우리는 의료 연구 위원회 영국 코어 (U105115237) RRK 자금에 대 한 감사 합니다.

1입니다. 세포와 자료의 준비
<ol><li>설명된23으로 셀 Klebsiella aerogenes, 같은 박테리아와 함께에서 또는 HL5 같은 영양소 매체에 SM 한 천 배지에서 배양. 참고: 성장 하는 박테리아에 macropinocytosis에 결함이 녹아웃 돌연변이 macropinocytosis의 속도 증가 시킬 수 있습니다 이차 돌연변이의 축적을 방지 하기 도움이 됩니다. 최적의 결과 대 한 주식에서 셀 도금 후 4 아래 통로 번호를 유지. 돌연변이 격리 후 즉시 냉동된 주식으로 저장 되어야 합니다.</li>
	<li>SM 한 천 배지에서 세포 배양을 SM 매체에 합류 K. aerogenes 성장. SM 한 천 격판덮개에 박테리아의 200-300 μ를 추가 하 고 확산. (다른 세균성 접시에서 전송) 하는 경우 셀의 메 마른 루프를가지고 고 접시의 한 가장자리에 확산. 주일에 22 ° C에서 품 어.</li>
	<li>50 mg/ml 물에 Tetra-메 틸-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran을 분해, 1 mL aliquots로 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 및-20 ° c.에 저장 Aliquots는 무기한으로 보관 될 수 있습니다. 참고: 155 kDa, 대량에서 싸게 구입할 수 있습니다 하지만 작은 dextrans 측정 macropinocytosis Dictyostelium24에 효과적으로이 방법으로 사용 되는 일반적인 크기입니다. 캐스케이드 또는 알 렉 사-647, 같은 다른 비-quenchable dextrans 다른 fluorophores 필요한 경우 대안이 있습니다.</li>
</ol>2. (선택 사항)으로 양적 질적 측정 변환
<ol><li>
현 탁 액 셀을 사용 하 여 액체 이해 분석 결과 수행 합니다.
	<ol>
<li>300 x g 3 분에 axenically 성장 세포를 작은, 삭제는 상쾌한 고 1 x 107 셀/mL 영양소 중에 resuspend. TRITC-dextran 0.5 mg/mL을 추가 하 고 180 rpm, 22 ° c.에 흔들</li>
		<li>희석 0.8 mL 샘플 얼음 주식2 0, 30, 60, 90, 120 분 세척에서 0.7 mL로 한 번 얼음 주식2 버퍼23 벤치탑 원심 분리기에서 1.5 ml, 같은 버퍼에 1 ml resuspend 및 얼음에 저장. 참고: 동일한 결과 생성 즉시 또는 모든 샘플 수집 된 일단 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
액체는 세포에 의해 내 면의 볼륨을 결정 합니다.
	<ol>
<li>574의 544 및 방출 파장의 여기 파장을 사용 하 여 형광을 측정 하기 위해 fluorimeter을 설정 10 nm 슬릿 nm. TRITC-dextran의 희석 일련을 설정 하 고 위해 주어진 형광을 측정 하는 데 사용할 dextran의 볼륨. 보정 곡선을 만듭니다.</li>
		<li>섹션 2.1 세포 현 탁 액의 0.9 mL를 사용 하 여 셀에 의해 내 면 형광을 측정 합니다. 보정 곡선24를 사용 하 여 셀 당 내 액체의 볼륨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 mL 얼음 차가운 주식2에 별도로 각 시간 지점에서 세포의 나머지를 희석. 5 mL 폴리스 티 렌 흐름 cytometry 튜브 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 각 시간 지점에서 세포는 서로 다릅니다 그리고 그들의 형광을 기록 교류 cytometer 설정 (섹션 3.4와 3.5 참조).</li>
	<li>위의 설정을 사용 하 여 교류 cytometer에서 교정 구슬의 형광을 측정 하 고 그것을 기록 합니다. 참고: 이것은 교류 cytometer에 모든 미래 형광 측정에 대 한 참조: 다시 사용 하기 전에 구슬을 실행 하 고 그래서 그들은 같은 형광 설정을 조정. 이 매우 좁은 정의 된 피크를 줄 것 이다. 주위에 형광 피크 게이트 퍼 팅 수 있습니다 쉽게이.</li>
	<li>세 번을 반복 하 고 2.2 및 2.3 서로 대 한 섹션에서 얻은 세포 형광 데이터. 적합 선 플롯 하 고 방정식을 사용 하 여 양적 단위로 cytometry에서 질적 데이터를 변환.</li>
</ol>3. 측정 유체 통풍 관
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> 그림 1: macropinocytosis의 높은 처리량 측정의 도식. (A) SM 접시에 성장 Dictyostelium K. aerogenes 박테리아 (노란색)와 시드. 주식2 버퍼의 25 mL로 세포 먹이 앞 (오렌지), 이미 개발 된 셀 피 (녹색), 수확. 소용돌이, 해리를 300 x g에 3 분 원심 분리 하 여 펠 렛 다음 주식2 버퍼, 삭제는 상쾌한 때마다 50 mL에 3 번 세척. 1 x 105 셀/ml HL5 성장 매체에 resuspend 하 고 편평한 바닥 96 잘 접시의 샘플 당 3 개의 우물으로 50 µ L를 추가 합니다. (B) 희석 TRITC-dextran HL5 성장 매체에 1 mg/ml에서 50 mg/mL의 재고 솔루션 24 h. 22 ° C에서 품 어. (0 분 이해 컨트롤 웰 스 제외), 각 샘플에 50 µ L을 추가 하 고는 dextran 0 분 이해 컨트롤에 추가 하는 후 h 1에 대 한 22 ° C에서 품 어. (C)는 언론에 즉시 가만히 따르다, 초과 매체를 제거 하 고 씻어 웰 스 작성 얼음 주식2 버퍼의 목욕에 잠수함을 조직에 접시를 두 드려. 버퍼를 가만히 따르다 하 고 다시 건조 두 드려. 5mm 나트륨 아 지 드 주식2엠씨 셀을 분리 해체의 100 µ L를 추가 합니다. 내 면된 형광 측정 cytometer 흐름을. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol><li>
플랫 96-잘 조직 문화 접시 (그림 1A)를 설정 합니다. 분석 결과; 전에 24 h HL5 매체 (포함 100 µ g/mL의 dihydrostreptomycin, 100 µ g/mL 암 피 실린 및 50 µ g/mL 대)에 그들을 전송 하 고 박테리아에 성장 하는 세포를 사용 하 여 macropinocytosis를 박테리아24에 성장 하는 세포에서 낮은 레벨에서 upregulated 될 수 있습니다. 또는, 다른 밀도에서 희석되 셀 오류를 줄이기 위해 분석 결과 전에 24 h에 대 한 잠복기 axenic 문화에서 직접 셀을 희석.<ol>
<li>25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에서 주식2 에 먹이 앞에서 베스트 셀. Vortexing와 3 분. 에 대 한 300 x g 에서 펠 릿 세포 분열 삭제는 상쾌한, resuspend 펠 릿 그리고 300 x g 주식2, 박테리아를 제거 하는 상쾌한 때마다 삭제의 50 mL에서 3 분에 3 번 세척.</li>
		<li>(는 hemacytometer 또는 다른 셀 카운트 시스템을 사용 하 여) 셀 밀도 결정 하 고 HL5 포함 항생제 1 x 105 셀/ml로 희석. 각 조건에 대 한 3 개의 우물을 사용 하 여 각 음에 50 μ를 플라스틱. 22 ° C 24 h. 0 분 이해 제어를 설정 하는 기억에서 품 어. 참고:는 대체 매체, 예를 들면 SIH, VL6 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TRITC-dextran (그림 1B)에 포함 된 셀을 로드 합니다.
	<ol>
<li>Dextran 사용 매체에 1 mg/mL를 희석 (이 증가 될 수 있다 2.5-5 m g/mL를 매우 낮은 통풍 관에 포함 된 셀을 평가할 때). 각 잘 (주는 TRITC-dextran 0.5 mg/mL의 최종 농도)을 50 μ를 추가 하 고 이로써 상당한 dextran 축적 하지만 dextran exocytosis 아직 시작 하지는 22 ° C 1 시간에 접시를 반환. 참고: 리피터 피 펫이이 단계 더 빠르게 할 수 오류를 줄일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry (그림 1C)에 대 한 셀을 준비 합니다.
	<ol>
<li>세척, 직전 0 분 이해 컨트롤에 50 μ dextran 포함 된 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>매체를 가만히 따르다와 조직에 건조 두 드려. 얼음 주식2, 플레이트를 잠수 하 여 세척 한 다음 가만히 따르다. 참고: 준수 결함을 가진 일부 변종 예: 중부의 두 homologs의 녹아웃이이 단계 동안 분리 될 수 있습니다 (탈 라-/ talB-)25. 작업 셀 라인을 제대로 연결 하 고 필요한 경우 미디어를 발음을 할 때 주의 사용 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 5mm 나트륨 아 지 드 주식2MC (주식2 + 2mm MgSO4 및 100 μ M CaCl2)에 용 해의 100 μ를 추가 합니다. 주의: 나트륨 아 지 드는 매우 독성이 있습니다. 먼지가 면 및 안전 유리를 사용 하 여 분말을 작업할 때. 항상 착용 장갑 및 연구실 코트. 열을 방지 하 고 산으로 혼합 하지 마십시오. 참고: 셀 빠르게 분리 하 고 exocytosis 방해24입니다. 이것을 확인 하는 현미경을 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry에 의해 측정 유체 통풍 관
	<ol>
<li>값을 변환 상대적 절대 것 계획, 비즈를 사용 하 여 표준화 흐름 cytometer 설정 (섹션 2 참조). 사용 하 여 셀 (그림 2B) 섹션 2 앞으로 분산형 및 측면 분산형 설정 적절 하 게 셀 (그림 2A), 기계, 차단 되지 않습니다 보장을 dextran 함께 로드 하 고 매개 변수를 조정 하는 또는, (그림 2C) 내 면된 형광을 측정 합니다.</li>
		<li>높은 처리량 샘플링 시스템을 연결 하 고 플레이트를 추가 합니다. (TRITC-dextran 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 자극 582 nm 채널 또는 유사한 측정을)에 대 한 형광을 측정 하는 프로토콜 설정 세포 현 탁 액 및 실행의 최대 65 μ의.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
교류 cytometry 결과 분석
	<ol>
<li>앞으로 분산형 및 사이드 분산형 (그림 2A)를 사용 하 여 셀에 게이트. 통계 옵션을 사용 하 여 셀의 메디아 형광을 계산 합니다. 하나의 샘플을 사용 하 여 이러한 매개 변수를 설정 하 고 모든 샘플에 적용. 참고: 앞으로 분산형/사이드 분산형 프로필 다른 돌연변이 또는 억제제를 사용 하 여 샘플 사이의 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>각 조건에 대 한 3 개의 우물의 의미를 확인 하 고 빼기 0 분 이해 합니다. 중 2 절에서 결정 하는 수식을 사용 하 여 정량 값으로 변환 또는 컨트롤에 정상화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 유체 이해 시간-과정 수행
<ol><li>섹션 3, 각 시간 점 및 스트레인/조건에 대 한 3 개의 우물에서 세포를 설정 합니다.</li>
	<li>다른 우물에 dextran 이라는 매체를 순차적으로 추가 합니다. 전형적인 시간 과정 측정 유체 이해 0, 30, 60, 90, 120 및 180 분 180 분 시간 포인트 우물, 120 분 시간 지점에 대 한 우물에 그것을 추가 하 여 다음 60 분에 나중에 대 한 매체 dextran 포함 된 추가 등 (그림 3A).</li>
	<li>0 분 50 μ dextran 포함의 추가 매체 즉시 가만히 따르다와 섹션 3.3에서 접시를 씻어. 3.5 섹션에 설명 된 대로 분석 합니다.</li>
</ol>5. 복용량 응답 곡선
<ol><li>섹션 3, 각 스트레인 및 조건에 대 한 3 개의 우물에에서 설명 된 대로 세포를 설정 합니다.</li>
	<li>포함 하는 화합물의 두 번 원하는 최대 최종 농도 에서 1 mg/mL dextran 매체로 관심의 화합물을 희석. 처음으로 자동차의 동일한 비율으로 dextran와 매체를 포함 하는 두 번째 튜브를 준비 합니다. 소용돌이를 섞어입니다.</li>
	<li>샘플 (그림 4A) 당 매체를 포함 하는 200 μ dextran의 화합물의 희석 시리즈를 만듭니다. 소용돌이를 섞어입니다. 매체의 50 μ 1 h 위해 각 샘플에 추가 합니다.</li>
	<li>세척 및 분석 섹션 3.3 이후에 설명 된 대로.</li>
</ol>6. 식 균 작용 및 막 이해
<ol><li>막 이해 측정, 섹션 3에에서 설명 된 대로 셀을 준비 합니다. 10 μ M의 최종 농도 20 μ M FM 1-43를 포함 하는 매체의 50 μ를 추가 합니다. 후, 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry에 대 한 셀을 준비 합니다. 585 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다. 참고: 막 매매 하는 것은 액체 단계 보다 더 빠른, 10 분 1 h26보다 사용 하기 더 적절 한 시간 포인트입니다. 형광 막에 통합 하는 경우에 대체 염료 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>
붙일 이라는 구슬 또는 박테리아를 사용 하 여 측정 하는 식 균 작용. 그들은 앞으로 하 여 Dictyostelium 에서 사이드24분산형 형광 효 모를 사용할 수 없습니다. 섹션 3에서에서 설명한 대로 셀을 설정 하 고 설명된27분석.<ol>
<li>측정을 먹어서 구슬의 노란-녹색 구슬 세척 하 고 같이 cytometry 준비 하기 전에 1 h 5 x 107 구슬/mL (1.75, 2 μ m) 또는 1 x 108 구슬/mL (1, 1.5 μ m)의 최종 농도에 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 표시 추가 3.3 섹션입니다. 525 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다. 참고: 높은 농도 세포 분리 이어질 것입니다.</li>
		<li>박테리아의 식 균 작용을 측정, 텍사스-레드 분류 대장균 bioparticles 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry 준비 하기 전에 섹션 3.2 ~ 1 x 108 박테리아/mL 1 h에에서 설명 된 대로 추가 합니다. 610 nm 채널 또는 유사한, 자극 하는 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).</li><li>Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+stop+shop+for+everything+Dictyostelium:+dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center+in+2012.">One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).</li></ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

다른 방법으로 유체 통풍 관을 평가 하는 낮은 처리량, macropinocytosis, 막 통풍 관의 높은 처리량 측정을 허용 하는이 방법에서는, 중요 한 단계는 제자리에서 세포와 세포를 분리 하려면 나트륨 아 지 드를 사용 하 여 세척 또는 Dictyostelium에 의해 식 균 작용입니다. 세포 표면에 부착 하 고 매체 아니다, 그들은 그들 주위 매체 처음 던져진 동안 왼쪽 연결 하 고 버퍼에 침수에 의해 변경 고 다시 던져진. 나트륨 아 지 드, 셀룰러 ATP 고갈 시킨다 고 막30depolarizes, 세포를 분리 하는 데 사용 하 고 또한 세포 생존24를 영향을 주지 않고 exocytosis를 방지 합니다.
이유 왜 특정 스트레인 또는 조건 변경 유체 통풍 관을 확립 유체 통풍 관의 매우 정확 하 게 측정을 매우 신속 하 게 준다 cytometry macropinocytosis Dictyostelium 에 의해 측정을 사용 하 여 추가 조사를 사용 하 여 현미경 검사 법은 필요한24. 또한 주목 해야 한다 그 이전에 게시 결과, 경우에 따라 표시 유체 이해에 차이 (이 경우) 처럼 표면에 성장 하는 돌연변이 체 긴장에 의해 또는 서 스 펜 션 (표준 프로토콜)로31떨고. 이 메서드를 사용 하는, 드문 경우에, 명백한 유체 글귀 결함 보고는 의미 합니다. 또한, 식 균 작용을 측정할 때 입자의 낮은 농도 에서만 사용할 수 있습니다. 먹어서가이 기법으로 판별할 수 있는 최대 속도 여전히 긴장과 조건24사이 식 균 작용에 관련 된 차이 측정 가능 하지만 실제 최대 보다 훨씬 이다. 식 균 작용의 최대 속도 확인 하려면 통풍 관 대체 프로토콜27에 의해 정지를 떨고에 측정 해야 합니다. 그래서이 수정 해야 합니다에 따라 교류 cytometer 설정할 때 셀 비즈를 phagocytosed 측면 분산형, 증가 했다.
그러나 Cytometry 포유류 세포32에서 유체 이해를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 그리고 액체의 더 높은 비율 단계 이해 다른 endocytic 경로 의해 Dictyostelium 에서 보다는 관심사. 또한, 세포는 더 내 면된 dextran의 endocytic 진행 수 있도록 37 ° C에서 트립 신을 사용 하 여 분리 일반적으로. 얼음 처럼 차가운 나트륨 아 지 드 표면 (윌리엄스, 관찰 되지 않은),이 기술을 더 최적화 없이 포유류 세포에 적용 되지 않습니다 만들기에서 분리 하는 세포를 발생 하지 않습니다.
Macropinocytosis의 높은 처리량 측정 Dictyostelium 세포에 억제제, 유전자 변이 또는 유전자 최저의 효과 대 한 신속 하 고 저렴 하 게 화면에 사용 될 가능성이 있다. 돌연변이 직접 부모에 비해 항상 한다. 독자는 Dictyostelium 스트레인에 대 한 기본 설정이 없습니다 이전, DdB 등 NC4 비 axenic 긴장 더 "야생-타입" axenic 것 들 보다는 하 고 axenic 긴장33으로 효과적으로 조작할 수 있습니다. 그렇지 않으면, Ax2 긴장 되는 axenic는 적은 게놈 중복34, 동안 a x 4의 많은 변종 중부 A 녹아웃 해야와 긴장 피해 가능 하면23. 이전에 게시 긴장 가장35Dicty 재고 센터 주문할 수 있습니다.
이 기술은 다른 조건, 저 해제 및 Dictyostelium에 의해 macropinocytosis에 돌연변이의 효과로 가능 했던 것 보다 더 큰 조사 가능성을 허용 한다.

2세포 면역에 의해 항 원 샘플링을 포함 하 여, 병원 체 항목 호스트 셀3, 암 세포 확산4 macropinocytosis에 의해 대규모 일반적인 유체 통풍 관은 여러 생물 학적 상황1, 중요 한과 프리온 질병5의 확산. 포유류 및 Dictyostelium 세포, 말라6,7, 파이 (3,4,5) P38,,910 (비록는 지질의 정확한 본질은 두11다릅니다) 활성화 Ras12,13, 그리고 활성화 된 Rac14,15 macropinocytosis에 의해 효율적인 유동성 통풍 관에 대 한 중요 하다 macropinocytic 패치는 어떻게 하는 것에 대 한 많은 의문점이 남아 있지만 형성, 조직 되 고 결국 내 면. Macropinocytosis의 보다 포괄적인 이해를의 개발을 허용 하도록 더 많은 단백질 macropinocytosis, 그리고 어떻게 그들은 다양 한 생물학 문맥에서 중요 하다의 후속 결정에 대 한 중요 한 발견 다양 한 조건에 대 한 치료 대상.
Dictyostelium macropinocytosis을 공부에 대 한 이상적인 모델 시스템입니다. 표준 실험실 긴장에 제정 macropinocytosis의 높은 수준을 의미 그 유체 통풍 관 이상 90% macropinocytosis6인. Macropinocytosis를 전적으로 macropinocytosis 때문에 유체 통풍 관의 비율은 훨씬 낮은 포유류 세포와는 달리 액체 통풍 관을 결정 하 여 측정 될 수 있습니다. Macropinocytosis는 너무 잘 정의 하 고이 시스템에 쉽게 시각된12 마찬가지로 조사에 대 한 뚜렷한 장점을 핵심 보존된 구성 요소는 macropinosome의 다른 시스템에 제공 여러 규제 신호 될 수 있습니다 16 , 17.
포유류 세포에 의해 macropinocytosis를 측정 하는 데 사용 표준 기법 dextran 긍정적인 소포18차지 하는 셀의 영역을 결정 하는 현미경 뒤 짧은 기간 동안 dextran와 펄스 후 세포를 고정 한다. 그러나이 기술은 macropinosomes Dictyostelium19에 보고 되었습니다 하 고 내 면 볼륨을 의미 하는 셀의 단일 평면 고려만 셀을 입력 시 축소의 가능성에 대 한 고려 하지 않습니다. 명확 하지 않습니다. Macropinosomes는 주어진된 시간에, 내 면의 수를 계산의 대체 기술,20같은 단점이 있다. Dictyostelium 를 사용 하 여 이러한 문제를 피할 수 그러나, Dictyostelium 에 의해 유체 통풍 관 측정에 대 한 기존 기술을 상대적으로 노동 집약, 대형을 사용 하 여 셀 및 dextran21양의 있습니다. 셀은 형광 dextran 및 예제는 fluorimeter를 사용 하 여 내 면된 형광의 결정에 대 한 다양 한 시간 지점에서 제거에 높은 밀도에서 동요. 이 낮은 처리량 남아 있지만 cytometry 얻을 인구 수준, 해상도22, 보다는 오히려 단일 셀에 의해 셀이 방법이으로 준비를 분석할 수 있습니다.
여기, 형광 dextran 레이블로 사용 하 여 내 면된 유체 측정 표준 기술을 96 잘 접시 형식에 적응 cytometry 높은 처리량 샘플링 (HTS) 첨부 파일을 사용 하 여 분석 하는 샘플입니다. 셀 시간, 얼음 처럼 차가운 버퍼에 침수에 의해 세척 하 고 5mm 나트륨 아 지 드, exocytosis 중지를 사용 하 여 분리의 미리 정해진 길이 아닌 quenchable 형광 dextran은 먹인 다. 각 잘에서 셀 다음 cytometry에 의해 분석 된다. 이 방법은 위의 방법의 한계를 극복 하 고 적은 리소스를 사용 하 여 관련된 노동 감소 하는 동안 긴장/조건 다 수의 유체 통풍 관의 동시 비교를 허용 하도록 설계 되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LSR_II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran (155 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1287</td>
			<td>Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5 medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HLGCFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrostreptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Formdium</td>
			<td>AMP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103694M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25169.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phopshate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.04877.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.05104.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>LS 50 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>15702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09719-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17687-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09847-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red E. coli bioparticles</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>E2863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow-set fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6607007</td>
			<td>Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>SMACFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Elkay Laboratory Products</td>
			<td>E25-PS22-50S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td>Use a tube that will fit onto your flow cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeating pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4-SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL repeating pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>70920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry

Macropinocytosis에 의해 대규모 일반적인 유체 통풍 관은 특정 암 세포, 항 샘플링, 호스트 세포 내 습 및 신경 퇴행 성 질환의 확산의 확산에 대 한 중요 하다. Dictyostelium discoideum 아메바의 일반적으로 사용 되는 실험실 긴장 매우 높은 유체 흡수 속도 영양소 매체, 90% 이상의 이다 macropinocytosis 때문에 성장 하는 때 있다. 또한, 많은 포유류 macropinocytosis의 알려진된 핵심 구성 요소 macropinocytosis를 공부 하는 우수한 모델 시스템을 만드는 존재도 있습니다. 여기, 형광 dextran 레이블로 사용 하 여 내 면된 유체 측정 표준 기술을 96 잘 접시 형식에 적응 cytometry 높은 처리량 샘플링 (HTS) 첨부 파일을 사용 하 여 분석 하는 샘플입니다.
셀 시간, 얼음 처럼 차가운 버퍼에 침수에 의해 세척 하 고 5mm 나트륨 아 지 드, exocytosis 중지를 사용 하 여 분리의 미리 정해진 길이 아닌 quenchable 형광 dextran은 먹인 다. 각 잘에서 셀 다음 cytometry에 의해 분석 된다. 메서드 또한 막 통풍 관 및 형광 구슬 또는 박테리아의 먹어서 측정 적용할 수 있습니다.
이 메서드는 높은 처리량, 노동 및 리소스 효율적인 방식으로 Dictyostelium 에 의해 유체 통풍 관의 측정을 허용 하도록 설계 되었습니다. 그것은 여러 변종 (예: 녹아웃 유전자의 돌연변이)의 동시 비교를 허용 한다 (예: 다른 미디어에서 세포 또는 억제제의 다른 농도로 처리) 병렬에서 시간 과정을 단순화.

일단 기술 수행을 셀 dextran 로드 되며 분석 (그림 1)에 대 한 준비 흐름 cytometer는 차단 되지 않습니다 확인 하 고 그림 2A에 표시 된 셀 처럼 앞으로 분산형/사이드 분산형 프로 파일을 조정. 컴퓨터 차단 되 면 그림 2B에 표시 하는 것을 볼 것 이다 하 고 계속 하기 전에 차단 해야. 매개 변수 표시 제어 axenic 세포는 긴 시간 지점에서 높은 내 면된 dextran 형광 및 짧은 것 들에서 낮은 내 면된 형광을 확인 (그림 2C).
돌연변이 차이점을 찾고, 그것은 가능성이 있을 것 세 가지 고기 중 하나입니다. 돌연변이 정상적인 유체 이해를 할 수 있습니다., 그들은 부분적인 결함을 가질 수 있습니다. 또는 유체 통풍 관을 완전히 폐지 될 수 있습니다. 표준 실험실 긴장 Ax2, 돌연변이 50% 감소 유체 글귀 (Ax2 rasG-14)이 경우 그림 2D 표시 정상적인 유체 글귀와 스트레인 고 하나 폐지 유체 글귀 (Ax3 gefB-28). 평균 평균 유체 통풍 관 (섹션 3.5)를 가져오고 ( 그림 3B)와 같이 내 면 액체의 볼륨을 계산 하거나 컨트롤에 데이터를 비교 하 여 그것을 사용 하 여 ( 그림 4B 에서 것과 같이 그리고 4 C).
그림 3A와 같이 유체 이해 시간 과정을 수행할 때 내 면된 형광 60-90 분, 후는 dextran exocytosed 될 시작 증가 한다 고 고원 (그림 3B)에 도달 하면. 표준 시간 포인트 60 분 사용 하는 좋은 신호를 얻을 수 있습니다 따라서 다른 돌연변이/조건에서 macropinocytosis를 비교 하 고 신호가 손실 exocytosis. 뮤턴트 exocytosis 방해 심각 고원29를 도달 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.
대부분의 경우에 높은 억제 물 농도에 거의 아무것도에 아래로 갈 것 이다 때 치료 세포 Dictyostelium ( 그림 4A에서최대 설정)에서 macropinocytosis에 대 한 효과적인 억제제로 1 시간에 내 면 dextran (그림 4B)입니다. 그러나 일부 억제제 100% 효과가 되지 않을 수 있습니다,, 예를 들면 nocodazole만 심하게 추가 될 때 macropinocytosis에 의해 유체 통풍 관의 50%까지를 억제 (그림 4C). 억제제는 효과가 있다면, 셀 컨트롤로, dextran의 비슷한 금액을 internalize 것입니다 그리고 형광 감소 표시 되지 않습니다. 이 기술은 억제제 치료를 최적화 소요 된 시간을 줄이고 다른 억제제와 억제 물 농도 매우 신속 하 게, macropinocytosis에 의해 유체 통풍 관에 영향에 대 한 상영 될의 큰 범위 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> 그림 2: 흐름 cytometer 및 대표 데이터의 설정. (A) 셀을 쉽게 구분할 수 있도록 앞으로 산포 (FSC) 및 셀 측면 살포 (SSC) 프로 파일을 설정 해야 합니다. Ax2 셀 모양을의 예가 표시 됩니다. (B) 교류 cytometer 차단 된 경우,이 예제와 같이 셀 매우 낮은 측면 분산형이 있다. 레이저는 fluorophores을 제대로 자극 하지 것입니다 그리고 기계 되어야 하지 차단 된 계속 하기 전에. 기계를 차단 하는 동안 얻은 모든 데이터를 폐기 해야한다. (C) 형광 설정 해야 0 분 이해 예제는 셀에 대 한 인 큐베이 팅 되었습니다 때 낮은 형광 형광 매체에 더 이상 201824윌리엄스 및 케이에서 가져온이 예제와 같이. (D) 예 정상 macropinocytosis (Ax2, 녹색)으로 1 시간에 대 한 TRITC dextran와 인 큐베이 팅 하는 셀의 macropinocytosis (Ax2 rasG-, HM172614, 오렌지)을 감소 하 고 macropinocytosis (Ax3 gefB-폐지 HM177628, 블루)입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> 그림 3: 96 잘 접시에서 액체 이해 시간-과정을 수행. (A) Dextran 추가 해야 샘플의 각 집합에 순차적으로, 동일한 끝 시간. 다음 우물을 세척, 분리 하 고, cytometry에 의해 내 면된 형광을 측정. 예 배는 dextran을 추가 하려면 여기에 표시 됩니다. (B) 유체 이해 시간-과정 Ax2 셀의 96 잘 접시에서 수행합니다. 윌리엄스 & 케이에서 가져온 201824, 오차 막대 표시 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> 그림 4: 유체 글귀 복용량 응답 곡선. (A) 의,이 경우는 PI3K 억제제 LY294002, HL5 1 mg/mL TRITC-dextran 이중 원하는 최종 최대 농도에서 포함 된 화합물을 추가. HL5 성장 매체 + 1 mg/mL dextran 차량 조건 당 200 µ L 매체의 희석 시리즈를 생성 하기 위해 다양 한 비율에서 혼자 포함 믹스. 세척 하 고 내 면된 형광을 측정 하기 전에 웰 스 1 h에 정상적으로 추가 합니다. ((B)) Ax2 세포 A에서 LY294002 포함 된 매체와 인 큐베이 팅에 대 한 유체 글귀 복용량 응답 곡선. 윌리엄스 & 케이 201824에서 적응. 유체 통풍 치료 컨트롤에 정규화 됩니다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차를 표시. ((C)) Ax2 세포는 nocodazole와 인 큐베이 팅에 대 한 유체 글귀 복용량 응답 곡선. 윌리엄스 & 케이 201824에서 적응. 유체 통풍 치료 컨트롤에 정규화 됩니다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차를 표시. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, 대규모 일반적인 유체 이해, 임상 생물학 면역학, 감염, 암, 및 신경 퇴행 성 질환 등의 많은 분야에서 중요 하다. 여기, 기존 기술을 높은 처리량, 단일 셀 해상도 macropinocytosis 모델 유기 체 Dictyostelium discoideum 를 사용 하 여 macropinocytosis의 측정 cytometry 흐름 수 있도록 적응 되었습니다.

Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

high-throughput-measurement-dictyostelium-discoideum-macropinocytosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

7.7K 조회수.  MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. Macropinocytosis, 대규모 일반적인 유체 이해, 임상 생물학 면역학, 감염, 암, 및 신경 퇴행 성 질환 등의 많은 분야에서 중요 하다. 여기, 기존 기술을 높은 처리량, 단일 셀 해상도 macropinocytosis 모델 유기 체 Dictyostelium discoideum 를 사용 하 여 macropinocytosis의 측정 cytometry 흐름 수 있도록 적응 되었습니다.

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

연구

생물학

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

의 조기 기아 응답에 Coronin (A)의 기능 조사<em&gt; Dictyostelium의 discoideum</em&gt; 집계 분석 실험에 의해

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...