbündel; (2) Blutgefäß Innervation; (3) Parenchym Arborization. Lymphknoten sind durch Sternchen angezeigt. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig3.jpg"> Abbildung 3: 3D imaging der Blutgefäße im Fettgewebe. Alle Platten sind LSFM Bilder von einem CD31 mit der Bezeichnung PsWAT (das gleiche Beispiel wie in Abbildung 1). (A, B) Maximale Projektionen der rekonstruierten Dorsolumbar Region (A) und inguinalen Region (B) von 1,3 X Ziel getroffen. (C, D) Optische Teile aus der Mitte der A und B. (E, F) Hoch-Vergrößerung (4 X) optischen Abschnitte der geschachtelten Regionen von C und D. (G, H) Hohe Vergrößerung optischer Abschnitte der Überlagerung zwischen CD31 (rot) und Autofluoreszenz (Cyan). Lymphknoten sind durch Sternchen angezeigt. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58271/58271fig4.jpg"> Abbildung 4: 3D-Bildgebung der "Krone-ähnliche Strukturen" im Fettgewebe. Alle Platten sind LSFM Bilder von einer Adipo-Clear bereit eWAT Pad isoliert von einer männlichen Maus mit fettreichen Diät für 16 Wochen gefüttert. Die Probe war Immunolabeled mit CD31 und CD68. (A, B) Maximale Projektionen der rekonstruierten Probe mit einer Gesamttiefe von mehr als 4 mm. (A) -X-Y-Ansicht. (B) Y-Z-Ansicht. (C-F) Optische Teile aus der angegebenen Tiefe in B. Maßstabsleisten sind in jedem Panel angegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/58271fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Puffer</td>
			<td>Chemische</td>
			<td>Endkonzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1N Puffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Glycin</td>
			<td>0,3 M</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>0,1 % (V/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>H2O</td>
			<td>Lösungsmittel</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Natriumazid (Konservierungsmittel, optional)</td>
			<td>0,01 % (w/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Justieren Sie pH bis 7 mit NaOH</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PTxwH Puffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>0,1 % (V/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Tween 20</td>
			<td>0,05 % (V/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Heparin</td>
			<td>2 µg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>H2O</td>
			<td>Lösungsmittel</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Natriumazid (Konservierungsmittel, optional)</td>
			<td>0,01 % (w/V)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der Puffer und Lösungen. Diese Tabelle enthält Rezepte für die Puffer in Adipo-Clear verwendet. Für die langfristige Speicherung der Puffer empfiehlt es sich, als Konservierungsmittel Natriumazid hinzufügen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Puffer</td>
			<td>Kleine Gewebe</td>
			<td>Großen Gewebe (oder mit hohem Fettgehalt)</td>
			<td>Temperatur</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>40 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>80 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 % methanol</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM</td>
			<td>7.</td>
			<td>2-3 Stunden oder über Nacht</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM</td>
			<td>30 min</td>
			<td>2 h</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 % methanol</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 % methanol</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Optional: 5 % H2O2/methanol</td>
			<td>Über Nacht</td>
			<td>Über Nacht</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>80 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>40 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 % Methanol/B1n Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1N Puffer</td>
			<td>30 min</td>
			<td>7.</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1N Puffer</td>
			<td>Über Nacht</td>
			<td>Über Nacht</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTxwH Puffer</td>
			<td>2 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTxwH Puffer</td>
			<td>Lagerung</td>
			<td>Lagerung</td>
			<td>4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primärantikörper Inkubation</td>
			<td>3 Tage</td>
			<td>4-5 Tage</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sekundärantikörper Inkubation</td>
			<td>3 Tage</td>
			<td>4-5 Tage</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Inkubation Zeiten für delipidierung und Immunostaining. Diese Tabelle enthält die Inkubationszeiten für die delipidierung und Immunostaining Schritte des Protokolls. Das ungefähre Gewicht der kleinen Gewebe ist < 300 mg.
Ergänzende Film 1: 3D imaging der sympathische Innervation im Fettgewebe. Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Immunostaining eine PsWAT Probe (gleich wie in Abbildung 2). Der Film zeigt den Durchflug der optischen Abschnitte (4 X aus der Dorsolumbar) und inguinalen Regionen des PsWAT, wird mit einer Gesamttiefe von ~ 2 mm. TH in grün dargestellt. Autofluoreszenz ist in Magenta dargestellt. Die Region von den Dorsolumbar Teil scheint geringeren SNS Dichte haben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/JoVE_movie_1_R1.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Movie 2: 3D Bildgebung des Gefäßsystems im Fettgewebe. CD31 Immunostaining eine PsWAT Probe (gleich wie in Abbildung 3). Der Film zeigt den Durchflug der optischen Abschnitte (4 X aus der Dorsolumbar) und inguinalen Regionen des PsWAT, wird mit einer Gesamttiefe von ~ 2 mm. CD31 in rot angezeigt. Autofluoreszenz wird in Cyan angezeigt. Alle Fettzellen scheinen eng von Kapillaren umgeben zu sein. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58271/JoVE_movie_2_R1.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K Aufrufe.  The Rockefeller University. Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Serie: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.