This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

동물 실험은 모든 관련 정부 및 기관의 규정을 준수해야합니다. 시약 1. 준비 <ol><li> 하이드로 겔 모노머 용액 (A4P0)의 경우 : 0.1X 인산 완충 식염수 450 ㎖ (PBS)에 아크릴 아미드의 20g을 추가하고 0.1X PBS로 500 ㎖로 볼륨을 조절합니다. 주의 : 아크릴 아미드 단량체는 독성이. 얼굴 방패, 실험실 코트, 장갑, 및 폐쇄 발가락 신발을 포함, 개인 보호 장비와 흄 후드에서 모든 절차를 수행합니다. <ol><li> 사용 흄 후드 하에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 2,2&#39;- 아조 비스 [2- (2- 이미 다 졸린 -2- 일) 프로판] 하이드로 겔의 모노머 용액 40 ㎖ (A4P0)에 염산염 100mg을 추가 직전 . </li></ol></li><li> 영동 조직 지우기 (ETC) 버퍼 : 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 및 탈 H 2 O (DH 2 O)을 800 mL의 붕산의 12.37 g, 40 g을 추가한다. NaOH로 8.5로 pH를 조정하고로 볼륨을 조절추가 DH 2 O 1 L 주의 : SDS은 유해 화학 물질이고; 따라서,주의해서 처리합니다. </li><li> 입방 마운트 솔루션 : 크로즈 250g, 우레아 125 g을 N, N, N의 125g DH 2 O의 150 ㎖의 &#39;, N&#39;- 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민을 추가 부피를 가지고 DH 2 O와 500 ㎖에 </li></ol> 2. 샘플 준비 및 고정 <ol><li> 마우스의 안락사. <ol><li> 같은 주사기에서 alfaxalone (1 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (0.5 ㎎ / ㎏)을 준비합니다. </li><li> 복강 alfaxalone과 자일 라진의 혼합물을 주입하고 마우스 3 분 의식이 될 수 있습니다. </li><li> 마취 마우스가 더 이상 진행하기 전에, 같은 꼬리 핀치로 통증 자극에 응답 할 때까지 기다립니다 없습니다. 주의 : 동물을 처리하기위한 적절한 제도적 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> 로 transcardially 100 mL의 0.9 %의 염화나트륨 (PH 7.4-7.5) 솔루션 마우스를 관류1X PBS 중의 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎖ (PFA) (PH 7.4) (14) 다음에 (100 U / ㎖)에게서 피를 뽑다 헤파린을 함유. 주의 : PFA 용액 독성이다. PFA 솔루션 및 모든 후속 처리의 제조는 흄 후드 및 개인 보호 장비를 실시해야합니다. </li><li> 마우스 머리를 잘라 피부를 열고, 작은 가위를 사용하여 눈 사이 두개골을 깰. </li><li> 작은, 곡선 집게를 사용하여 두개골 조각을 제거합니다. </li><li> 뇌 또는 원하는 장기를 꺼내. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 후 수정 4 % PFA 솔루션의 뇌와 장기를 품어. 참고 : 특정 지역 조직 지우기를 들어, 특정 지역을 해부 또는 조직 고정 후 조직을 잘라. 주의 : PFA 용액 독성이다. transcardial 관류 이후의 모든 마우스 처리는 흄 후드 및 개인 보호 장비를 실시해야합니다. </li></ol> 3. 하이드로 겔 모노머 주입 및 폴ymerization <ol><li> 부드러운 흔들림 12-24 시간 동안 39 ° C에서 A4P0 하이드로 단량체 용액 중의 고정 장기 인큐베이션. </li><li> 하이드로 조직 중합 단량체 풍의. <ol><li> 하이드로 단량체 용액 5 ㎖와 10 ㎖ 둥근 바닥 튜브에 시료를 옮긴다. 파라 필름으로 둥근 바닥 튜브의 상단을 감싸. </li><li> 1 분 동안 액체를 통해 질소를 버블 링하여 하이드로 겔 주입 전체 마우스 뇌 샘플이 들어있는 둥근 바닥 튜브에서 산소를 제거합니다. 신속하고 긴밀하게 샘플 함유 튜브를 닫습니다. </li></ol></li><li> 2 시간 동안 수조 (37 ° C)로 튜브를 옮긴다. </li><li> 초과 하이드로 젤을 제거하기 위해 0.1X PBS와 함께 간략하게 중합 샘플을 씻으십시오. 주의 : 히드로 겔 단량체는 독성이. , 하이드로 겔 단량체와 피부 접촉을 피하기 흄 후드와 얼굴 가리개, 실험실 코트, 장갑을 포함한 개인 보호 장비, 모든 절차를 수행합니다. 참고 : 중합 조직4 ℃에서 2 주 이상 0.1X PBS 포함 된 나트륨 아 지드에 저장 될 수있다. 주의 : 나트륨 아 지드와 높은 급성 독성이다. 얼굴 방패, 실험실 코트, 장갑을 포함, 흄 후드 및 개인 보호 장비로 모든 절차를 수행합니다. </li></ol> 4. 전기 영동 조직 지우기 (ETC) <ol><li> 조직 컨테이너에 중합 샘플을 전송하고 ETC 실에서 조직 컨테이너를 배치합니다. </li><li> peristatic 펌프를 사용하여 ETC 버퍼와 ETC 챔버를 입력합니다. </li><li> 전문 의약품 조건을 설정하고 등 실행 다음 설정을 사용합니다. <ol><li> 시간 (6.0 시간), 펌프 속도 (30 회전)를 실행, (1.5 A), 온도 (37 ° C) : 전체 기관에 대한 ETC 설정를 들어, 다음 설정을 사용합니다. </li><li> 시간 (2.0 시간), 펌프 속도 (30 회전)를 실행, 전류 (1.5 A), 온도 (37 ° C) : 1 - 2 mm 두께 마우스 뇌 조각에 대한 ETC 설정를 들어, 다음 설정을 사용합니다. </li></ol></li><li> 전송 t그는 0.1X PBS의 45 mL의 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 삭제. 튜브가 잠시 흔들릴 때 기포가 본 적이 때까지 0.1X PBS로 클리어 샘플을 여러 번 세척 (SDS의 완전한 제거를 확인합니다). </li></ol> ACT-처리 조직 5. Immunolabeling <ol><li> 마우스 뇌 전체 경우 : 1X PBS 6 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 항체 용액 3 mL의 부피에서 샘플을 인큐베이션 0.1 % 트리톤 X-100, 0.01 %의 아 지드 화 나트륨 (항체 희석 용액)을 희석 가벼운 흔들림 37 ° C에서 4 일 동안 티로신 수산화 (TH) 항체 1/500의 요인. 일이 끝의 항체 용액을 대체. <ol><li> (3) 45 mL를 0.1X의 PBS로 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 씻으 - 5 시간 버퍼마다 시간을 변경합니다. </li><li> 약한 진탕과 함께 37 ℃에서 4 일 동안 당나귀 항 - 토끼 이차 항체 488의 1/500 희석 인자 항체 희석 용액 3 mL의 부피에서 샘플을 인큐베이션. REPL2 일에 희석 된 항체 솔루션을 에이스. </li></ol></li><li> 2 mm 두께의 슬라이스 뇌 조직에 1- 들어 : 밤새 또는 최대 1 일 동안 37 ℃ 콜라겐 IV 형 항체 1/500 희석 팩터 항체 희석 용액의 0.5 내지 1 ㎖의 부피에서 샘플을 부화 가벼운 흔들림과 C를 °. <ol><li> 1 ~ 2 시간 동안 0.1X PBS의 12 ML의 볼륨과 15 ML 원뿔 튜브에 샘플을 씻으십시오. 버퍼마다 시간을 변경합니다. </li><li> 항 - 토끼 이차 항체 하룻밤 또는 가벼운 흔들림 37 ° C에서 최대 1 하루를 Cy3 공역에 대한 1/500의 희석 배수와 항체 희석 용액의 0.5 1 mL의 부피에 샘플을 품어. </li></ol></li><li> 3 0.1X에 PBS를 샘플을 씻으 - 5 시간; 버퍼마다 시간을 변경합니다. </li><li> 촬상 전에, 부드러운 진탕 실온에서 1 시간 동안 CUBIC 실장 용액 적절한 양의 시료를 배양한다. 신선한 CUBIC 마운트 솔루션으로 교체하고 추가로 1 시간 동안 배양. 노트: </b&gt; 항체의 76 형 (31) 단일 클론 항체 (14)를 포함하여, 마우스 ACT-처리 조직에서 잘 작동했다. 미리 라벨링 된 조직은 가공 조직 ACT 두 이상의 형광 색소의 immunolabeling와 결합 될 수있다. </li></ol> 조밀 한 조직의 6 Immunolabeling (PRESTO) <ol><li> C-PRESTO 참고 : C-PRESTO는 전체 고환, 전체 신장, 또는 더 큰 장기의 작은 부분 작은 크기의 샘플에 적합합니다. <ol><li> 1.5 ㎖의 튜브에 샘플을 이동 콜라겐 IV 형 항체 1/500 희석 팩터 항체 희석 용액 500 μL를 추가하고, 2 시간 동안 600 × g에서 튜브를 원심 분리. </li><li> 30 분 동안 600 × g에서 원심 분리하여 0.1X PBS와 스테인드 샘플을 씻으십시오. </li><li> 2 시간 동안 600 × g에서 Cy3에 접합 된 항 - 토끼 이차 항체와 원심 분리기에 대한 1/500의 희석 배수와 항체 희석 용액 500 μL를 추가합니다. </li><li> 0 스테인드 샘플을 씻으십시오.30 분 동안 600 × g에서 원심 분리하여 1X PBS. </li></ol></li><li> S-PRESTO 참고 : S-PRESTO 큰 조직에 적합합니다. <ol><li> 주사기 (30 mL의 부피)를 준비하고, 3 방향 밸브 (도 1a)에 연결한다. 고압 조건 (도 1b)에 대한 접착제 총 밸브를 붙인다. </li><li> 폐쇄 밸브 위치에 3 방 밸브에 연결된 주사기에 샘플을 이동. </li><li> 콜라겐 IV 형에 대한 항체의 1/500 희석 인자 항체 희석 용액 7 mL를 5 - 추가. 밸브를 개방하여 샘플에 항체 솔루션을 놓습니다. </li><li> 주입 / 출금 이동에 충분한 공간을 제공하기 위해 17 ㎖의 위치 주사기 피스톤을 설정한다. 이것은 개방 밸브 위치에서 수행 할 수 있습니다. 주사기 설정이 완료된 후, 3 방향 밸브를 닫는다. </li><li> 주사기 펌프에 샘플이 들어있는 주사기를 넣습니다. 10 ㎖ / 분 주입 / 인출 량과 4-에 주사기 펌프 상태 설정분 연속 사이클 모드 (그림 1C)에 시간을 일시 중지합니다. 주 : 상기 타겟 볼륨 (10 ㎖)하고 짧은 휴지 (4 분) 후 흐름의 방향이 변경 될 때까지 펌프 주입한다. </li><li> 실온 (그림 1 층)에서 24 시간 - 3 주사기 펌프를 실행합니다. </li><li> 3 방향 밸브를 열고 0.1X PBS와 솔루션을 교체합니다. </li><li> 주사기 펌프를 이용하여 1 시간 동안 0.1X PBS로 두 번마다 염색 된 샘플을 세척한다. </li><li> Cy3가 접합 된 항 - 토끼 이차 항체 (1/500 희석 인자)을 함유하는 항체의 희석 용액으로 바꾸고 3 주사기 펌프를 실행 - 24 시간. </li><li> 3 방향 밸브를 열고 0.1X PBS와 솔루션을 교체합니다. </li></ol></li><li> 촬상 전에, 부드러운 진탕 실온에서 1 시간 동안 CUBIC 실장 용액 적절한 양의 시료를 염색 배양한다. 신선한 CUBIC 마운트 솔루션으로 교체하고 추가로 1 시간 동안 배양. </li></ol> 7.maging <ol><li> 공 초점 접시에 레이블 조직을 배치하고 조직이 덮여 때까지 CUBIC 마운트 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 조직에 커버 슬립을 놓습니다. 10 배 목표 아래 이미지에 조직 (14)를 공 초점 현미경을 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&amp;#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

조직에 좋지 고정 또는 하이드로 겔 침수는 단백질의 손실과 조직의 청산 과정에서 조직의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 부드러운 흔들림 18 H - 전체 성인 마우스 뇌 12 겔 단량체 용액을 20 ㎖의 최소 부피에 침지 한 후, 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 배양한다. 뇌 슬라이스와 척수 등의 인체 조직을 포함하여 대규모 조직의 경우, 요구되는 하이드로 겔 단량체 용액에서 시간을 몸을 담글 확장했다. 조직 고정 및 폴리머 주입 단계가 분리되어 있기 때문에 ACT 프로토콜은 고정 된 조직의 청산에 쉽게 적용 할 수있다. 조직 클리어 한 후, 인체 조직은 여러 항체로 잘 염색 하였다. 법 개간 기술은 에탄올과 메탄올 등 알코올 고정 제와 호환되지 않습니다. 조직 - 겔 중합 단계도 클리어 가공 후의 양질 조직을 제조하는 것이 중요하다. 때문에산소 아크릴 아미드의 중합 반응을 억제이를 질소 가스 주입 시스템 하에서 조직 - 함유 용액을 탈기에 의해 제거되어야한다. 다르게는, 탈 산소 23 시간 동안 가열 블록 진공 챔버를 사용하여 실행될 수있다. 지우기 속도는 대부분의 성인 마우스 조직 하룻밤 ETC에 의해 삭제 될 수 등 기관의 크기, 지질 또는 ECM 섬유 단백질의 내용, 고정의 상태 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 그러나의 위험이 불필요한 과잉 소거 및 조직 부종; 따라서, 청소 시간의 차이가 중요한 고려 사항으로합니다. 조직 청산 조건은 경험적으로 결정되어야한다. 중요하게는, ECM의 내용이 클리어 조직의 외관에 영향을 미칠 수있다. ACT는 고밀도 단백질 섬유를 취소하지 않기 때문에 조직의 색상, 심지어 ETC 버퍼의 ACT 후, 흰색 또는 불투명 남아있다. 그러나, 이러한 기관은 RI 정합 용액에 침지하여 상기y를 투명하게되었다. 조직의 팽창 속도는 밀도 기관보다 더 큰 팽창 비율을 전시, 전자 재료 조직의 내용 및 뇌 소프트 기관에 의존 할 것으로 보인다. 증가 된 조직은 조직 청산 절차를 도움이 될 것입니다 붓기 때문에, ACT는 정기적으로 대부분의 경우 수성 버퍼를 증류하여 사용한다. 조직 부종 또는 과도 변형은 배아 같이 바람직되지 않는 경우에, 버퍼 함유 0.1X PBS는 고해상도 영상에 대해 적용 할 수있다. 또한 버퍼의 높은 염 농도는 조직의 수축을 일으킬 수 있다는 것을 주목해야한다. 행위 방법은 마우스 (14)의 전체 기관, 심지어 몸 전체를 명확히 할 수 있습니다. 그러나, 투명 조직의 깊은 조직 이미징은 특수 현미경과 목표를 필요로한다. 따라서, 두꺼운 뇌 조직 1 - 2 mm는 종래의 공 초점 현미경 이미징을위한 가장 효과적입니다. 라벨의 우리의 손에, 제거ACT-처리 조직에서 에드 항체는 항체 의존적이며, 다른 항체 라벨의 라운드는 권장되지 않습니다. 이러한 TH 및 GFAP 등 여러 항체는, 전체 뇌 14 immunolabeling 특히 잘했다. 한편, 이러한 Tuj1 Map2에 또는 일부 항체는 종종 조직의 표면을 표지. 이것은 스위치 (15)와 같은 다른 방법에 의해 개선 될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 있기 때문에, 조직이 조직 지우는 단계 동안 팽창 및 수축의 ACT 처리 된 조직에서 미세 단백질 구조를 유지하기 어려울 수도 있다는 것이다. 프레스토 기술은 조직 라벨링 다양한 기술에 적용 가능하다. 예를 들어, SeeDB 4 iDISCO 7로 미리 라벨링 조직을 사용하여 조직 투명한 방법으로, 조밀 한 조직의 immunolabeling는 주에 몇 일 이상 배양 기간이 필요합니다. 그러나 PRESTO 몇 시간 배양 시간을 단축 할 수 있고, 예를1-mm 두께의 치밀한 조직을 갖는 일 이내에 전체 프로세스의 완료를 nabling. PRESTO 두꺼운 깊은 라벨, 조밀 한 조직, 또는 해제 해제 두꺼운 조직의 효율성을 향상시킬 수 있습니다. PRESTO 테이블 탑 원심 분리기 나 주사기 펌프를 사용하며 특별한 장비를 필요로하지 않기 때문에, 일상적인 실험 방법과이 방법을 구현하기 위해 상대적으로 용이하다.

신경에서의 과제 중 하나는 신경 회로 배선 그대로 뇌 조직 내의 개별 세포의 가시화된다. 최근까지, 이러한 방법으로 뉴런 간의 연결을 보여주는 조직은 1) 직렬 절편 요구; 이러한 축삭 또는 단백질과 같은 특정 대상, 2) 분자 표지; 전산 등록 또는 2D 직렬 이미지 1의 정렬을 통해 전체 뇌의 3 차원 복원에 의한 3) 시각화. 이 단계에서는, 번잡 많은 시간이 필요하며, 신경 네트워크 매핑 대단히 어렵게 절편 라벨링 동안에 정보가 손실되기 쉽다. 그러나, 단면 처리없이 그대로 조직의 시각화 할 수있는 여러 방법이 개발되어왔다. 생물 조직은 조직 청산 기술 2-10에 의해 광학적으로 투명하게 할 수있다. 주요 방법 중 하나가 손상 조직 차례로 침지 액의 굴절률 차이를 감소시키는따라서 투명한 조직을 렌더링 깊은 구조의 관찰을 가능하게 본래 조직에 광 산란을 감소시킨다. 침지 용액의 일부 유형의 탈수 과정에서 빠른 형광 소광 될 소수성을 갖는다. 따라서, 이러한 방법은 시간이 11, 12의 긴 기간 동안 형광 이미징와 호환되지 않습니다. 대신 소수성 시약, 다른 방법은 생체 조직의 4,6,8의 구조적 정보와 형광을 유지하는 등 SeeDB 4 무서 리터 전자 (6)와 같은 조직 청산을위한 친수성 시약을 사용합니다. 그러나, 거대 분자는 항체를 포함 형 확산에 의해 손상 조직의 중심에 도달 할 수 없다. 따라서, 밀집된 조직의 깊은 영역에서 표적 분자의 미리 라벨링 기술적 도전이다. 최근 개발 조직 소거 방법에있어서, CLARITY 3 하이드로 겔 포함 생체 조직의 전아크릴 아마이드 형성 S 및 지질 도데 실 황산나트륨 (SDS) 함유 용액 하에서 전기 영동에 의해 제거된다. 샘플은 다음 3 광 산란을 감소시키는 정합 굴절률과 용액에 침지된다. 지질 제거 시스템은 나중에 고급 CLARITY (13)와 PACT (수동 명확하게 기술) (10)에 수정되었습니다. 중합 종료 후, 아크릴 사슬은 하이드로 겔을 형성하는 조직, 단백질 가교. 아크릴 아미드와 가교 할 수 없습니다 지질 구성 요소; 따라서, 지질은 SDS 함유 완충액에 따라 전기 영동에 의해 제거 될 수있다. 지질의 활성 제거를 통해 뇌 조직 현저 투명성 9 증가시킨다. 그러나 이러한 방법은 자유 확산에 의해 깊은 라벨의 불가능을 해결하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 두꺼운 조직의 가장 깊은 부분에 시약의 활성 전송에 대한 기술이 필요하다. CLARITY 조직의 청산과 깊은 조직을 수 있지만시각화, 그것은 쉽게 또는 빠르게 절차 아니다. 그것은 전체 마우스 뇌 7, 14을 취소 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 조직의 신속한 소거 생명 과학 연구 나 볼륨 진단용 기본적인 임상 실험실 설정 이러한 방법의 적용을 위해 필수적이다. 현재의 프로토콜은 압력을 이용한 배달 면역 염색에 의해 생체 조직 통관 이후의 단백질 검출을위한 간단한 방법을 제공한다. 이 촬상 방법과 조합에 의해 출원 된 많은 3 차원 데이터 처리 시스템의 고해상도 볼륨 촬상에 적합하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

식별 및 장기 또는 세포 수준에서 몸 전체의 세부 조직의 탐구는 생물학의 근본적인 문제입니다. 천이 방법은 프로세스의 각 단계에서 정보의 손실이 발생 상당한 시간 및 3 차원 영상을 얻기위한 노력의 양, 본래 조직 절편 immunolabeling 포함 이미징 직렬 단면 조직을 필요로한다. 손상 조직 내에 고해상도 영상에 대한 최근 개발 된 방법에서, 분자의 특성은 단백질의 표지로 제한되었다. 그러나 장기 청산 현재 사용 가능한 프로토콜은 어려운 실험실에서 조직 정화 기술을 구현하고, 상당히 긴 처리 시간을 필요로한다. 우리는 최근에 신속하고 높은 재현성 프로토콜은 ACT-PRESTO로 명명 설립 (A 뽑은 C larity의 t echnique- P는 ressure의 r은 전자 fficient와의 테이블 t의를 ransfer을 의기 양양몇 시간 내에 조직 통관을 허용 오 rgans)에 고분자의. 또한, ACT-PRESTO은 기존의 방법과 빠른 immunolabeling을 가능하게하고 압력 또는 대류 흐름을 적용하여 조밀하게 형성, 두께 시편의 깊은 층으로 항체 침투를 가속화합니다. 우리는 전기를 사용하여 지방 제거에 의해 삭제하는 방법 조직을 준비하는 방법에 대해 설명하고, 방법을 압력 보조 전달하여 면역 염색. 프로토콜의 신속성과 일관성 차원 조직 학적 연구 볼륨 기반 진단 성능을 촉진한다.

ACT-조직 지우기 조직 지우기 영향을 미치는 하나의 중요한 요소는 조직 정착된다. PFA 고정 및 아크릴 아미드 주입이 프로토콜에 별도의 단계입니다. 조직 주입 하이드로 겔은 가교 고분자로 내인성 있지만 조직 - 겔 중합 단계 후 프리 A4P0 용액을 중합되지 않는다. 그러므로, 겔 조직 (그림 2A)의 외부를 형성 없습니다. 단백질과 아크릴 사이의 작은 가교의 ACT 절차의 결과는 CLARITY 프로토콜에 비해. 따라서, 하이드로 겔 조직 샘플보다 다공질이다. 이 기능은 지질의 빠른 추출 및 거대 분자의 확산을 가능하게한다. 2 시간 (그림 2B), 5 - - 마우스의 뇌 1- 충분히 1에서 삭제 된 두꺼운 mm 2의 섹션 ETC의 6 시간이 다하기에 충분했다전체 마우스 뇌 (그림 2C)의 learance. 하이드로 겔 매개 조직 청산은 ETC 단계 이후 조직의 확장을 유도하지만, 조직 반사 인덱스 매칭 솔루션의 원래 크기로 돌아왔다. 행위 과정에서 형성된 겔 조직 샘플은 다공성이며, 따라서, 작은 고분자 화합물을 효율적으로 침투 할 수있는 쉽고 (도 3)으로 확산. 티로신 수산화 (TH) 및 콜라겐 유형 IV 항체와 1 mm의 뇌 조각의 2 시간 배양 후 2 차 항체를 가진 이후 2 시간 배양는 500 μm의 깊이에서 도파민 신경 세포를 라벨에 충분했다 (그림 3) . PRESTO-조직 Immunolabeling 밀도 기관은 일반적으로 조직에 대한 항체의 영향을 침투 ECM 섬유의 높은 농도를 갖는다. 따라서, 항체는 penet배양 12 시간 후, 만 20 ~ 30 μm의 같은 신장 조직으로 조밀 한 조직에서의 깊이로 평가. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 깊은 조직에 시약의 전달, 즉 PRESTO (장기에 거대 분자의 효율적이고 안정적인 전송을 관련 압력) (그림 4)를 활성화 활성 고분자 침투 방법을 설계했습니다. 항체 솔루션, 테이블 탑 원심 분리기와 원심력 (600 XG)의 응용 프로그램 (원심 PRESTO, C-PRESTO) 크게 깊은 조직에 항체 전달을 개선한다 (그림 5)와 ACT-처리 신장 조직의 정적 배양에 비해. 우리가 조밀 한 조직에 C-PRESTO 절차를 적용 할 때, 배양 3 시간은 300 μm의 깊은 구조에 250 레이블을하기에 충분했다. 심각한 조직 손상없이 조직의 왜곡을 개선하기 위해, 또한, 주사기 펌프 (주사기 PRESTO S-PRESTO)와 대류를 제공하는 시스템을 설계 하였다. 이 프로세스는 유사 항체 PE 향상netration 수동 확산 (그림 5)에 비해. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> 의 S-PRESTO 장치의 그림 1. 준비. A. 주사기 (30 mL) 및 삼방 콕. B. 3 방향 스톱 콕에 연결된 주사기에 붙어. C. 시료와 항체 용액을 함유 주사기 및 주사기 펌프에 배치 된 주사기. D. 주사기 펌프 및 작업 조건 설정. E.는 펌프 시험편으로 라벨링 시약을 함유하는 용액을 주입한다. 상기 지정된 볼륨은 펌핑 방향의 변화 도달 시간의 지정된 기간 이후에 용액을 인출하는 경우. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 마우스 뇌 그림 2. ACT 조직을 취소합니다. 중합 후 A., 무료 A4P0 솔루션은 중합되지 않습니다 조직 주입 하이드로 겔은 내생 고분자와 가교에 의해 겔화되어있다. 2 mm 두께의 뇌 조각에 B. 1은 1 삭제했다 - 2 시간, 반사 지수의 확장과 크기 복구의 범위는 (RI) -matching 솔루션을 기록 하였다. 완전히 분명 뇌에 충분한 ETC의 6 시간 한 - C. 전체 마우스 뇌의 두께는 약 0.8 cm, 5입니다. ETC 3 시간 후, 비 - 소거 조직 상당량이 있었다. ETC의 6 시간으로, 그러나, 전체 뇌의 청소가 발생했다. 전문 의약품 버퍼 ACT 후 조직의 색깔은 흰색 또는 불투명하다. RI 조정으로 조직을 투명하게. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하세요</a>전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> ACT-해제 마우스 뇌 조직 그림 3. Immunolabeling. 콜라겐 유형 IV 및 항체로 염색 중뇌의 일부에 대한 항체로 염색 마우스 뇌 피질을 보여주는 ACT-처리 1-mm 마우스 뇌 조각의 이미지는 수산화 (TH)를 티로신합니다. 스케일 바, 100 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> 그림 4. PRESTO의 immunolabeling 방법. 항체는 확산에 의해 치밀한 조직으로 침투 할 수 없습니다. PRESTO의 immunolabeling 방법은 적극적으로 거대 분자를 주입하고에 시약을 제공하도록 설계되었다조밀 한 조직. 표준 탁상용 원심 분리기 (원심 PRESTO, C-PRESTO)를 사용하여 원심력의 적용은 현저 항체의 전달을 용이. 항체 침투 향상 주사기 펌프 (주사기 PRESTO S-PRESTO)와 대류를 Appling. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> ACT-삭제 조밀 한 조직의 5 PRESTO의 immunolabeling 그림. C-PRESTO 들어, 조직은 일차 및 이차 항체의 침투를 촉진하기 위하여 표준 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 3 시간 동안 600 × g으로 원심 분리 하였다. S-PRESTO 들어, 시린지 펌프는 항체를 제공하는데 사용되었다. 예컨대, 신장, 간 등의 마우스 기관, 콜라겐 IV 형으로 표시 하였다. 종래의 방법 중, 3 시간에 비해C- 또는 S-PRESTO는 현저하게 라벨의 깊이를 향상시킵니다. 50㎛의 (좌측) - 대조 시료 만 (40)의 깊이로 표시되어 있지만, 프레스토 샘플 (오른쪽)에서 350 μm의 또는 깊이 - 신장 및 간에서, Z 축 깊이 (300)에 도달한다. 의 3D 재구성 된 영상은 공 초점 현미경에 의해 수득되었다. 스케일 바, 100 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 - 이미징 될 수있다.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K 조회수.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 - 이미징 될 수있다. 

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Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

연구

생물학

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

생물 학적 시스템에서 산소 이미징에 대한 인광을 발하는 나노 프로브의 합성 및 교정

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging with high molecular specificity 1. The sensitivity of these techniques, however, is many orders of magnitude weaker than fluorescence, requiring milli-molar molecular concentrations 1,2. Here, we describe a technique that can enable the detection of weak or low concentrations of Raman-active molecules by amplifying their signal with that obtained from strong or abundant Raman scatterers. The interaction of short pulsed lasers in a biological sample generates a variety of coherent Raman scattering signals, each of which carry unique chemical information about the sample. Typically, only one of these signals, e.g. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), is used to generate an image while the others are discarded. However, when these other signals, including 3-color CARS and four-wave mixing (FWM), are collected and compared to the CARS signal, otherwise difficult to detect information can be extracted 3. For example, doubly-resonant CARS (DR-CARS) is the result of the constructive interference between two resonant signals 4. We demonstrate how tuning of the three lasers required to produce DR-CARS signals to the 2845 cm-1 CH stretch vibration in lipids and the 2120 cm-1 CD stretching vibration of a deuterated molecule (e.g. deuterated sugars, fatty acids, etc.) can be utilized to probe both Raman resonances simultaneously. Under these conditions, in addition to CARS signals from each resonance, a combined DR-CARS signal probing both is also generated. We demonstrate how detecting the difference between the DR-CARS signal and the amplifying signal from an abundant molecule's vibration can be used to enhance the sensitivity for the weaker signal. We further demonstrate that this approach even extends to applications where both signals are generated from different molecules, such that e.g. using the strong Raman signal of a solvent can enhance the weak Raman signal of a dilute solute.

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

A combination of three single wavelength short-pulsed lasers is used to generate coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and doubly-resonant CARS (DR-CARS). The difference between these signals provides enhanced sensitivity for otherwise difficult to detect coherent Raman signals, enabling imaging of weak Raman scatterers.

이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of interest. When considering the analysis of complex biological systems, the segmentation of three-dimensional image data is a time consuming and labor intensive step. With the increased availability of many imaging modalities and with automated data collection schemes, this poses an increased challenge for the modern experimental biologist to move from data to knowledge. This publication describes the use of SuRVoS Workbench, a program designed to address these issues by providing methods to semi-automatically segment complex biological volumetric data. Three datasets of differing magnification and imaging modalities are presented here, each highlighting different strategies of segmenting with SuRVoS. Phase contrast X-ray tomography (microCT) of the fruiting body of a plant is used to demonstrate segmentation using model training, cryo electron tomography (cryoET) of human platelets is used to demonstrate segmentation using super- and megavoxels, and cryo soft X-ray tomography (cryoSXT) of a mammalian cell line is used to demonstrate the label splitting tools. Strategies and parameters for each datatype are also presented. By blending a selection of semi-automatic processes into a single interactive tool, SuRVoS provides several benefits. Overall time to segment volumetric data is reduced by a factor of five when compared to manual segmentation, a mainstay in many image processing fields. This is a significant savings when full manual segmentation can take weeks of effort. Additionally, subjectivity is addressed through the use of computationally identified boundaries, and splitting complex collections of objects by their calculated properties rather than on a case-by-case basis.

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Segmentation of three-dimensional data from many imaging techniques is a major bottleneck in analysis of complex biological systems. Here, we describe the use of SuRVoS Workbench to semi-automatically segment volumetric data at various length-scales using example datasets from cryo-electron tomography, cryo soft X-ray tomography, and phase contrast X-ray tomography techniques.

볼륨 세분화 및 SuRVoS (슈퍼 지역 볼륨 세분화) 워크 벤치를 사용 하 여 생물학 물자의 분석

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.