The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. 비계 리포좀의 제조 참고 : 이상적으로, 초기 실험은 DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 또는 PC)와 DGS-NTA (니켈 2 +) (1,2-dioleoyl로 구성된 비교적 간단하고 특색 발판을 (사용해야합니다 - SN -glycero -3 - [(N은 - (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산) 숙시 닐]. (니켈 염)) 건축 실험 오프 지질 전하, 유연성 및 굴곡 개별 요소로서 도입 될 수있다 잠재적으로 막 근위 상호 작용을 변경한다. 이러한 변경 또는 포스파티딜 리핀 (CL), 포스파티딜 에탄올 아민 (DOPE 또는 PE) 또는 락토 (β) 세라미드 지질 성분을 포함한 특정의 한정된 양의 첨가에 의해 달성 될 수있다. <ol><li> 깨끗한 유리 시험관에 클로로포름 지질 결합. 얇은 지질막을 형성하도록 튜브를 회전시키면서 건조 질소 가스에 용제를 증발시켰다. centrifuga와 잔류 용매를 제거37 ° C에서 1 시간 동안 L 증발기. 참고 : 다양한 리포좀 제제는 프로토콜에 사용되는 아래에 설명 : 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2 +) / 96.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀과 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 86.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀 유연한 골격 리포솜 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 35 몰 %의 DOPE / 51.7 몰 %의 DOPC) 및 농축 된 지지체 리포좀 (10 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 35 몰 % DOPE / 40 몰 %의 DOPC / 15 몰 %의 리핀). </li><li> 37 ° C로 예열 완충액 A (25 mM의 HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) KOH 7.5로 조정 한 150 mM의 KCl을, 산도)를 추가, 최종 지질 농도는 1이되도록 - 2 mm이다. 완전히 지질 혼합물 (도 1a)에 재현 탁하는 비정기 텍싱 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 완전히 냉동 (roug 때까지 액체 질소에 튜브, 플라스틱 시험관에 이동 배치hly 30 초), 완전히 해동 (약 1까지 37 ° C의 물을 욕조에 장소 - 2 분). 4 동결 해동 사이클 (그림 1b)의 총 반복합니다. </li><li> 4 필터 지원 및 버퍼의 폴리 카보네이트 필터를 몸을 담글 및 제조업체 지침에 따라 압출기를 조립하여 지질 압출기를 준비합니다. 필터를 통해 21 회 지질 용액을 돌출. 균일 한 크기 분포 (그림 1C)을 보장하기 위해 부드러운, 일정한 압력을 사용합니다. 주 :이 프로토콜에 기재된 모든 실험의 경우, 1.0 ㎛의 폴리 카보네이트 필터를 압출 하였다. 음이온 성 지질로 Drp1 개입 50 nm 내지 400 nm의 12 이상 13 범위 리포솜 다양한 직경으로 관찰 할 수있다. 따라서, 1 ㎛의 필터 사이즈 모두는 GTPase 활성 및 전자 현미경에 적합하도록 선택되었다. 다른 리포좀 직경은 원하는 경우 거대한 단일 층 소포 14, 15 (GUVs) 또는 작은 unilamell의 준비아칸소 사용할 수 있습니다 (16) (포드 SUV)을 소포. 동적 광산란 리포좀 크기 이질성 (13)을 평가하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 4 ° C에서 압출 리포좀을 저장하고 3 후 폐기 - 5 라. </li></ol> 단백질 바인딩 분석을위한 발판 리포좀의 2. <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 적어도 15 분 동안, 비계 리포좀 (50 μM 최종 40 몰 %의 PC / 35 몰 %의 PE / 15 몰 % CL / 10 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+))와 (5 μm의 최종) MffΔTM을 그의 - 태그 품어 버퍼 A + BME에 실온에서 (25 mM의 HEPES, 150 밀리미터의 KCl, 10 MM의 β-머 캅토 에탄올 (BME)는, pH는 KOH 7.5로 조정). MFF없는 제어를 위해, NTA 니켈 (Ni 2+)에 노출 된 자신의 태그가 제어 결합하는 (예 : GFP)을 단백질과 방패 리포좀을 품어. 주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 MffΔTM은 발현시키고 정제 하였다. GFP를 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 공정을 생략 하였다. BME이 experimen 필요했다TS Drp1는 활동 및 조립 특성을 변경할 수 있습니다 산화에 민감하기 때문이다. </li><li> Drp1 (최종 2 μM)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양. 주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 Drp1은 발현시키고 정제 하였다. Drp1과 부화 후, 막 변형을 구속 염기의 효과가 2 밀리미터의 MgCl 2, 중 1 ㎜ GTP, 1 mM의 GMP-PCP, 또는 버퍼 A + BME를 하나의 추가 시간을 배양하여 조사 할 수있다. </li></ol></li><li> 네거티브 얼룩 투과 전자 현미경 (EM) 분석 <ol><li> 전사 5 실험실 필름의 시트 샘플 μL, 시료에 카본 코팅 구리 / Rh를 그리드 누워. 샘플의 그리드 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 액체를 멀리 오 점, 2 %의 우라 닐 아세테이트 한 방울로 전송합니다. 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 얼룩을 지워, 및 그리드 상자로 전송할 수 있습니다. 진공 O / N에서 스토어 전체 탈수을 보장합니다. </li><li> 투과형 전자 microsc를 사용하여 이미지 샘플18,500에서 OPE - 30,000X 배율은 단백질과 리포좀 모폴로지 (17)의 미세 구조 변화를 관찰합니다. 참고 : 미세 구조의 변화가 그러한 ImageJ에 (13), 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다 (http://imagej.nih.gov/ij/). 단백질은 장식 벗은 지질 템플릿과 비교하여 측정 할 수있다. 또한, 관형 부분의 직경은 어셈블리 (13)의 최 외곽 부분에서 측정 할 수있다. 보다 상세한 분석은 극저온 전자 현미경 (17)을 사용하여 수행 될 수있다. 이 방법은 코팅 샘플의 중금속 오염을 사용하지 않고 용매 이미지 천연 단백질 지질 어셈블리에 사용될 수있다. 이와 같이, 기본 형태의 지질의 변화를 포함한 음극 얼룩 명백하지 상세한 구조적 특징은 검사하고 정량화 할 수있다. </li></ol></li></ol> 효소 분석을위한 발판 리포좀의 3. 참고 : 로리를통계는 GTPase 분석 (18)는 GTP 가수 분해를 통해 인산 해방을 측정하는 데 사용되었다. 대체는 GTPase 세이 19 사용할 수 있으며, 필요에 따라 구현 될 수있다. <ol><li> (150 μM 최종) 비계 리포좀 버퍼 A + BME (부피 = 30 μL)에 실온에서 15 분간와 그의-태그 MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), 또는 GFP가 (모두 5 μm의 최종) 품어. Drp1 (500 nM의 최종)를 추가하고 RT (부피 = 80 μL)에 추가로 15 분을 품어. 참고 Fis1 MFF는 2와 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 크로마토 그래피 단계는 생략 하였다. 그 태깅 된 GFP의 목적은 NTA (니켈 2+) headgroups 실드와 다른 단백질과의 비특이적 상호 작용의 전하를 방지하기위한 것이다. 효과는 GFP의 부재하에 관찰되지 않으면,이 제어가 필요하지 않을 수도있다. (관심있는 단백질에 필적하는 크기의) 대안 차단 단백질도 사용할 수 있지만, GFP는 SCAF와의 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용리포좀을 접어주십시오. </li><li> 열 순환기로 전송 튜브는 37 ° C로 설정하고, GTP와의 MgCl 2를 첨가하여 반응을 개시 (각각 1 ㎜, 2 mM의 결승전을, 부피 = 120 μL를). </li><li> 목적하는 시점 (즉, T = 5, 10, 20, 40, 60 분)에서의 Mg 킬레이트 2+하고 반응을 정지 0.5 M EDTA 5 μL를 포함하는 미세 적정 플레이트의 웰에 반응 20 μL 옮긴다. </li><li> 결과를 보정 버퍼 A + BME에서 KH 2 PO 4를 희석하여 인산 표준 세트를 준비합니다. 표준 유용한 집합은 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 0 μM이다. 0.5 M EDTA의 5 μL를 포함하는 우물에 각 20 μL를 추가합니다. </li><li> 각 웰에 150 μL 말라카이트 그린 시약 (1 mM의 말라카이트 그린 카비 놀, 10 mM의 몰리브덴 산 암모늄 수화물, 1 N 염산)을 추가하고 OD를 첨가 한 후 650 5 분을 참조하십시오. 주 : GTP는 산 불안정성이며, 말라카이트 그린 시약의 존재 하에서 가수 분해된다. 그 t 확인공작석 시약을 추가하고 읽기 사이에 그는 시간이 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 일정하다. </li><li> 인산염 농도의 함수로서 표준 OD 650 플로팅하여 표준 곡선을 생성한다. 샘플의 OD 650 인산염 농도 사이의 관계를 결정하기 위해 선형 회귀 분석을 사용한다. </li><li> 선형 회귀를 이용 μM 인산염 단백질 반응 시료의 OD 650으로 변환. 시간의 함수로서 인산 농도를 플로팅하여 각각의 반응 액에 대한 포스페이트 생성 속도를 결정하고 Drp1 농도 (0.5 μM)에 의해 속도를 나누어 고양이 k로 변환한다. 참고 : 초기 선형 속도 포스페이트 생성 속도를 결정하기 위해 사용되어야하고, (3) 데이터 포인트의 최소 사용되어야한다. 반응 속도는 처음 세 데이터 포인트가없는 선형 충분히 빠른 경우 사인 (즉, 선형 피팅의 R2는 0.9 미만이다)최소 3 시간 포인트 ificantly 짧은 시간 과정은 수행해야합니다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules.">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 통합 막 단백질을 포함하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하는 방법을 제공한다. 모듈 리포솜 지지체를 이용하여, 연구자들은 지질 근위 환경에서 하나 이상의 단백질의 활성을 사정 할 수있다. 26 - 이전 연구 세포막 수용체 (24)의 효소를위한 동일한 방법을 증명하고있다. 우리는 지질 보조 인자를 포함하고 미토콘드리아 분열 기계의 mechanoenzymatic 핵심을 구성하는 단백질 사이의 상호 작용을 탐구하는이 방법을 확장했다. 위에서 제시 한 모델 시스템을 위해, 우리는 MFF 장식 SL이 Drp1의 자기 조립을 강화 것으로 나타났습니다. 또한, 우리는 이제 MFF 장식 ESL 템플릿 효율적으로 확장 관 구조를 형성하도록 야생형 Drp1으로 개조 된 것을 나타낸다. 또한 음전기 리핀 및 원뿔형 지질 PE 등 다양한 미토콘드리아 지질의 역할을 평가 하였다.PE에 의해 부여 막의 유연성과 유동성 막 배기관 향상하지만 상기 자극 MFF는 유도 증대하지 않지만 리핀, 상기 Drp1의 자기 조립을 강화 MFF와 synergizes. 막 모폴로지의 미세 구조 변화를 평가하기 위해, EM이 필요 하였다 분석. Drp1는 GTPase 활성 및 클러스터링 크게 2 리포좀을 바꿀 않았다 사상 중합체의 조립을 통해 상승 하였다. 더 미토콘드리아 형상 SL / PE / CL 템플릿을 사용했을 때, 멤브레인의 변형이 관찰되었다. 흥미롭게도, 효소 활성은 향상되지 않았다. 따라서, EM 연구는 달리 기능적 분석법을 사용하여 누락 될 주요 차이점을 확인하는데 필수적이었다. 이 기술은 기능과 수용성 단백질과 수용성 단백질 도메인의 상호 작용을 탐색 강력한 반면, 이들 지질 발판 횡단 도메인의 역할을 설명 할 수 없다에스. 지질 이중층 30 - 막 횡단 도메인은 자기 조립체 (27)와 측면 확산 (28)와 같은 동적 단백질 프로세스에 영향을 줄 수 있기 때문에 매우 중요한 고려 사항이다. 이러한 요인은 막 표면에서 단백질 상호 작용을 평가하는 중요한 경우 세제 다음 전통적인 지질 재구성 실험 선호된다. 대체 사슬도 막 고정 단백질의 모집 및 이동을 제어하기 위해 탐험 할 수있다. NTA (니켈 2+) 지질 앵커, 비오틴 - 컨쥬 게이트 (31) 또는 반응기 공역 지질 다른 테더가 사용될 수와 그 태깅 된 단백질을 사용하는 것 외에도. 이 공유 수정이보다 안정적으로 트랩 지질 표면에서 단백질하지만, 이동성과 이러한 요소의 교환 가능성이 감소 될 것입니다. 이에 따라, 테더는 신중하게 검토되는 단백질 복합체의 맥락에서 고려되어야한다. 때 conside이 방법의 사용을 링 템플릿 지질 단백질을 테 더링의 모드는 특정 분석에 영향을 미칠 가능성이있다. 예를 들어, NTA (니켈 2+) 방법으로 그 태그 테 더링 특히 과도 단백질 - 단백질 상호 작용의 경우에는, 계내 분석보다는 분리 실험에 더 적합 할 수있다. 이것은 분명히 시츄 네거티브 얼룩 전자 현미경 및 침강 분석 사이의 차이에 의해도 3에서 설명된다. 앞으로 두 별개의 대상 headgroups 이러한 앵커 지질 이상을 조합하여 단일 지질 테더 경쟁없이 지지체 템플릿 여러 단백질의 채용을 허용하도록 구현 될 수있다. 또한, 각 요소의 상대적인 풍부 지질 조성물을 변경함으로써 관리 될 수있다. 이러한 phosphoinositides, 카디오 리핀, 및 포스파티딜 세린과 같은 추가의 지질 보조 인자들은 쉽게 도입 될 수있다이 템플릿의 다양한 요소의 절연 효과를 평가한다. 전반적으로, 이러한 지질 발판 지질 세포막에 가까운 복잡한 단백질 상호 작용을 조사하기위한 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 이러한 템플릿은 쉽게 생성되며 효소 검정, 전자 현미경 또는 형광 이미징 등 다양한 응용 범위를 맞출 간단하다. 또한, 지질 조성물 더 이들 특정 영역에서 단백질 기능 요점을 되풀이 관심의 소기관 또는 막 마이크로 도메인을 닮은 제형 화 될 수있다. 이러한 기술을 이용하여, 생화학은 파트너 환경과 결합 된 멤브레인 및 멤브레인 관련 단백질의 복잡한 상호 작용을 조사 할 수있다.

막 인접 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부 인해 1 포함 된 통합 막 단백질의 기본 환경을 recapitulating 어려움에 도전적인 노력이다. 이 세제 용해 필요성 및 테오 단백질의 방향 불일치에 기인한다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 우리는 통합 막 단백질의 가용성 도메인 그의 태그 융합 단백질로서 발현된다 전략을 채용 한 이러한 가용성 단편 지질에 NTA (니켈 2+) headgroups와의 상호 작용을 통해 지지체 리포솜에 고정되고 표면. 이러한 발판 사용 근위 지질 단백질 상호 작용은 지질 및 단백질 조성의 범위를 조사 할 수있다. 우리는 효과적으로 홍보를 조절하는 지질 상호 작용을 미토콘드리아 분열 복합체의 조립을 지배하는 중요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하고 검토하려면이 방법을 적용했습니다ocess 2. 미토콘드리아 분열 동안 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 3이라고하는 보존 막 리모델링 단백질은 에너지 항상성, 세포 사멸 신호, 및 기타 여러 가지를 조절 세포 신호에 응답하여 상기 외부 미토콘드리아 막 (OMM)의 표면에 채용되고 필수적인 미토콘드리아 처리합니다. 8 -이 큰, 세포질는 GTPase는 통합 OMM 단백질 (4)과의 상호 작용을 통해 미토콘드리아의 표면에 채용된다. 그러한 단백질의 역할 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)에 의한 시험 관내 Drp1와 겉보기 약한 상호 작용을 해명 어려웠다. 그럼에도 불구하고, 유전자 연구는 명확하게 MFF 성공 미토콘드리아 분열 7,8에 필수적임을 증명하고있다. 이 논문에 기재된 방법은 Drp1 MFF-상호 작용을 촉진 동시 지질 상호 작용을 도입함으로써 기존의 단점을 극복 할 수 있었다. 전반적으로,이 소설 분석 revea미토콘드리아 분열 복합체의 어셈블리를 안내 근본적인 상호 작용을지도하고 필수적인 분자 기계의 지속적인 구조 및 기능 연구에 새로운 단계를 제공했다. 지금까지 Drp1과 MFF 사이의 상호 작용의 검사가 MFF (9)의 고유의 유연성에 의해 복잡하게되었습니다 Drp1의 이질성은 2,10을 중합체 및 어려움 정화 및 손상되지 횡단 도메인 (11)와 함께 전체 길이 MFF를 재구성. 우리는 막 횡단 도메인 (MffΔTM-그의 6) 부족 그의-태그 MFF를 재구성 NTA 니켈 (Ni 2+) 비계 리포좀을 사용하여 이러한 문제를 해결. E의 과발현 때 MffΔTM 매우 수용성이기 때문에이 전략은 유리했다. 콜라이,이 절연 단백질 용이 골격 리포좀에 재구성 하였다. 이러한 지질 템플릿에 닿는 경우, MFF는 멤브레인의 표면 상에 동일한 외측으로 향하는 방향을 가정한다.이러한 장점 등 리핀 등 미토콘드리아 지질 이외에, 멤브레인 (11) MFF 폴딩 및 결합을 안정화 하였다. 카디오 리핀은이 무질서 지역을 안정시키고 분열 기계의 조립을 용이하게 할 수 Drp1 2,12의 가변 도메인과 상호 작용한다. 이 방법은 강력한 막 - 근위 단백질 상호 작용을 평가하고자 미래 연구에 널리 적용 할 수있다. 추가의 테 더링 / 친 화성 상호 작용을 사용하여,이 막 재구성 연구 정교한 세포 내 멤브레인의 표면에서 발견 된 추가 복잡도를 모방하도록 향상 될 수있다. 동시에, 지질 조성물을보다 정확하게 이러한 고분자 복합체의 기본 환경을 모방하도록 수정 될 수있다. 요약하면, 이러한 방법은 중요한 세포 PROC시에 막 모폴로지 형성에 상대적 기여도 단백질과 지질을 검사하는 방법을 제공한다esses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850375</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:287px;">DGS-NTA(Ni2+)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">840012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Chloroform</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">268320010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Liposome Extruder</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cu/Rh Negative Stain Grids</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:136px;">79712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microfuge Tube</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;">357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GTP</td>
			<td style="width:229px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">NU-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GMP-PCP</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M3509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microtiter Plate strips</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">469949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">40993-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Instant Blue Coomassie Dye</td>
			<td style="width:229px;">Expedeon</td>
			<td style="width:136px;">ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HEPES</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">BME</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KOH</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4-20% SDS-PAGE Gel</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">456-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4x Laemmli Loading Dye</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Malachite Green Carbinol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">229105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Laboratory Film</td>
			<td style="width:229px;">Parafilm</td>
			<td style="width:136px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:229px;">Polysciences</td>
			<td style="width:136px;">21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tecnai T12 100 keV Microscope</td>
			<td style="width:229px;">FEI</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Optima MAX</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">TLA-55 Rotor</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Refrigerated CentriVap Concentrator</td>
			<td style="width:229px;">Labconico</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td style="width:229px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">VersaMax Microplate reader</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

시험관 내에서 세포막 단백질 연구가 많이 소수성 막 횡단 도메인의 존재에 의해 복잡하게된다. 또한 이러한 연구를 복잡하게, 리포좀에 세제 - 가용화 된 막 단백질의 reincorporation 단백질 토폴로지를 적용하는 것은 불가능 확률 과정이다. 본 논문은 리포좀 기반의 발판을 이용하여 이러한 도전적인 기술에 대한 대체 방법을 제공합니다. 단백질의 용해성은 경막 도메인의 결실에 의해 강화되며, 이러한 아미노산 같은 그의 태그 같은 더링 잔기로 대체된다. 이것은 테더가 리포솜의 표면에 균일 한 단백질 토폴로지를 적용 (니트릴 로트리 아세트산 그의 태그 된 단백질 (NTA (니켈 2+))에 의해 조정 니켈 2+) 앵커링 그룹과 상호 작용한다. 필수 막 단백질 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)와 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 사이의 상호 작용이 INVE이었다 상기 예가 제시이 골격 리포솜 법을 이용 stigated. 이 작품에서 우리는 효율적으로는 GTPase 활동을 자극 리포좀의 표면에 용해 Drp1을 모집 MFF의 능력을 증명하고있다. 또한 Drp1 특정 지질의 존재 MFF 장식 지질 템플릿 관 모양 할 수 있었다. 이 예는 구조 및 기능 분석을 사용하여 골격 리포좀의 효과를 보여주고 Drp1 활성을 조절하는데 MFF의 역할을 강조한다.

MFF Drp1과의 상호 작용은 미토콘드리아 분열에 중요한 것으로 입증되었지만, 이러한 상호 작용은 시험 관내에서 요점을 되풀이하기 어려웠다. 우리의 목표는 더 나은 Drp1과 MFF 상호 작용에있어서, 상기 세포 환경을 에뮬레이션하는 것이 었습니다. 이를 위해 리포좀 NTA (니켈 2+) headgroups의 제한 농도를 함유하는 전술 한 바와 같이 지질 막을 재수 화하여 제조 하였다. 용액 (도 1a)의 불투명도에 의해 입증 지질 용액은 초기 이종 직경의 단일 층 및 다중 층 소포로 구성된다. 이 불투명도는 다중 층 소포의 유병률을 감소 동결 해동 (그림 1b)에 의해 감소된다. 리포솜 직경은 상기 투명 용액 (도 1C)을 초래 폴리 카보네이트 필터를 통해 압출하여 균질화한다. 2를 사용했을 때 막 배기관이 관찰되었다 것으로 나타났습니다. 이러한 연구 결과에 구축, 우리는 고분자 Drp1 - MFF의 주문 조립 막 변형을 유도 복잡 할을 촉진하기 위해 PC, PE, 니켈, 및 CL (라고 인리 치드 비계 리포좀 또는 ESL)로 구성된 새 템플릿을 이용했다. 이 애플리케이션 구체적 NTA (니켈 2+) 증가 리핀 지질은 (각각 10 몰 % 및 15 몰 %)을 사용 하였다. 그리고, GFP 또는 MFF는 Drp1 (도 2)의 존재 및 부재하에 ESL 템플릿 닿는하고, 멤브레인 개조 Drp1의 능력은 질적 평가 하였다. Drp1없는 경우, MFF도 GFP도는 (도 3a, b)와 유사하게 GFP 장식 ESL의 경우에만 특색 리포좀이 관찰되었다 (도 3C) 막 변형 결과. 그러나, DRP1이 MFF 장식 ESL 템플릿에 추가하고, 리포좀 리모델링 분명 (도 3d)이었다. 고분자 복합체 형성 명확 Drp1 MFF과의 상호 작용을 설명하지만, 정성 분석이 단독 이러한 상호 작용의 작용 효과를 결정하는 능력이있다. 따라서 MFF과의 상호 작용에 응답 Drp1의 촉매 활성의 변화를 평가하는 말라카이트 그린 포스페이트 생성 세이 18 활용. 이전이 설명 된 바와 같이, 우리는 초기 단순한 골격 리포솜 (SL을 3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2+), 96.7 몰 %의 DOPC)를 이용 단독 Drp1 구조와 기능에 MFF의 효과를 조사하기 위해. Drp1과의 비특이적 상호 작용 NTA (니켈 2+) SL을 처음 박사의 특이 활성의 자극을 피하기 위해 NTA (니켈 2+)의 낮은 농도를 포함하도록 설계되었다 있도록 미리 20 설명한P1. ESL의 NTA (니켈 2+)의 더 큰 양, 제어 그의-GFP 태그의 사용은 니켈 2+ 방패 Drp1 비특이적 상호 작용을 방지하는 것이 중요한 것으로 밝혀졌다. MFF 또는 GFP (도 2에 도시 된 바와 같이)에 의해 SL 리포좀 장식 후, 자기 조립의 정도는 GTPase Drp1의 활성을 측정함으로써 평가 될 수있다. 리포좀의 부재에서 Drp1 약간 SL의 첨가에 의해 향상되는 비교적 낮은 기저는 GTPase 활성을 갖는다. MFF 이러한 발판 리포좀의 장식 (도 4a, 1.8 배)는 GTPase 활동을 강화. 노출 NTA 니켈 (Ni 2+) headgroups이 그의 - 태그 GFP와 차단 된 경우 반대로,이 증강는 GTPase 활동이 절제되었다. 이는 최근의 연구에 도전 7,23 하였지만 또한, Fis1 미토콘드리아 분열 (21, 22)의 역할이 제안되었습니다 OMM 단백질의 역할을 시험 하였다. Fis1의 테 더링은 막 횡단 도메인이 결여SL에 또한 Drp1의는 GTPase 활동 (그림 4a)의 자극을 유도하는 데 실패했습니다. Drp1 및 MFF의 상호 작용이 미토콘드리아 지질의 역할을 결정하기 위해 우리는 다음 리핀 소량 (10 몰 %의 리핀이 DOPC 교체와 SL SL / CL)를 함유하는 약간 더 복잡한 지질 지지체를 이용했다. 이전 10 설명 된대로 카디오 리핀이 적당한 농도는 특별히 카디오 리핀에 의해 Drp1의 자극을 제한하기 위해 선택되었다. 마찬가지로 SL, SL로 Drp1 / CL 첨가 리포좀에 그의 태깅 Fis1 또는 GFP를 테 더링에 의해 역전되었다는 GTPase 활성의 약간의 자극의 결과. MFF 및 카디오 리핀 사이의 시너지 효과가 MFF 장식 SL / CL (도 4b)와 함께 배양했을 때 Drp1의는 GTPase 활동이 2.6 배를 자극되었을 때 관찰되었다. 막 유동성과 능력 오F Drp1는 지질 이중층은 그는 GTPase 활성을 향상시키기 위해 제안되었다 개조한다. 따라서, 우리는 유연한 골격 리포솜을 이용한 막 유동성 / 유연성의 영향을 조사하고자. 이것은 DOPE와 / CL SL에 DOPC 35 몰 %를 대체함으로써 달성되었다 (SL / PE / CL) 이전 Drp1 매개 막 10 개장을 허용하는 것으로 나타났다. Drp1에 장식되지 않은 SL / PE / CL의 발판 리포좀의 첨가는 약간 Drp1의는 GTPase 활동을 강화하고, GFP 이러한 리포좀의 장식이 효과를 제거합니다. SL / PE / CL 템플릿이 MFF 장식되었을 때, Drp1 활동 (도 4c, 2.4 배) 향상되었습니다. 우리가 이전에 보여준 바와 같이, 지질 세관에 리포좀을 개조하는 Drp1의 기능은 골격 리포좀에 PE의 첨가에 의해 향상되었습니다. 흥미롭게도, 나선형 Drp1 중합체의 형성으로 이어지는이 개선 된 배기관은 Drp1이 개조 할 수 없음을 리포좀에 비해 어떤 큰 자극을 초래하지 않았다 <suP&gt; 2. 이러한 적응 지질 템플릿을 사용하고 Drp1 MFF는 시험관 내에서보다 네이티브 환경에서 상호 작용하는 것으로 하였다. 이 기술은 (NTA를 통해 니켈 (Ni 2+) 농도) Drp1, MFF,이 거대 분자 복합체의 어셈블리를 조절하는 것처럼 특정 지질 (특히 카디오 리핀과 PE)의 상대적인 풍요를 제어 할 수있게되었습니다. 우리가 입증 된 바와 같이,이 방법은 전자 현미경에 의해 MFF-채용 Drp1의 막 리모델링을 시각화하고는 GTPase 활성 분석을 사용하여 촉매 활성에 Drp1 조립체의 효과를 결정하기 위해 이용 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54971/54971fig1.jpg" /> 그림 1 : 지질 준비 도식. (a)에 재 부유하면, 다양한 크기의 리포좀을 형성하고, 단일 층 및 multilamel 구성불투명 한 용액 (삽입) 결과 LAR 소포. (b) 동결 해동 여전히 직경 이질적 리포좀보다 단층 인구 용액 결과. 동결 해동 솔루션 (삽입)를 명확히. 지질 용액 (c) 압출 리포솜 직경 (이 예에서는 1.0 μm의) 균일화하고, 맑은 용액 (삽입)을 초래한다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54971/54971fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54971/54971fig2.jpg" /> 그림 2 : 방법은 단백질 어셈블리를 평가합니다. 비계 리포좀에 개략적으로 묘사 파트너 단백질 어셈블리 표시됩니다. 파트너 단백질 또는 GFP 그의-태그는 골격 리포좀으로 배양 한 다음 Drp1는 장식이나 장식되지 않은 사러으로 배양<html> SOMES. 이러한 Drp1-미리 조립 리포좀은 다음의 구조 방법 (전자 현미경) 및 기능 분석 (는 GTPase 분석)에 의해 분석 될 수있다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54971/54971fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54971/54971fig3.jpg" /> 그림 3 : Drp1 모집의 구조 평가. GFP 또는 MFF 부정적인 얼룩 송신 현미경 사진 (각각, C, D) (각각 A, B)을 단독으로 또는 리포좀 장식 Drp1 배양. 스케일 바 = 100 nm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54971/54971fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 71fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4 : 비계 리포좀 효소 분석. (A - C) 시간에 따른 포스페이트의 생성을 측정 (삽입) 및 K 고양이 결정 하였다. 이 방법은 SL 연결형 단백질 (A), SL / CL-닿는 단백질 (B) 또는 SL / PE가 / CL-닿는 단백질 (C)에인가 하였다. # : p &lt;0.05, * p &lt;0.0001, ** : 짝이 학생의 T 테스트에 의해 결정 p &lt;0.000001. 모든 오차 막대는 3 독립적 인 샘플에서 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54971/54971fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

8.7K 조회수.  Case Western Reserve University School of Medicine. This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment. 

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the importance of 3-dimensional (3D) cellular assemblies in these fields. Artificial scaffolds have often been used to construct 3D cellular assemblies. However, the scaffolds used to construct cellular assemblies are sometimes toxic and may change the properties of the cells. Thus, it would be beneficial to establish a non-toxic method for facilitating cell-cell contact. In this paper, we introduce a novel method for constructing stable cellular assemblies by using optical tweezers with dextran. One of the advantages of this method is that it establishes stable cell-to-cell contact within a few minutes. This new method allows the construction of 3D cellular assemblies in a natural hydrophilic polymer and is expected to be useful for constructing next-generation 3D single-cell assemblies in the fields of regenerative medicine and tissue engineering.

We demonstrate a novel method for constructing a single-cell-based 3-dimensional (3D) assembly without an artificial scaffold.

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...