우리는 많은 통찰력이 토론 및 편집, 그림, 원고의 중요 한 독서에 대 한 안 젤리 크 넬슨과 앤드류 mEGFP 태그 Lamin B1 셀 라인을 생성 하기 위한 터 커에 대 한 타오 할 유전자에 대 한 조언을 위해 다프네 Dambournet 감사 합니다. 유전자 편집 및 품질 관리 과정에 그들의 공헌에 대 한 세포 과학에 대 한 줄기 세포와 유전자 편집 및 알 렌 연구소에서 분석 결과 개발 팀을 인정 하 길. 우리가 만드는 우리의 유전자 편집 셀 라인 데 911 무역 라인 스톤 학회와 UCSF에서 브루스 R. 컨 클린이 실험실에 의해 제공 되었다. 우리 알 렌 연구소 세포 과학 설립자, 폴 G. 알 렌, 그의 비전, 격려, 감사 하 고 지원 합니다.

<ol>
	<li>Wood, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+across+species+using+ZFNs+and+TALENs.">Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs.</a> Science. 333 (6040), 307 (2011).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+endogenous+loci+for+live-cell+fluorescence+imaging+and+molecule+counting+using+ZFNs,+TALENs,+and+Cas9.">Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9.</a> Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).</li><li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Sci Rep. 5, 9592 (2015).</li><li>Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Approaches,+Pitfalls,+and+Solutions.">Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Doyon, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells.">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li><li>Cho, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+fluorescently+labeled,+endogenous+RNA+Polymerase+II+in+living+cells+with+CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing.">Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> Sci Rep. 6, 35949 (2016).</li><li>White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+nanoBRET+and+CRISPR/Cas9+to+monitor+proximity+to+a+genome-edited+protein+in+real-time.">Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time.</a> Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).</li><li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+gene+tagging+using+CRISPR/Cas9+in+human+stem+cells+to+illuminate+cell+organization.">Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization.</a> Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Young, J. E., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+a+dish:+promises+and+challenges+of+human+stem+cell+models.">Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models.</a> Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).</li><li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives:+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper.">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Allen Cell Explorer. , (2017).</li><li>Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Purified+CasRNPs+for+Efficacious+Genome+Editing.">Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing.</a> Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , (2017).</li><li>Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+genome+editing:+prospects+and+challenges.">Therapeutic genome editing: prospects and challenges.</a> Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).</li><li>Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+genome+editing+with+engineered+nucleases.">Therapeutic genome editing with engineered nucleases.</a> Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Orlando, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc-finger+nuclease-driven+targeted+integration+into+mammalian+genomes+using+donors+with+limited+chromosomal+homology.">Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology.</a> Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).</li><li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein.">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. 121-122, 9-15 (2017).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766 (2014).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP:+a+CRISPR/Cas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing.">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CRISPOR V4.3. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+non-canonical+PAMs+for+CRISPR/Cas9-mediated+DNA+cleavage+in+human+cells.">Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells.</a> Sci Rep. 4, 5405 (2014).</li><li>Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+protein+linkers:+property,+design+and+functionality.">Fusion protein linkers: property, design and functionality.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).</li><li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins.">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection.">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li><li>Baker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Genetic+Mosaicism+in+Cultures+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

HiPSCs에 형광 성 단백질 융해 규제 endogenously 생성에 대 한 여기에 제시 된 방법은 응용 프로그램 라이브 셀 이미징에서 다양 한 기능성 연구에 이르기까지 유전자 편집 셀 라인을 생성 하기 위한 다양 하 고 강력한 접근 및 " 접시에 질병"모델 환자 파생 hiPSC 라인13,,1415를 사용 하 여. 소개 큰 FP 태그에는 N-또는 C-말단 생 단백질의이 메서드를 사용 하는 동안 잠재적으로 사용 될 수 모델 또는 정확한 질병 유발 돌연변이22,23 다른 태그 또는 작은 유전자 변화를 소개 하 . 작은 삽입, 상 동 팔의 크기를 줄일 수 있습니다, 하지만이 방법에 제시 편집에 일반적인 접근24,25적용 수 있습니다. HiPSCs의 사용은 주의 최적화, 그들의 광대 한 유틸리티에 대 한 것이 좋습니다 다른 포유류 세포 라인의 유전자를 편집 하려면이 프로토콜을 적응 수 있습니다.
식별 FP 태그에 대 한 관심사의 유전자 사본 풍부 (microarray 또는 RNA-Seq 데이터)에서 추정은 좋은 출발점 사본 레벨을 항상 연관 하지 않습니다 비록 유전자 또는 isoform 관심의 표현 여부를 평가 하기 위한 단백질 수준입니다. 여기에 설명 된 FACS 농축 전략 관심의 셀 유형을 적어도 온건 하 게 잘 표현 된 유전자에 대 한 최고의 작동 합니다. 이 전략은 신호 대 배경 비는 매우 낮은12,19centrin, desmoplakin, paxillin 등 punctate 및/또는 개별 지역화 패턴을 보여 주는 융해에 대 한 선택에 성공 했다. 유전자는 매우 표현 되지 않는다 또는 파생 셀 형식에만 표시 됩니다 추가 선택 전략 필요할 수 있습니다.
디자인에 대 한 기증자와 crRNA 템플릿 플라스 미드 인간의 세포 라인에 사용 시작 지점 인간의 참조 게놈 (GRCh38) 이어야 한다. 다른 세포의 유전자는 같은 종 내에서 다를 수 있기 때문에 CRISPR/Cas9는 시퀀스 관련 때문에, 그것은 매우 도움이 셀 라인 전용 변종 (단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 또는 삽입/삭제 (indels))를 식별 하 그는 디자인에 이러한 통합 참조 게놈에서 다. 이렇게 하면 crRNAs 호스트 게놈와 호환 된다는 것 그리고 기증자 템플릿 플라스 미드 homology 팔 어떤 셀 라인의 특정 이체를 유지 합니다. 제안된 전략 디자인 과정에서 homozygous 이체 crRNAs 및 기증자 템플릿 플라스 미드 homology 팔으로 통합 하는 것입니다. Heterozygous 이체를 통합 하는 것은 선택적입니다. 특정 시 약 큰 노크에서 실험을 위해 사용 하 고이 프로토콜에 대 한 다른 주요 고려 사항은 아래에서 토론 된다.
Cas9 단백질
Cas9 단백질을 사용 하 여의 주요 장점은 소개 하는 Cas9와 gRNA는 RNP 복잡 한으로 플라스 미드-기반 접근 Cas9와 gRNA의 식 수 일 동안 계속 하 고 리드에 비해 nuclease 활동의 제한 된 기간에 결과 표시 되었습니다. 큰에-및 오프-대상 활동26,의27. Cas9 단백질을 사용 하 여의 또 다른 이점은 그것 쉽게 셀 안에 한 번 쪼개 다 수입니다. 이 전사, 번역 및 처리26,28단백질을 필요로 하는 Cas9 mRNA 또는 Cas9/gRNA 플라스 미드를 사용 하 여 더 많은 기존의 방법과 대조 됩니다. Wildtype S. pyogenes Cas9 단백질은 지금 많은 상업적인 근원에서 있다.
가이드 RNA
또는 몇 가지 예측된에서-대상 호스트 게놈29,30,,3132에 있는 원하는 FP 삽입 사이트 근처 crRNA 목표를 찾아내기를 위한 많은 공개적으로 사용 가능한 도구가 있다. HDR에 HDR 결과의 정밀도 효율성 주어진된 로커 스12에서 사용 하는 crRNA 목표 사이 넓게 변화 한다. 이러한 이유로, 몇몇 crRNAs 테스트 (2-4와 선호 50 내 원하는 삽입 사이트의 bp) 로커 스 당 것이 좋습니다이 성공적인 편집 실험의 확률을 증가 시킬 수 있습니다. 합성 2 부분 crRNA 및 tracrRNA, 합성 한 gRNAs (sgRNAs) 생체 외에서 gRNA를 제공 하기 위한 현재 가능성 포함 복사할 sgRNAs, 또는 U6 발기인에서 sgRNA을 표현 하는 세포는 플라스 미드를 제공. 이 프로토콜은 높은 분열 활동 하지 적합 합니다. 수정 되지 않은 2 부분 crRNA와 tracrRNA ( 재료의 표참조) 셀에 최소한 잠재적인 섭 동을 일으키는 동안 모노 유전자 f P 태그 세포 생성의 목표와 함께 사용 되었다.
기증자 템플릿 플라스 미드
기증자에서 템플릿 플라스 미드에 통합 됩니다 호스트 게놈 HDR 이벤트 기간 동안 제공 되는 상 동 중 일부 시퀀스 팔, 때문에 점 돌연변이 crRNA 인식 사이트에 HDR 다음과 같은 Cas9에 의해 분열을 더 방지 하기 위하여 소개 되어야 한다. 종종 간단한 파괴적인 변화 팸 시퀀스를 변경할 것입니다. 일부 비 정식 팸 시퀀스는 여전히 야생 타입 S. pyogenes Cas9에 의해 인식 될 수 있다, 왜냐하면 NGG, 자성 또는 나라33를 사용 하지 않도록 최상 이다. 상 동 팔 돌연변이, 동의어 비 돌연변이 희귀 codons의 소개 하지 않도록 합니다. PAM 시퀀스에 동의어 변경 불가능, 씨앗 지역에 3 개의 동의어 포인트 돌연변이 만드는 것이 좋습니다 (10 bp 팸 하 근) crRNA 바인딩 사이트의. 주의 이러한 변경 시 (UTR) 5ʹ 번역 되지 않은 지역에이 지역의 중요 한 규제 시퀀스를 포함할 수 있기 때문에 취해야 한다. 으로 비 보존 기초 변경 높은 보존된 기초17변경 보다 더 용납 수 있습니다 UCSC 게놈 브라우저의 비교 유전체학 트랙 이러한 경우에 지침을 제공할 수 있습니다와 같은 유전자 보존 데이터베이스 컨설팅. 때로는 FP 시퀀스의 단순한 삽입은 ( 그림 1);에서 crRNA 바인딩 사이트를 방해 하기에 충분 한 그러나, 새로 추가 된 시퀀스 crRNA 바인딩 및 팸 시퀀스의 지 속성에 대 한 확인 되어야 한다.
FP와 네이티브 단백질 아미노산 링커는34의 융합 단백질 기능을 보존 하기 위해 권장 됩니다. 종종 아미노산 링커는 특정 요금 또는 크기에 대 한 선택할 수 있습니다. 경우는 cDNA 퓨전 디자인 타겟 비슷한 생 융해 단백질 되었습니다 잘 공부 하고있다, 같은 링커 순서 CRISPR/Cas9 노크 실험12,19에 사용할 수 있습니다. 이러한 정보를 사용할 수 없는 경우 GTSGGS 등 짧은 링커 되었습니다12성공적으로 사용. 다른 연구 대상35의 다양 한 일반적인 작은 3-아미노 산 성 링커 순서와 성공을 설명 했다.
Transfection 및 FACS 농축
많은 상용 transfection 시 약 electroporation 시스템 크기, 비용, 및 구성의 다양 한 시 약을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다 반면 세포, 분자의 특정 종류의 배달에 대 한 공식화 된다. HiPSCs 같은 하드 transfect 세포에 대 한 일반적인 transfection 방법 이외에, electroporation 또한이 방법에 설명 된 대로 CRISPR/Cas9-중재 FP 노크에 대 한 모든 세 가지 구성 요소를 제공 하는 혜택을 운반 합니다. 다른 상용 시 약이이 방법 (데이터 표시 되지 않음), 개발 하 고도 사용 하 고 다른 사람에 의해 RNP 배달26,28,36 때에 비교 될 때 최상의 결과 생산 하기 위해 Electroporation 발견 .
HiPSCs를 편집 하기 위해이 프로토콜을 사용할 때 특별 한 주의 전후에 최적의 세포 생존 및 최소한의 자발적인 차별화에 대 한 프로세스를 편집 하는 유전자는 세포의 부드러운 처리 되도록 취해야 한다. 특히, FACS 농축 방법 가능한 가장 큰 노즐 (130 µ m), 낮은 유량 (≤24 µ L/min), 방부 제-무료 칼 집 액체를 사용 하 여 줄기 세포를 정렬에 대 한 적응 해야 (염 분, 같은 재료의 표참조), 그리고 낮은 샘플 (10 psi) 압력입니다. 줄기 세포에 차선 생존 귀착되는 단일 셀 정렬, FACS 농축 hiPSCs 대량에서 정렬 하 고 셀 생존 및 줄기 세포 무결성을 최적화 하는 인구로 확장. 그러나, 단일 셀 정렬 덜 민감한 세포 유형에 대 한 적절 한 있을 수 있습니다. 세포 생존 촉진, 세포 FACS 농축에 대 한 수확 후에 1 시간 보다 더 이상 문화에 반환 하 고 정렬 과정을 통해 실 온에서 보관. 일부 세포 유형에 대 한 세포 생존 또한 잠복기 셀 정렬 과정 전반에 걸쳐 얼음 (4 ° C)에 의해 향상 될 수 있습니다.
FP-긍정적인 세포의 대량 확장 클론 라인을 생성 하기 전에 융해 단백질 지 방화에 대 한 이미징 분석 하 여 인구를 평가 하는 기회를 제공 한다. 셀의 결과 풍부한 인구 수도 있지만 일부 연구에 대 한 충분 한,이 인구는 자주 다양 한 강도의 FP 신호를 표시 합니다. 격리 된 클론 라인 단일 신호 (그림 3) 기능 실험12에 대 한 더 적절 한 그들을 만드는 있다.
클론 셀 라인 생성
편집 및 클론 선 생성 프로세스에 걸쳐 세포 형태학을 모니터링 하는 데 중요 하다. 부드러운 가장자리와도, 잘 포장 센터12,,1819hiPSC 식민지 급지대 무료 조건에서 재배 전시 한다. 차별화 된 세포는 문화의 5% 미만에서 관찰 해야. 개별 식민지 때, 그는 전시 좋은 형태를 선택 합니다. 이벤트를 뿌리고 96 잘 접시 중 형태에 대 한 복제를 확인 하 고이 분화로 이어질 수 있습니다 또는 유전자 불안정성의 표시로 자란가 그를 중단할.
클론 세포의 정확한 편집의 유전자 확인에 대 한 허용 Cas9 유도 이중 가닥 게놈에서 휴식 하기 때문에 중요 하다는 종종 수리 부정확 하 게 원하는 장소에 태그의 설립에도 불구 하 고. 앞에서 설명한 PCR 기반 분석 실험 보여주었다 누적 10 독특한 게놈 loci에 걸쳐 많은 (45%) FP 표현 클론의 게놈12기증자 플라스 미드 백본 통합 대상된 현장에서 또는 무작위로 (거의)에서 고통. 또한, GFP-긍정적인의 23%를 복제 (n = 177) 10 독특한 loci에 걸쳐 돌연변이에서 또는 태그 없는 대립 유전자, 대부분 NHEJ12때문에 예상된 crRNA 절단 사이트 근처 항구를 발견 했다. 많은 클론 라인 (~ 100 클론/편집)의이 유전자 분석 불가능 한 세포 인구에서 FP 표현과 예상된 퓨전 단백질 지 방화 혼자 보장 하지 않습니다 정확한 편집12 이후 유전 유효성 검사의 중요성 강조 . 또한, 이러한 PCR 기반 분석 클론 선 세대 전에 의미 있는 분석을 완료할 수 있습니다에 대 한 필요성을 보증 하는 어떤 확신을가지고 셀의 인구 농축된에 수행할 수 없습니다. 삽입 된 FP 태그의 유전자 확인 및 검증 (모노 유전자 편집된 클론)에서 편집 되지 않은 대립 유전자의 유전 무결성의 둘 다 정확한 편집 태그 식 넘어 대상된 현장에서 확인 하는 데 필요한 있습니다.
Bi-유전자 편집의 낮은 속도 (Sanger와 exome 시퀀싱 분석)으로 대상에서 돌연변이의 부족이 방법 (되지 않은 데이터)12를 사용 하 여 날짜를 관찰 되었습니다. 이것은 CRISPR/Cas9 실험26,27에 대 한 짧은 지속 RNP의 사용을 설명 하는 이전 연구 결과와 일치. Bi-유전자 수정 클론 셀 라인의 부족 특정 장소에는 영향을 수도 있습니다 또는 두 용납 하는 셀의 무 능력 때문 태그 제안 이전에 게시 실험에서 필수적인 단백질의 복사본 상 상속 유전자 양방향 편집된 셀 했다 또 다른 (TUBA1B)12만 한 로커 스 (LMNB1)에 대 한 관찰. 완벽 하 게 검증 된 Bi 유전자 클론 셀 라인 mEGFP19이 방법 태그 ST6 베타-galactoside 알파-2, 6-1 sialyltransferase (ST6GAL1), 및 RAB5A 구성원 RAS oncogene 가족 (RAB5A)를 사용 하 여 생성 된.
게놈에서 편집의 정밀도 확인, 넘어 더 클론 라인의 특성 충족 모든 줄기 세포, 게놈, 클론을 식별 하는 데 사용할 수 있는 품질 관리 분석 실험의 다양 한 있다 그리고 세포 생물학 기준 연구 미래에 사용 . 세포 생물학과 기능 분석 실험 지역화, 적절 한 표현과 융합 단백질12의 기능 확인을 사용할 수 있습니다. 편집 되지 않은 자녀를 비교 현지화, 역학, 및 기능에는 편집 과정의 영향을 평가 하는 데 도움이 됩니다. 다른 분석 실험과 같은 성장 분석 및 게놈 안정성에 대 한 테스트 또한 도울 수 있다 태그 단백질 셀 perturbing 인지 확인 합니다. 이 프로토콜에서 hiPSC를 사용 하 여, pluripotency 마커 및 감 별 법 잠재력의 평가 다운스트림에 대 한 귀중 한은 복제 연구12결정에 중요 한 될 수 있습니다. 문화를 확장 하기 때문에 hiPSC는 성장 율 모니터링 유전 불안정성으로 이어질 보였다 고 클론 셀 라인의 karyotype는 또한 중요 한12,37. 그러나, 마지막 것 편집된 된 셀의 사용 수준 및 품질 관리 분석의 폭 궁극적으로 결정 하 고 응용 프로그램에 따라 달라 집니다.

게놈 편집 전략, 특히 CRISPR/Cas9, 세포질 과정을 공부 하는 사용 되 고 점점 접근 가능 하 고 귀중 한1,2,3,,45, 6 , 7. CRISPR/Cas9의 많은 응용 프로그램 중 하나는 유전자 또는 단백질 제품8의 활동에 대 한 기자 역할을 다음 특정 게놈 loci GFP 등 대형 세 시퀀스의 (감독 homology 수리 (HDR))를 통해 소개 . 이 기술은 결과 endogenously 규제 융해 단백질 subcellular 지 방화 및5 관심사의 단백질의 역학 관계를 시각화 하기 위해 사용 될 수 있는 생 열려있는 독서 프레임 형광 단백질 시퀀스에 참여를 사용할 수 있습니다. ,,69,,1011. Endogenously 태그 단백질 overexpression 시스템에 비해 많은 혜택을 제공, 큰 시퀀스 인간 게놈으로 삽입은 일반적으로 요구 하는 선택 또는 농축 할 수 있는 세포의 인구를 전략 하는 비효율적인 프로세스 수 쉽게 공부5,12.
이 프로토콜 원하는 genomic 소재 시에 형광 성 단백질 (FP) 인코딩 DNA 순서의 삽입을 설명 합니다. 프로토콜 설계 및 기증자 템플릿 플라스 미드 및 ribonucleoprotein (RNP) 복잡 한 (야생 타입 S. pyogenes Cas9 단백질 합성 CRISPR RNA (crRNA)와 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA)와 함께) 전달 포함 됩니다. 또한 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)와 클론 셀 라인 생성 프로세스를 통해 상 편집 된 셀의 농축이입니다. 날짜 하려면,이 메서드 hiPSC 라인 monoallelic 또는 25 단백질 주요 세포질 구조를 나타내는 라벨 (거의) bi 유전자 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 노력에서 결과 편집된 셀으로 예상된 유전자 삽입을가지고, 제대로 로컬라이제이션 융해 단백질 pluripotency 및 안정적인 karyotype12 (및 되지 않은 데이터) 확인 되었습니다 했다. 이 방법은 또한 여러 다른 생성 하 사용 된 단일 및 듀얼 (2 개의 다른 단백질 같은 셀 태그) 편집 hiPSCs (되지 않은 데이터)의 인구.
많은 기존의 셀 라인와 달리 그들은 2 중, karyotypically 안정, 비 변형, 증식 하기 때문에 건강 한 기증자에 게 서 파생 된 인간의 Ipsc 이러한 게놈 편집 노력에 대 한 선정 됐다. 이러한 속성은 근본적인 세포 생물학 및 질병 모델링을 공부에 대 한 매력적인 모델을 제공 합니다. 또한, hiPSCs의 감 별 법 잠재력 다양 한 계보와 세포 유형 organoids, 조직 및 "접시에 질병" 모델13 포함 하 여 isogenic 셀을 사용 하 여 동시에 여러 발달 단계를 공부 하는 기회 제공 ,,1415. 이 프로토콜은 hiPSCs (911 무역 선)를 위해 개발 되었다, 그러나 그것 수 있습니다 다른 포유류 세포 선을 사용 하 여 프로토콜의 개발에 대 한 유익.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1169px;" width="1169">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Geneious R9</td>
			<td style="width:231px;">Biomatters, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">bioinformatics software for in silico donor plasmid design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">TE Buffer pH 8.0</td>
			<td style="width:231px;">IDT, or similar</td>
			<td style="width:119px;">11-01-02-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:305px;">HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific, or similar</td>
			<td style="width:119px;">51030408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Pipettes (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L, 10 &#181;L, 2 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Pipette tips (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Multi-channel Pipette (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td>
			<td style="width:231px;">Costar, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td>
			<td style="width:231px;">Millipore Sigma, or similar</td>
			<td style="width:119px;">BR704526-1EA</td>
			<td style="width:515px;">use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher, or similar</td>
			<td style="width:119px;">3501-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">XP2 Pipette Controller</td>
			<td style="width:231px;">Drummond, or similar</td>
			<td style="width:119px;">4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:231px;">VWR, or similar</td>
			<td style="width:119px;">53300-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:231px;">CELLGARD, or similar</td>
			<td style="width:119px;">NU-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:231px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:515px;">lot tested before use with hiPSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12 (-phenol red)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11039-021</td>
			<td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mTeSR1 Complete Media</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85850</td>
			<td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">WTC hiPSC line</td>
			<td style="width:231px;">Coriell</td>
			<td style="width:119px;">GM25256</td>
			<td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture dish 100 mm</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">6-well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">15 mL polystyrene conical</td>
			<td style="width:231px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">72308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">U-002005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 &#181;M</td>
			<td style="width:231px;">University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td>
			<td style="width:231px;">Genewiz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:231px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td style="width:231px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740424.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfetion System</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfection System, 100 &#181;L kit</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSAriaIII Fusion</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSDiva software</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FlowJo version 10.2</td>
			<td style="width:231px;">TreeStar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NERL Blood Bank Saline</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8504</td>
			<td>used as preservative-free FACS Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td>
			<td style="width:231px;">Olympus, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">351180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">CryoStor CS10</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2874-100ML</td>
			<td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Parafilm</td>
			<td style="width:231px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">24 well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

프로토콜은 프레임 N 또는 C 터미널 형광 태그를 융합 하는 익스프레스 생 단백질 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)을 생성 하는 데 제공 됩니다. 간결한 CRISPR/Cas9 시스템 (클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 9) 감독 homology 수리 (HDR)를 통해 게놈 loci 큰 exogenous 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 원하는 노크에 달성,이 프로토콜 사용 하 여 ribonucleoprotein (RNP)-기반 접근 야생 타입 연쇄 상 구 균 pyogenes Cas9 단백질, 합성 2 부 가이드 RNA (gRNA), 및 기증자 템플릿 플라스 미드를 통해 세포에 전달 됩니다 electroporation입니다. 붙일 태그가 단백질을 표현 하기 편집된 셀 정렬 (FACS) 형광 활성화 된 세포에 의해 농축 됩니다. 클론 라인 다음 생성 하 고 정확한 편집 결과 대 한 분석 될 수 있다. 관심사의 유전자의 genomic 소재 시에 형광 태그를 도입 하 여 결과 subcellular 지 방화 및 융해 단백질의 역학 공부 될 수 있다 통제 생 규정, 재래식 overexpression에 핵심 개선 시스템입니다. 유전자 태그를 위한 모델 시스템으로 hiPSCs의 사용 2 중, nontransformed 셀에 태그 단백질을 공부 하는 기회를 제공 합니다. 때문에 hiPSCs는 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다,이 이렇게 생성 하 고 다양 한 isogenic 셀룰러 컨텍스트 태그 단백질 연구 기회를 제공 한다.

이 실험의 목표 LMNB1 유전자 (단백질의 N-말단)의 5ʹ 끝을 mEGFP 시퀀스를 도입 하 여 핵 lamin B1 단백질 mEGFP (단위체 향상 된 GFP)를 융합 했다. 마이클 데이비슨 형광 단백질 컬렉션21에서 링커 (아미노산 시퀀스 SGLRSRAQAS)을 이전 cDNA 구문에 따라 선택 되었다. CrRNA 바인딩 지역 각 후보 crRNA에 대 한 기증자 템플릿 플라스 미드에는 mEGFP 및 링커 시퀀스의 실리콘에 삽입 후 중단 되었다, 때문에 아무 지점 돌연변이 잠재적인 crRNA 인식 및 분열에 의해 방해를 만들 필요가 기증자 시퀀스 (그림 1)의 Cas9. 기증자 시퀀스 1 kb homology 팔 mEGFP 링커 시퀀스의 양쪽 측면을 포함. 결과 2,734 bp DNA의 pUC57 등뼈에 복제 했다 시퀀스 확인 하 고 결과 기증자 템플릿 플라스 미드도 없는 맥시 준비를 사용 하 여 순화 되었다. 기증자 템플릿 플라스 미드 및 복잡 한 RNP 페 했다, 상 편집된 셀 풍성 하 게 했다와 mEGFP 핵 lamin B1 융해 단백질의 지 방화는 형광 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 확인 되었다. 비록 두 crRNA 시퀀스 생성 하기 편집된 인구12만 crRNA1 transfection 결과 여기, 설명 합니다.
0.95 %mEGFP-긍정적인 세포 상 편집 대표 셀에 포함 된 페 LMNB1 crRNA1 gRNA, Cas9 단백질, 또는 기증자 템플릿 플라스 미드 electroporation 반응 (버퍼만)에 포함 된, 부정적인 컨트롤에 비해 mEGFP-핵 lamin B1 인구 (그림 3a). 이 결과 효율성 노크에서 이전에 보고 된12이 메서드를 사용 하 여 많은 게놈 loci 관측의 범위 안에 이었다.
MEGFP-긍정적인 세포 FACS에 의해 분리 되었고 라이브 현미경 핵 봉투에 mEGFP 핵 lamin B1 융해 단백질의 예상된 지역화를 확인 하 여 몇 군데. FACS 농축 후 LMNB1 crRNA1 인구에서 정렬된 셀의 약 90% (로 현미경 검사 법에 의해 결정), mEGFP-긍정적인 일부 mEGFP 부정적인 셀 정렬 절차 동안 GFP-긍정적인 세포와 공동 정화를 제안 했다. 이것은 성공적인 편집을 위한 유전자 검사 다음 수 96 클론의 수확에 대 한 허용 농축의 수락 가능한 수준 이었다. 일반적으로, 성공적인 농축 컷오프 50%는 GFP 긍정.
정렬된 셀 인구의 nondividing 세포에 있는 핵 봉투 (핵 주변)에 형광을 표시 하 고 유사 분열 제공 자신감 올바른 게놈 중 세포질 내에서 확장된 핵 lamina에는 LMNB1에서 편집 로커 스입니다. 밝은 또는 희미 한 신호를 포함 하는 풍부한 인구 셀. 신호 강도이 차이 정확 하 고 잘못 된 결과 및 추가 대 한 유전자 검증된 클론 라인 생성 유틸리티 (토론 참조) 연구 하이라이트 편집의 조합을 반영 될 수 있습니다 (그림 3b)12. 클론 라인 생성 후 유전자 세포 현미경 실험 (그림 3c)에서 균일 한 GFP 강도 보여준 검증.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> 그림 1 . LMNB1 유전자의 N-말단 GFP 태그에 대 한 전략을 디자인. GFP 태그 염색체 5에 있는 LMNB1의 첫 번째 엑손의 N 맨끝 삽입 5ʹ 위해 설계 되었습니다. 5ʹ와 3ʹ 모두 homology 무기는 1 kb와 시작 codon (ATG)와 두 번째 코 돈 (상 동 팔만 부분적으로 그림에 표시). 두 후보 crRNAs Cas9 하면서 독특한 게놈에서 가능한 의도 삽입 사이트 가까이로 쪼개를 안내 하도록 설계 되었습니다. MEGFP 및 아미노산 링커 순서 시작 codon (하지를 mEGFP 및 링커 순서)의 단지 3ʹ를 삽입된 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> 그림 2 . Endogenously 생산에 대 한 워크플로 태그 hiPSC 클론 라인. Transfection 구성 요소, 포함 (골드 crRNA와 보라색 tracrRNA 붉은 Cas9 단백질 표시), Cas9/crRNA/tracrRNA RNP 복잡 한 상 동 팔 (가, 금에 표시), 포함 된 기증자 템플릿 플라스 미드 및 FP + 링커 순서 (에 표시 된 녹색), 했다 electroporated입니다. 4 일 후, FP 양성 상 편집 셀 FACS에 의해 농축 (~ 1000 셀), 96-잘 접시의 단일 잘으로 정렬 된 셀의 모든 시드를 모집단으로 확장 그리고 문화에 몇 백만의 노동 인구까지 확장 세포 "풍부한 인구"로 분석 될 수 (프로토콜 단계 3.8 참조). FP-긍정적인 세포의 수익률 차이가 HDR12;의 가변 속도로 인해 실험 성공적인 농축 수 있습니다 일반적으로 300 ~ 5000 포함6 엉덩이 세포 transfection 약 1.6 x 10의 후 세포. 예비 이미징 연구 확인 신호 및 풍부한 인구에 융해 단백질의 지 방화. 식민지는 확장 및 cryopreservation 96 잘 접시에 수동으로 선택 했다. 게놈 품질 관리 심사를 더 물방울 디지털을 사용 하 여 PCR (ddPCR) 및 다른 PCR 기반 분석 실험은 다음 식별 하는 데 제대로 편집된 클론, 앞에서 설명한12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> 그림 3 . 상 편집된 셀 인구의 농축. (A) 는 LMNB1의 흐름 cytometry 플롯 편집 셀 4 일 후 transfection. Y GFP 강도 표시 하 고 x 축 앞으로 분산형 표시 됩니다. 정렬 게이츠 버퍼 전용 제어 기반으로 설정 했다. HiPSCs 섭 동에 민감한 때문에, 생략 되었다 라이브/죽은 얼룩 그리고 매우 보수적인 FSC/SSC 게이트 대신 사용 되었다. 농축 한 후 (B) , LMNB1 Cr1의 인구 편집 셀 셀 GFP 핵 봉투 (예상된 LMNB1 지역화) 지역화의 ~ 90%를 보였다. 인구는 몇몇 GFP 부정적인 세포 뿐 아니라 다양 한 GFP 강도의 셀 포함. 스케일 바는 10 미크론. (C) 클론 라인 생성 후 셀 일부 세포 주기 의존 차이와 유니폼 GFP 강도를 보였다. 눈금 막대 20 미크론 이다입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

endogenous-protein-tagging-human-induced-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Genetics

26.0K 조회수.  Allen Institute for Cell Science. 여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

비디오: Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

연구

유전학

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...