우리는 많은 통찰력이 토론 및 편집, 그림, 원고의 중요 한 독서에 대 한 안 젤리 크 넬슨과 앤드류 mEGFP 태그 Lamin B1 셀 라인을 생성 하기 위한 터 커에 대 한 타오 할 유전자에 대 한 조언을 위해 다프네 Dambournet 감사 합니다. 유전자 편집 및 품질 관리 과정에 그들의 공헌에 대 한 세포 과학에 대 한 줄기 세포와 유전자 편집 및 알 렌 연구소에서 분석 결과 개발 팀을 인정 하 길. 우리가 만드는 우리의 유전자 편집 셀 라인 데 911 무역 라인 스톤 학회와 UCSF에서 브루스 R. 컨 클린이 실험실에 의해 제공 되었다. 우리 알 렌 연구소 세포 과학 설립자, 폴 G. 알 렌, 그의 비전, 격려, 감사 하 고 지원 합니다.

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저자는 공개 없다.

HiPSCs에 형광 성 단백질 융해 규제 endogenously 생성에 대 한 여기에 제시 된 방법은 응용 프로그램 라이브 셀 이미징에서 다양 한 기능성 연구에 이르기까지 유전자 편집 셀 라인을 생성 하기 위한 다양 하 고 강력한 접근 및 " 접시에 질병"모델 환자 파생 hiPSC 라인13,,1415를 사용 하 여. 소개 큰 FP 태그에는 N-또는 C-말단 생 단백질의이 메서드를 사용 하는 동안 잠재적으로 사용 될 수 모델 또는 정확한 질병 유발 돌연변이22,23 다른 태그 또는 작은 유전자 변화를 소개 하 . 작은 삽입, 상 동 팔의 크기를 줄일 수 있습니다, 하지만이 방법에 제시 편집에 일반적인 접근24,25적용 수 있습니다. HiPSCs의 사용은 주의 최적화, 그들의 광대 한 유틸리티에 대 한 것이 좋습니다 다른 포유류 세포 라인의 유전자를 편집 하려면이 프로토콜을 적응 수 있습니다.
식별 FP 태그에 대 한 관심사의 유전자 사본 풍부 (microarray 또는 RNA-Seq 데이터)에서 추정은 좋은 출발점 사본 레벨을 항상 연관 하지 않습니다 비록 유전자 또는 isoform 관심의 표현 여부를 평가 하기 위한 단백질 수준입니다. 여기에 설명 된 FACS 농축 전략 관심의 셀 유형을 적어도 온건 하 게 잘 표현 된 유전자에 대 한 최고의 작동 합니다. 이 전략은 신호 대 배경 비는 매우 낮은12,19centrin, desmoplakin, paxillin 등 punctate 및/또는 개별 지역화 패턴을 보여 주는 융해에 대 한 선택에 성공 했다. 유전자는 매우 표현 되지 않는다 또는 파생 셀 형식에만 표시 됩니다 추가 선택 전략 필요할 수 있습니다.
디자인에 대 한 기증자와 crRNA 템플릿 플라스 미드 인간의 세포 라인에 사용 시작 지점 인간의 참조 게놈 (GRCh38) 이어야 한다. 다른 세포의 유전자는 같은 종 내에서 다를 수 있기 때문에 CRISPR/Cas9는 시퀀스 관련 때문에, 그것은 매우 도움이 셀 라인 전용 변종 (단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 또는 삽입/삭제 (indels))를 식별 하 그는 디자인에 이러한 통합 참조 게놈에서 다. 이렇게 하면 crRNAs 호스트 게놈와 호환 된다는 것 그리고 기증자 템플릿 플라스 미드 homology 팔 어떤 셀 라인의 특정 이체를 유지 합니다. 제안된 전략 디자인 과정에서 homozygous 이체 crRNAs 및 기증자 템플릿 플라스 미드 homology 팔으로 통합 하는 것입니다. Heterozygous 이체를 통합 하는 것은 선택적입니다. 특정 시 약 큰 노크에서 실험을 위해 사용 하 고이 프로토콜에 대 한 다른 주요 고려 사항은 아래에서 토론 된다.
Cas9 단백질
Cas9 단백질을 사용 하 여의 주요 장점은 소개 하는 Cas9와 gRNA는 RNP 복잡 한으로 플라스 미드-기반 접근 Cas9와 gRNA의 식 수 일 동안 계속 하 고 리드에 비해 nuclease 활동의 제한 된 기간에 결과 표시 되었습니다. 큰에-및 오프-대상 활동26,의27. Cas9 단백질을 사용 하 여의 또 다른 이점은 그것 쉽게 셀 안에 한 번 쪼개 다 수입니다. 이 전사, 번역 및 처리26,28단백질을 필요로 하는 Cas9 mRNA 또는 Cas9/gRNA 플라스 미드를 사용 하 여 더 많은 기존의 방법과 대조 됩니다. Wildtype S. pyogenes Cas9 단백질은 지금 많은 상업적인 근원에서 있다.
가이드 RNA
또는 몇 가지 예측된에서-대상 호스트 게놈29,30,,3132에 있는 원하는 FP 삽입 사이트 근처 crRNA 목표를 찾아내기를 위한 많은 공개적으로 사용 가능한 도구가 있다. HDR에 HDR 결과의 정밀도 효율성 주어진된 로커 스12에서 사용 하는 crRNA 목표 사이 넓게 변화 한다. 이러한 이유로, 몇몇 crRNAs 테스트 (2-4와 선호 50 내 원하는 삽입 사이트의 bp) 로커 스 당 것이 좋습니다이 성공적인 편집 실험의 확률을 증가 시킬 수 있습니다. 합성 2 부분 crRNA 및 tracrRNA, 합성 한 gRNAs (sgRNAs) 생체 외에서 gRNA를 제공 하기 위한 현재 가능성 포함 복사할 sgRNAs, 또는 U6 발기인에서 sgRNA을 표현 하는 세포는 플라스 미드를 제공. 이 프로토콜은 높은 분열 활동 하지 적합 합니다. 수정 되지 않은 2 부분 crRNA와 tracrRNA ( 재료의 표참조) 셀에 최소한 잠재적인 섭 동을 일으키는 동안 모노 유전자 f P 태그 세포 생성의 목표와 함께 사용 되었다.
기증자 템플릿 플라스 미드
기증자에서 템플릿 플라스 미드에 통합 됩니다 호스트 게놈 HDR 이벤트 기간 동안 제공 되는 상 동 중 일부 시퀀스 팔, 때문에 점 돌연변이 crRNA 인식 사이트에 HDR 다음과 같은 Cas9에 의해 분열을 더 방지 하기 위하여 소개 되어야 한다. 종종 간단한 파괴적인 변화 팸 시퀀스를 변경할 것입니다. 일부 비 정식 팸 시퀀스는 여전히 야생 타입 S. pyogenes Cas9에 의해 인식 될 수 있다, 왜냐하면 NGG, 자성 또는 나라33를 사용 하지 않도록 최상 이다. 상 동 팔 돌연변이, 동의어 비 돌연변이 희귀 codons의 소개 하지 않도록 합니다. PAM 시퀀스에 동의어 변경 불가능, 씨앗 지역에 3 개의 동의어 포인트 돌연변이 만드는 것이 좋습니다 (10 bp 팸 하 근) crRNA 바인딩 사이트의. 주의 이러한 변경 시 (UTR) 5ʹ 번역 되지 않은 지역에이 지역의 중요 한 규제 시퀀스를 포함할 수 있기 때문에 취해야 한다. 으로 비 보존 기초 변경 높은 보존된 기초17변경 보다 더 용납 수 있습니다 UCSC 게놈 브라우저의 비교 유전체학 트랙 이러한 경우에 지침을 제공할 수 있습니다와 같은 유전자 보존 데이터베이스 컨설팅. 때로는 FP 시퀀스의 단순한 삽입은 ( 그림 1);에서 crRNA 바인딩 사이트를 방해 하기에 충분 한 그러나, 새로 추가 된 시퀀스 crRNA 바인딩 및 팸 시퀀스의 지 속성에 대 한 확인 되어야 한다.
FP와 네이티브 단백질 아미노산 링커는34의 융합 단백질 기능을 보존 하기 위해 권장 됩니다. 종종 아미노산 링커는 특정 요금 또는 크기에 대 한 선택할 수 있습니다. 경우는 cDNA 퓨전 디자인 타겟 비슷한 생 융해 단백질 되었습니다 잘 공부 하고있다, 같은 링커 순서 CRISPR/Cas9 노크 실험12,19에 사용할 수 있습니다. 이러한 정보를 사용할 수 없는 경우 GTSGGS 등 짧은 링커 되었습니다12성공적으로 사용. 다른 연구 대상35의 다양 한 일반적인 작은 3-아미노 산 성 링커 순서와 성공을 설명 했다.
Transfection 및 FACS 농축
많은 상용 transfection 시 약 electroporation 시스템 크기, 비용, 및 구성의 다양 한 시 약을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다 반면 세포, 분자의 특정 종류의 배달에 대 한 공식화 된다. HiPSCs 같은 하드 transfect 세포에 대 한 일반적인 transfection 방법 이외에, electroporation 또한이 방법에 설명 된 대로 CRISPR/Cas9-중재 FP 노크에 대 한 모든 세 가지 구성 요소를 제공 하는 혜택을 운반 합니다. 다른 상용 시 약이이 방법 (데이터 표시 되지 않음), 개발 하 고도 사용 하 고 다른 사람에 의해 RNP 배달26,28,36 때에 비교 될 때 최상의 결과 생산 하기 위해 Electroporation 발견 .
HiPSCs를 편집 하기 위해이 프로토콜을 사용할 때 특별 한 주의 전후에 최적의 세포 생존 및 최소한의 자발적인 차별화에 대 한 프로세스를 편집 하는 유전자는 세포의 부드러운 처리 되도록 취해야 한다. 특히, FACS 농축 방법 가능한 가장 큰 노즐 (130 µ m), 낮은 유량 (≤24 µ L/min), 방부 제-무료 칼 집 액체를 사용 하 여 줄기 세포를 정렬에 대 한 적응 해야 (염 분, 같은 재료의 표참조), 그리고 낮은 샘플 (10 psi) 압력입니다. 줄기 세포에 차선 생존 귀착되는 단일 셀 정렬, FACS 농축 hiPSCs 대량에서 정렬 하 고 셀 생존 및 줄기 세포 무결성을 최적화 하는 인구로 확장. 그러나, 단일 셀 정렬 덜 민감한 세포 유형에 대 한 적절 한 있을 수 있습니다. 세포 생존 촉진, 세포 FACS 농축에 대 한 수확 후에 1 시간 보다 더 이상 문화에 반환 하 고 정렬 과정을 통해 실 온에서 보관. 일부 세포 유형에 대 한 세포 생존 또한 잠복기 셀 정렬 과정 전반에 걸쳐 얼음 (4 ° C)에 의해 향상 될 수 있습니다.
FP-긍정적인 세포의 대량 확장 클론 라인을 생성 하기 전에 융해 단백질 지 방화에 대 한 이미징 분석 하 여 인구를 평가 하는 기회를 제공 한다. 셀의 결과 풍부한 인구 수도 있지만 일부 연구에 대 한 충분 한,이 인구는 자주 다양 한 강도의 FP 신호를 표시 합니다. 격리 된 클론 라인 단일 신호 (그림 3) 기능 실험12에 대 한 더 적절 한 그들을 만드는 있다.
클론 셀 라인 생성
편집 및 클론 선 생성 프로세스에 걸쳐 세포 형태학을 모니터링 하는 데 중요 하다. 부드러운 가장자리와도, 잘 포장 센터12,,1819hiPSC 식민지 급지대 무료 조건에서 재배 전시 한다. 차별화 된 세포는 문화의 5% 미만에서 관찰 해야. 개별 식민지 때, 그는 전시 좋은 형태를 선택 합니다. 이벤트를 뿌리고 96 잘 접시 중 형태에 대 한 복제를 확인 하 고이 분화로 이어질 수 있습니다 또는 유전자 불안정성의 표시로 자란가 그를 중단할.
클론 세포의 정확한 편집의 유전자 확인에 대 한 허용 Cas9 유도 이중 가닥 게놈에서 휴식 하기 때문에 중요 하다는 종종 수리 부정확 하 게 원하는 장소에 태그의 설립에도 불구 하 고. 앞에서 설명한 PCR 기반 분석 실험 보여주었다 누적 10 독특한 게놈 loci에 걸쳐 많은 (45%) FP 표현 클론의 게놈12기증자 플라스 미드 백본 통합 대상된 현장에서 또는 무작위로 (거의)에서 고통. 또한, GFP-긍정적인의 23%를 복제 (n = 177) 10 독특한 loci에 걸쳐 돌연변이에서 또는 태그 없는 대립 유전자, 대부분 NHEJ12때문에 예상된 crRNA 절단 사이트 근처 항구를 발견 했다. 많은 클론 라인 (~ 100 클론/편집)의이 유전자 분석 불가능 한 세포 인구에서 FP 표현과 예상된 퓨전 단백질 지 방화 혼자 보장 하지 않습니다 정확한 편집12 이후 유전 유효성 검사의 중요성 강조 . 또한, 이러한 PCR 기반 분석 클론 선 세대 전에 의미 있는 분석을 완료할 수 있습니다에 대 한 필요성을 보증 하는 어떤 확신을가지고 셀의 인구 농축된에 수행할 수 없습니다. 삽입 된 FP 태그의 유전자 확인 및 검증 (모노 유전자 편집된 클론)에서 편집 되지 않은 대립 유전자의 유전 무결성의 둘 다 정확한 편집 태그 식 넘어 대상된 현장에서 확인 하는 데 필요한 있습니다.
Bi-유전자 편집의 낮은 속도 (Sanger와 exome 시퀀싱 분석)으로 대상에서 돌연변이의 부족이 방법 (되지 않은 데이터)12를 사용 하 여 날짜를 관찰 되었습니다. 이것은 CRISPR/Cas9 실험26,27에 대 한 짧은 지속 RNP의 사용을 설명 하는 이전 연구 결과와 일치. Bi-유전자 수정 클론 셀 라인의 부족 특정 장소에는 영향을 수도 있습니다 또는 두 용납 하는 셀의 무 능력 때문 태그 제안 이전에 게시 실험에서 필수적인 단백질의 복사본 상 상속 유전자 양방향 편집된 셀 했다 또 다른 (TUBA1B)12만 한 로커 스 (LMNB1)에 대 한 관찰. 완벽 하 게 검증 된 Bi 유전자 클론 셀 라인 mEGFP19이 방법 태그 ST6 베타-galactoside 알파-2, 6-1 sialyltransferase (ST6GAL1), 및 RAB5A 구성원 RAS oncogene 가족 (RAB5A)를 사용 하 여 생성 된.
게놈에서 편집의 정밀도 확인, 넘어 더 클론 라인의 특성 충족 모든 줄기 세포, 게놈, 클론을 식별 하는 데 사용할 수 있는 품질 관리 분석 실험의 다양 한 있다 그리고 세포 생물학 기준 연구 미래에 사용 . 세포 생물학과 기능 분석 실험 지역화, 적절 한 표현과 융합 단백질12의 기능 확인을 사용할 수 있습니다. 편집 되지 않은 자녀를 비교 현지화, 역학, 및 기능에는 편집 과정의 영향을 평가 하는 데 도움이 됩니다. 다른 분석 실험과 같은 성장 분석 및 게놈 안정성에 대 한 테스트 또한 도울 수 있다 태그 단백질 셀 perturbing 인지 확인 합니다. 이 프로토콜에서 hiPSC를 사용 하 여, pluripotency 마커 및 감 별 법 잠재력의 평가 다운스트림에 대 한 귀중 한은 복제 연구12결정에 중요 한 될 수 있습니다. 문화를 확장 하기 때문에 hiPSC는 성장 율 모니터링 유전 불안정성으로 이어질 보였다 고 클론 셀 라인의 karyotype는 또한 중요 한12,37. 그러나, 마지막 것 편집된 된 셀의 사용 수준 및 품질 관리 분석의 폭 궁극적으로 결정 하 고 응용 프로그램에 따라 달라 집니다.

게놈 편집 전략, 특히 CRISPR/Cas9, 세포질 과정을 공부 하는 사용 되 고 점점 접근 가능 하 고 귀중 한1,2,3,,45, 6 , 7. CRISPR/Cas9의 많은 응용 프로그램 중 하나는 유전자 또는 단백질 제품8의 활동에 대 한 기자 역할을 다음 특정 게놈 loci GFP 등 대형 세 시퀀스의 (감독 homology 수리 (HDR))를 통해 소개 . 이 기술은 결과 endogenously 규제 융해 단백질 subcellular 지 방화 및5 관심사의 단백질의 역학 관계를 시각화 하기 위해 사용 될 수 있는 생 열려있는 독서 프레임 형광 단백질 시퀀스에 참여를 사용할 수 있습니다. ,,69,,1011. Endogenously 태그 단백질 overexpression 시스템에 비해 많은 혜택을 제공, 큰 시퀀스 인간 게놈으로 삽입은 일반적으로 요구 하는 선택 또는 농축 할 수 있는 세포의 인구를 전략 하는 비효율적인 프로세스 수 쉽게 공부5,12.
이 프로토콜 원하는 genomic 소재 시에 형광 성 단백질 (FP) 인코딩 DNA 순서의 삽입을 설명 합니다. 프로토콜 설계 및 기증자 템플릿 플라스 미드 및 ribonucleoprotein (RNP) 복잡 한 (야생 타입 S. pyogenes Cas9 단백질 합성 CRISPR RNA (crRNA)와 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA)와 함께) 전달 포함 됩니다. 또한 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)와 클론 셀 라인 생성 프로세스를 통해 상 편집 된 셀의 농축이입니다. 날짜 하려면,이 메서드 hiPSC 라인 monoallelic 또는 25 단백질 주요 세포질 구조를 나타내는 라벨 (거의) bi 유전자 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 노력에서 결과 편집된 셀으로 예상된 유전자 삽입을가지고, 제대로 로컬라이제이션 융해 단백질 pluripotency 및 안정적인 karyotype12 (및 되지 않은 데이터) 확인 되었습니다 했다. 이 방법은 또한 여러 다른 생성 하 사용 된 단일 및 듀얼 (2 개의 다른 단백질 같은 셀 태그) 편집 hiPSCs (되지 않은 데이터)의 인구.
많은 기존의 셀 라인와 달리 그들은 2 중, karyotypically 안정, 비 변형, 증식 하기 때문에 건강 한 기증자에 게 서 파생 된 인간의 Ipsc 이러한 게놈 편집 노력에 대 한 선정 됐다. 이러한 속성은 근본적인 세포 생물학 및 질병 모델링을 공부에 대 한 매력적인 모델을 제공 합니다. 또한, hiPSCs의 감 별 법 잠재력 다양 한 계보와 세포 유형 organoids, 조직 및 "접시에 질병" 모델13 포함 하 여 isogenic 셀을 사용 하 여 동시에 여러 발달 단계를 공부 하는 기회 제공 ,,1415. 이 프로토콜은 hiPSCs (911 무역 선)를 위해 개발 되었다, 그러나 그것 수 있습니다 다른 포유류 세포 선을 사용 하 여 프로토콜의 개발에 대 한 유익.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters, or similar</td><td></td><td>bioinformatics software for&lt;em&gt; in silico&lt;/em&gt; donor plasmid design</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT, or similar</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator, or similar</td><td>ThermoFisher Scientific, or similar</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, 2 &amp;micro;L)</td><td>Rainin, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L)</td><td>Rainin, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel Pipette (200 &amp;micro;L)</td><td>Rainin, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td><td>Millipore Sigma, or similar</td><td>BR704526-1EA</td><td>use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td></tr><tr><td>Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td><td>Thermo Fisher, or similar</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Pipette Controller</td><td>Drummond, or similar</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Pasteur Pipets</td><td>VWR, or similar</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td><td>CELLGARD, or similar</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lot tested before use with hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-phenol red)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC hiPSC line</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-well Cell Culture Plate</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polystyrene conical</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant wild-type &lt;em&gt;Streptococcus&lt;/em&gt; &lt;em&gt;pyogenes&lt;/em&gt; Cas9-NLS purified protein, 40 &amp;micro;M</td><td>University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td><td>Genewiz</td><td></td><td>donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Clontech</td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System, 100 &amp;micro;L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo version 10.2</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Blood Bank Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>used as preservative-free FACS Buffer</td></tr><tr><td>Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td><td>Olympus, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plate, 96-well</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>24 well Cell Culture Plate</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

프로토콜은 프레임 N 또는 C 터미널 형광 태그를 융합 하는 익스프레스 생 단백질 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)을 생성 하는 데 제공 됩니다. 간결한 CRISPR/Cas9 시스템 (클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 9) 감독 homology 수리 (HDR)를 통해 게놈 loci 큰 exogenous 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 원하는 노크에 달성,이 프로토콜 사용 하 여 ribonucleoprotein (RNP)-기반 접근 야생 타입 연쇄 상 구 균 pyogenes Cas9 단백질, 합성 2 부 가이드 RNA (gRNA), 및 기증자 템플릿 플라스 미드를 통해 세포에 전달 됩니다 electroporation입니다. 붙일 태그가 단백질을 표현 하기 편집된 셀 정렬 (FACS) 형광 활성화 된 세포에 의해 농축 됩니다. 클론 라인 다음 생성 하 고 정확한 편집 결과 대 한 분석 될 수 있다. 관심사의 유전자의 genomic 소재 시에 형광 태그를 도입 하 여 결과 subcellular 지 방화 및 융해 단백질의 역학 공부 될 수 있다 통제 생 규정, 재래식 overexpression에 핵심 개선 시스템입니다. 유전자 태그를 위한 모델 시스템으로 hiPSCs의 사용 2 중, nontransformed 셀에 태그 단백질을 공부 하는 기회를 제공 합니다. 때문에 hiPSCs는 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다,이 이렇게 생성 하 고 다양 한 isogenic 셀룰러 컨텍스트 태그 단백질 연구 기회를 제공 한다.

이 실험의 목표 LMNB1 유전자 (단백질의 N-말단)의 5ʹ 끝을 mEGFP 시퀀스를 도입 하 여 핵 lamin B1 단백질 mEGFP (단위체 향상 된 GFP)를 융합 했다. 마이클 데이비슨 형광 단백질 컬렉션21에서 링커 (아미노산 시퀀스 SGLRSRAQAS)을 이전 cDNA 구문에 따라 선택 되었다. CrRNA 바인딩 지역 각 후보 crRNA에 대 한 기증자 템플릿 플라스 미드에는 mEGFP 및 링커 시퀀스의 실리콘에 삽입 후 중단 되었다, 때문에 아무 지점 돌연변이 잠재적인 crRNA 인식 및 분열에 의해 방해를 만들 필요가 기증자 시퀀스 (그림 1)의 Cas9. 기증자 시퀀스 1 kb homology 팔 mEGFP 링커 시퀀스의 양쪽 측면을 포함. 결과 2,734 bp DNA의 pUC57 등뼈에 복제 했다 시퀀스 확인 하 고 결과 기증자 템플릿 플라스 미드도 없는 맥시 준비를 사용 하 여 순화 되었다. 기증자 템플릿 플라스 미드 및 복잡 한 RNP 페 했다, 상 편집된 셀 풍성 하 게 했다와 mEGFP 핵 lamin B1 융해 단백질의 지 방화는 형광 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 확인 되었다. 비록 두 crRNA 시퀀스 생성 하기 편집된 인구12만 crRNA1 transfection 결과 여기, 설명 합니다.
0.95 %mEGFP-긍정적인 세포 상 편집 대표 셀에 포함 된 페 LMNB1 crRNA1 gRNA, Cas9 단백질, 또는 기증자 템플릿 플라스 미드 electroporation 반응 (버퍼만)에 포함 된, 부정적인 컨트롤에 비해 mEGFP-핵 lamin B1 인구 (그림 3a). 이 결과 효율성 노크에서 이전에 보고 된12이 메서드를 사용 하 여 많은 게놈 loci 관측의 범위 안에 이었다.
MEGFP-긍정적인 세포 FACS에 의해 분리 되었고 라이브 현미경 핵 봉투에 mEGFP 핵 lamin B1 융해 단백질의 예상된 지역화를 확인 하 여 몇 군데. FACS 농축 후 LMNB1 crRNA1 인구에서 정렬된 셀의 약 90% (로 현미경 검사 법에 의해 결정), mEGFP-긍정적인 일부 mEGFP 부정적인 셀 정렬 절차 동안 GFP-긍정적인 세포와 공동 정화를 제안 했다. 이것은 성공적인 편집을 위한 유전자 검사 다음 수 96 클론의 수확에 대 한 허용 농축의 수락 가능한 수준 이었다. 일반적으로, 성공적인 농축 컷오프 50%는 GFP 긍정.
정렬된 셀 인구의 nondividing 세포에 있는 핵 봉투 (핵 주변)에 형광을 표시 하 고 유사 분열 제공 자신감 올바른 게놈 중 세포질 내에서 확장된 핵 lamina에는 LMNB1에서 편집 로커 스입니다. 밝은 또는 희미 한 신호를 포함 하는 풍부한 인구 셀. 신호 강도이 차이 정확 하 고 잘못 된 결과 및 추가 대 한 유전자 검증된 클론 라인 생성 유틸리티 (토론 참조) 연구 하이라이트 편집의 조합을 반영 될 수 있습니다 (그림 3b)12. 클론 라인 생성 후 유전자 세포 현미경 실험 (그림 3c)에서 균일 한 GFP 강도 보여준 검증.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> 그림 1 . LMNB1 유전자의 N-말단 GFP 태그에 대 한 전략을 디자인. GFP 태그 염색체 5에 있는 LMNB1의 첫 번째 엑손의 N 맨끝 삽입 5ʹ 위해 설계 되었습니다. 5ʹ와 3ʹ 모두 homology 무기는 1 kb와 시작 codon (ATG)와 두 번째 코 돈 (상 동 팔만 부분적으로 그림에 표시). 두 후보 crRNAs Cas9 하면서 독특한 게놈에서 가능한 의도 삽입 사이트 가까이로 쪼개를 안내 하도록 설계 되었습니다. MEGFP 및 아미노산 링커 순서 시작 codon (하지를 mEGFP 및 링커 순서)의 단지 3ʹ를 삽입된 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> 그림 2 . Endogenously 생산에 대 한 워크플로 태그 hiPSC 클론 라인. Transfection 구성 요소, 포함 (골드 crRNA와 보라색 tracrRNA 붉은 Cas9 단백질 표시), Cas9/crRNA/tracrRNA RNP 복잡 한 상 동 팔 (가, 금에 표시), 포함 된 기증자 템플릿 플라스 미드 및 FP + 링커 순서 (에 표시 된 녹색), 했다 electroporated입니다. 4 일 후, FP 양성 상 편집 셀 FACS에 의해 농축 (~ 1000 셀), 96-잘 접시의 단일 잘으로 정렬 된 셀의 모든 시드를 모집단으로 확장 그리고 문화에 몇 백만의 노동 인구까지 확장 세포 "풍부한 인구"로 분석 될 수 (프로토콜 단계 3.8 참조). FP-긍정적인 세포의 수익률 차이가 HDR12;의 가변 속도로 인해 실험 성공적인 농축 수 있습니다 일반적으로 300 ~ 5000 포함6 엉덩이 세포 transfection 약 1.6 x 10의 후 세포. 예비 이미징 연구 확인 신호 및 풍부한 인구에 융해 단백질의 지 방화. 식민지는 확장 및 cryopreservation 96 잘 접시에 수동으로 선택 했다. 게놈 품질 관리 심사를 더 물방울 디지털을 사용 하 여 PCR (ddPCR) 및 다른 PCR 기반 분석 실험은 다음 식별 하는 데 제대로 편집된 클론, 앞에서 설명한12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> 그림 3 . 상 편집된 셀 인구의 농축. (A) 는 LMNB1의 흐름 cytometry 플롯 편집 셀 4 일 후 transfection. Y GFP 강도 표시 하 고 x 축 앞으로 분산형 표시 됩니다. 정렬 게이츠 버퍼 전용 제어 기반으로 설정 했다. HiPSCs 섭 동에 민감한 때문에, 생략 되었다 라이브/죽은 얼룩 그리고 매우 보수적인 FSC/SSC 게이트 대신 사용 되었다. 농축 한 후 (B) , LMNB1 Cr1의 인구 편집 셀 셀 GFP 핵 봉투 (예상된 LMNB1 지역화) 지역화의 ~ 90%를 보였다. 인구는 몇몇 GFP 부정적인 세포 뿐 아니라 다양 한 GFP 강도의 셀 포함. 스케일 바는 10 미크론. (C) 클론 라인 생성 후 셀 일부 세포 주기 의존 차이와 유니폼 GFP 강도를 보였다. 눈금 막대 20 미크론 이다입니다.

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Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

endogenous-protein-tagging-human-induced-pluripotent-stem-cells-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

26.1K 조회수.  Allen Institute for Cell Science. 여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

연구

발생학

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

유전학

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the exhaustion of muscle progenitor cells. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) gene editing has the potential to restore the expression of the dystrophin gene. Autologous induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived muscle progenitor cells (MPC) can replenish the stem/progenitor cell pool, repair damage, and prevent further complications in DMD without causing an immune response. In this study, we introduce a combination of CRISPR/Cas9 and non-integrated iPSC technologies to obtain muscle progenitors with recovered dystrophin protein expression. Briefly, we use a non-integrating Sendai vector to establish an iPSC line from dermal fibroblasts of Dmdmdx mice. We then use the CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression through a non-homologous end joining of the reframed dystrophin gene. After PCR validation of exon23 depletion in three colonies from 94 picked iPSC colonies, we differentiate iPSC into MPC by doxycycline (Dox)-induced expression of MyoD, a key transcription factor playing a significant role in regulating muscle differentiation. Our results show the feasibility of using CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression in iPSC-derived MPC, which has significant potential for developing future therapies for the treatment of DMD.

Here, we present a Cas9-based exon23 deletion protocol to restore dystrophin expression in iPSC from Dmdmdx mouse-derived skin fibroblasts and directly differentiate iPSCs into myogenic progenitor cells (MPC) using the Tet-on MyoD activation system.

iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

생체공학

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

면역학 및 감염병학

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that allow the tagging of endogenous genes to produce fluorescent fusion proteins. These methods enable researchers to visualize protein behavior in real time, providing valuable insights into their functions and interactions within the cellular environment. Many current gene tagging studies employ a two-step process where visible markers, such as eye color changes, are used to identify genetically modified organisms in the first step, and the visible marker is excised in the second step. Here, we present a one-step protocol to perform precise and rapid endogenous gene tagging in Drosophila melanogaster, which enables screening for engineered lines without the visible eye marker, offering a significant advantage over past methods. To screen for successful gene-tagging events, we employ a PCR-based technique to genotype individual flies by analyzing a small segment from their middle leg. Flies that pass the screening criteria are then used to produce stable stocks. Here, we detail the design and construction of CRISPR editing plasmids and methods for screening and confirmation of engineered lines. Together, this protocol improves the efficiency of endogenous gene tagging in Drosophila significantly and enables studies of cellular processes in vivo.