저자는 드문 질병 모델과 메커니즘 (RDMM) 네트워크 (캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 및 게놈 캐나다에 의해 자금)을 감사 하 고 싶습니다. CK은 UROP 장학금 수상 (오타와의 대학)에 의해 지원 됩니다. DLJ는 Vanier 캐나다 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. IAP는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 박사 후 펠로 십 수상에 의해 지원 됩니다. 저자는 유전학의 미국 협회 권한을 부여에 대 한이 프로토콜을 게시 하 고 페 냐에서 보충 그림 5의 적응을 사용 하 여 감사 외.

절차와 관련 된 동물 주제 승인 되며 동물 보호 지침에 따라 제공 캐나다 위원회에 의해 동물 관리 및 오타와의 대학에 동물 보호 위원회.
1입니다. 준비
<ol><li>그것의 내부 표면에 걸쳐 9 cm 배양 접시 뚜껑 압력솥 테이프로 녹화 하 여 해 부 표면 준비. 스테레오 현미경 위치.</li>
	<li>3-5 일 후 수정 (dpf)를 배치 zebrafish 애벌레는 페 트리에서 접시와 ˜1.5 m m Tricaine 1 x E3 배아 미디어 (5 m m NaCl, 0.17 m m KCl, 0.33 m m CaCl2, 0.33 m m MgSO4, pH 7.2)에서 anesthetize.</li>
	<li>최소한의 스트레스와 3 dpf 애벌레에 맞게 2 mm의 직경에 한 쌍의가 위 또는 면도날과 P1000 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
</ol>2. 지 느 러 미 클리핑 Zebrafish 애벌레의
<ol><li>수정된 P1000 micropipette를 사용 하 여 마 취 유 충을 선택 하 고 위치 고압 테이프에 zebrafish 애벌레 Petri 접시 뚜껑에 배치.</li>
	<li>애벌레는 micropipette를 사용 하 여 주변 초과 Tricaine 솔루션을 제거 합니다. 지역으로 하 여 성공적으로 섹션은 지 느 러 미를 선택 하지만 생존을 위해 아직도 젖은 건조 해야 한다.</li>
	<li>마이크로 메스, 섹션 윌 킨 슨 외16에 설명 된 대로 그림 1에 표시 된 대로 스테레오 현미경 아래 꼬리 지 느 러 미를 사용 하 여. 절 개를 하는 동안 사이트 내에서 안료 격차는 꼬리 지 느 러 미, 말 초 혈액 순환 (그림 1A)의 한계에의 꾸준한 하향 압력을 적용. notochord 손상 되지 않도록 부드러운 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>현미경 sectioned 지 느 러 미를 시각화 하 고 microscalpel 블레이드 (그림 2A)의 팁 위에 조각 위치. 필터 종이의 작은 조각의 표면에 지 느 러 미를 포함 하는 microscalpel를 놓습니다. 참고: transected 조직에서 melanocytes의 존재로 인해이 단계 작은 블랙 스팟 (그림 2B)로 지 느 러 미의 시각화 수 있습니다.</li>
	<li>50mm 잘 (그림 2D) 당 NaOH 솔루션의 25 μ를 포함 하는 96-잘 PCR 플레이트에 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이 위와 핀셋 (그림 2C), 전송 사용 하.</li>
	<li>PCR 접시의 라벨에 따라 잘 번호 플랫-아래 96 잘 접시를 준비 합니다. 신선한 1 x E3 배아 미디어의 200 µ L로 가득 수정된 P1000 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 zebrafish 애벌레 부드러운 압력을 사용 하 여 수집 합니다. 같은 PCR 플레이트 (그림 2E)으로 잘 번호 96-잘 조직 문화 접시에 있는 애벌레를 분배.</li>
	<li>필터 종이 (그림 2F) 솔루션에 빠져들 잘는 다는 것을 확인 하십시오. Microscapel 70 %EtOH 솔루션으로 그것을 찍기 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해 각 컷 사이 핀셋의 블레이드를 청소. 깨끗 한 종이 티슈/지우기와 블레이드를 닦아.</li>
	<li>2.1-2.7 단계를 반복 하 여 모든 배아 잘립니다 되었습니다.</li>
	<li>genotypes 발견 되었습니다 때까지 28 ° C에 96 잘 접시에 애벌레를 저장 합니다. 참고: 배아 미디어 프로토콜은 2 일 이내에 쉽게 완료 될 수 있다 때문에 바뀔 필요가 없습니다. 더 많은 시간이 필요한 경우 미디어 변경 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 게놈 DNA 추출
<ol><li>96-잘 PCR 접시와 원심 분리기 1000 x g 되도록 모든 필터 종이 1 분에 샘플 NaOH 솔루션 내에서 잠긴 인감.</li>
	<li>조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 냉각 5 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열.</li>
	<li>500 mM Tris HCl, pH 8.0 각 샘플의 6 μ를 추가 합니다. 와 동입니다.</li>
	<li>짧게 원심 1500 x g, 실 온에서 5 분에 접시.</li>
	<li>PCR 반응 당 DNA 상쾌한의 1.5 μ를 사용 합니다.</li>
	<li>표 1-2와 같이 유전자를 PCR는 애벌레를 준비 합니다. 참고:이 프로토콜은 두 응용 프로그램에 대 한 테스트 되었습니다: 다중 PCR 반응 agarose 젤9, heteroduplex 녹는 genotypes polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)17을 사용 하 여 공개 하는 분석 결과 (HMA)을 사용 하 여 유전자 형을 공개.</li>
</ol>4. 대체 게놈 추출 Chelating 수 지를 사용 하 여
<ol><li>96-잘 PCR 접시에 잘린된 지 느 러 미와 지를 추가 하 여 완료 단계 2.5 킬레이트 화 수 지 (스 티 렌-divinylbenzene 공중 합체 짝된 iminodiacetate 이온을 포함) 5%의 30 μ를 포함. 참고: 수 지의이 종류 주로 조직 세포와 신속 하 고 효율적인 방식으로18에서 PCR 준비 DNA의 준비에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>단계 2.6-2.8로 표시 합니다.</li>
	<li>96-잘 PCR 접시를 봉인 하 고 모든 필터 종이 chelating 수 지 내에서 잠긴 ㄴ 다는 것을 확인 하는 예제를 간단히 원심.</li>
	<li>조직 세포에 대 한 뒤에 10 분 동안 4 ° C에 15 분 동안 95 ° C에서 thermocycler에서 샘플을 열. 참고:이 단계 동안 수 있습니다 세포와 세포질 분 대를 북극 수 지 구슬의 후속 바인딩 DNA와 RNA 해결책에 남아 있다.</li>
	<li>짧게 원심 작은 수 지 구슬 고 현 탁 액에서 DNA를 샘플.</li>
	<li>3.5-3.6 유전형 절차를 완료 하려면 단계를 따릅니다.</li>
</ol>5. 응용 프로그램 1: 다중 PCR Agarose 젤 분석 뒤
<ol><li>표 1, 다음 설정 다중 PCR 반응 homozygous 돌연변이, heterozygotes, WT 애벌레 사이 차별 활성화. 96-잘 열 cycler를 사용 하 여 표 3에 설명 된 사이클링 조건을 사용 하 여 PCR 반응을 수행. 참고: PCR 반응 또한 어떤 다른 기존의 PCR 열 cycler에서 수행할 수 있습니다. 이 예제에서는 페 냐, 그 외 여러분 에 의해 사용 되는 PCR 전략을 설명 합니다. aldh7a1 WT 및 같은 다중 반응에서 5 bp 삽입 돌연변이 체 대립 유전자를 확인 9 .</li>
	<li>1 물 나트륨 붕 산 염 버퍼에 1 %agarose 젤 준비 x GelRed. 참고: 나트륨 붕 산 염 버퍼 재고 x 20이 이루어집니다 10 M NaOH, ddH2O, 1800 mL 40 mL의 pH 8.5 붕의 76 g를 조정 하 고 다음 2 L 최종 볼륨 ddH2o.를 사용 하 여 완료</li>
	<li>1 x 나트륨 붕 산 염 버퍼 250 V에서 15 분 동안에 젤을 실행 합니다. 과정을 촉진 하기 위하여 가능 하다 면, 젤 시스템 샘플 로드 시간을 줄임으로써 더 높은 처리량 기능을 사용 하려면 멀티 채널 pipets와 호환 되는 사용 합니다.</li>
	<li>이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 자외선 (UV)에서 젤.</li>
</ol>6. 응용 프로그램 2: Heteroduplex 분석 결과 용 해
<ol><li>페이지 12% 젤 1.5 m m 간격 장치 격판덮개 15-샘플 빗을 사용 하 여 준비 합니다. 12.21 mL ddH2O, 트리 스/Borate/EDTA (TBE), 30% 아크릴 아 미드 10 mL, 250 μ x 10의 2.52 mL의 10% 염화 persulfate (AP)를 사용 하 여 두 페이지 젤 준비 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 1 x TBE 버퍼를 사용 하 여 (0.089 0.089 M 붕 산 및 0.002 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) M Tris HCl) 버퍼를 실행.</li>
	<li>5 분 동안 94 ° C에서 PCR 제품을 열.</li>
	<li>차가운 얼음에 또는 4 ° c.에서 10 분 동안 thermocycler 튜브</li>
	<li>PCR 견본 당 10 μ 분자량 마커의 8 μ를 로드 합니다.</li>
	<li>150 V 1 x TBE를 사용 하 여 수직 전기 시스템 1 h 또는 분자량 표식까지 거의 도달 유리 접시의 피트 라인에서 페이지를 실행 합니다.</li>
	<li>이미지 다른 genotypes의 차별 수 있도록 UV 빛에서 젤.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders.">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. 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(25), e1115 (2009).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Genome+Editing+Using+High+Efficieny+TALENs.">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Pena, I. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li><li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish.">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. 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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

편집 도구는 정확 하 게 지난 돌연변이 제 브라에서 transgenes 소개 고용 되었다 유전자 년5,6,,78. 질병 zebrafish에 모델링을 수행할 때 초기 애벌레 또는 젊은 고기는 종종9,12,13,14을 관찰 하 게 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 3 dpf 어린 애벌레의 유전형을 수 있도록 작은 zebrafish 애벌레 꼬리 생 검에서 PCR 준비 DNA 추출을 합니다. 특히 특별 게시물 유전형 하지 않을 때 가능한9genotypes의 조기 식별 여러 실험실 응용, 결정적 이다. 이른 나이에서 genotypes을 알고 또한 용이 하 게 생존 연구 및 phenotypic 돌연변이 분석. 이 프로토콜은 또한 특정 genotypes 성숙의 애벌레의 양육에 대 한 특히 유용 합니다. 애벌레 유전형은 아직 널리 사용 되지 않습니다 zebrafish 실험실에는 전세계 그리고이 프로토콜이 기술의 보급을 촉진 하는 것을 목표로. Transected 지 느 러 미를 조작 하는 동안이 메서드를 사용 하 여 샘플; 내 DNA의 존재로 신뢰를 제공 합니다. 지 느 러 미 생 처리 과정 전반에 걸쳐 필터 종이에 짙은 반점으로 쉽게 구상 될 수 있다. 이 윌 킨 슨 외 의해 프로토콜의 중요 한 향상을 나타냅니다. 16.
프로토콜 내에서 몇 가지 중요 한 단계 품질 결과를 얻을 올바르게 따라야 합니다. 맨먼저, 애벌레 지 느 러 미의 transection 안료 간격, 출혈 방지, 혈액 순환 제한 하 원심 내에서 발생 해야 합니다. 이 지 느 러 미 생 검 동안 애벌레의 생존을 보장합니다. 또한, 지 느 러 미의 위치를 표시 하는 필터 종이에 검정색 점이 NaOH 솔루션에서 필터 종이 배치 하기 전에 관찰 해야 합니다. 이 각 샘플 잘에 지 느 러 미 조직 (와 그러므로, DNA)의 존재를 보장합니다. 필터 종이 또한 셀 세포 및 DNA 추출 NaOH 솔루션 내에서 몰두 해야 합니다. 이 프로토콜은 부 화 애벌레만 사용 했다 3 dpf 보다 젊은 연령에 대 한 테스트 하지. 유전자 형 젊은 배아를 (깐 < 3 dpf) chorion 제거 해야 할 것 이다. 그 부족 한 PCR 증폭 발생, 표준 PCR 최적화 전략 적용 (예를 들어, 다양 한 뇌관 농도, 온도, 또는 DNA 농도 어 닐 링) 이어야 한다. 충분 한 DNA PCR 반응 ( aldh7a1 및 plpbp 유전형 예제와 같이)의 여러 종류를 성공적으로 수행을 추출, 다음 지 느 러 미 클리핑 절차 얻은 DNA의 농도 작은 (~ 5 ng / µ L 당 샘플) 따라서, 증폭의 큰 성공에 대 한 수 있습니다 PCR 반응에 있는 DNA의 농도 증가.
이 프로토콜 추출 애벌레 핀 DNA 애벌레 zebrafish genotypes와 높은 처리 방식으로 정확한 식별을 허용 여러 증폭 반응에 사용할 수 있습니다. Heteroduplex 분석 결과 페이지 젤에 녹는 다른 돌연변이17를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. DNA의 ~ 30 μ는 샘플에 따라 받은 고 ~ 1-1.5 μ DNA의 PCR 반응 당 사용, 추출된 샘플 당 약 30 PCR 반응은 실행할 수 있습니다. PCR 제품은 또한 적합 생어 시퀀싱 응용 프로그램; 읽기의 높은 품질, WT의 정확한 확인 및 aldh7a1를 위한 homozygous 돌연변이 시퀀스 얻은 했다. 애벌레 zebrafish에서 게놈 DNA 추출 연구에 많은 응용 프로그램을 있다. 이 프로토콜을 개발에 대 한 원래 목표 aldh7a19특정 돌연변이 인해 성인에 도달할 수 없는 유전자 형 애벌레 효과적으로 했다. 또한,이 프로토콜 활성화 genotypes의 분리와 특히 애벌레 단계 이후9 aldh7a1-/- 물고기에에서 고기 간 연결의 관측. RNA 추출 등 대사 산물 추출 방법에 대 한 각 유전자 형의 애벌레의 풀링 유전형 클리핑 절차9이 애벌레 지 느 러 미를 사용 하 여 후 정확 하 게 실행할 수 있습니다. 결론적으로, 훈련의 짧은 기간 후 경험된 조사만 최소화 하 고 저렴 한 시 약, 정기적으로 수행 하는 하루 핀 클립의 수백을 요구이 간단 하 고 시간 효율적인 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 가능 하 게 페 냐 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 연구 그리고 잘하면 광범위 한 제 브라 지역 사회에 대 한 유사한 목적을 될 것입니다.

제 브라 (Danio rerio) 척추 생물 치료 가설1,2,3의 전 임상 시험에 관해서는 뿐만 아니라 질병 조사에 대 한 모델으로 널리 이용 되는. 이 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아4DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 소설 유전자 변형, 유전자 기술 등 아연 손가락 nucleases (ZFN)5, 탈 같은 이펙터 Nucleases (TALENs)6,7는 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 편집의 증가 개발을 통해 (CRISPR)을 반복 하는 구조/CRISPR 관련 9 (Cas9) 시스템8, zebrafish는 실질적으로 여러 pathologic 조건의 이해를 향상 시킬 태세 이다. 이러한 기술을 모두 체세포 타겟된 녹아웃을 만드는 데는 그리고 zebrafish, 효율적으로 사악한 유전자에 생식 세포 동물8수정. 최근 문학에서 등이 간 질 및 대사 질환의 유전자 모델의 성공적인 개발 zebrafish3,,910,11,12 .
진전 zebrafish 게놈 편집, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 유전형 명백한 속도-제한 단계 되고있다. 특정 DNA 변이 예측된 게놈 편집 대상 사이트에 인접 한의 식별 프로토콜의 필수 단계입니다. 전통적으로, 지 느 러 미 클리핑에 의해 유전형 기법만 수행된에 청소년 이나 성인 zebrafish는 일반적으로. 그러나, 성인 기에 올리는 zebrafish 보낸 시간 (> 2 개월) 상당히 지연 연구에 있는 전진. 대부분의 경우, 성인 필수 유전자 (예를 들어, 질병 모델링에서) 또는 해로운 phenotypic 효과로 이어지는 이득의 기능 돌연변이의 녹아웃으로 얻을 수 없다. 또한, 여러 분석 실험 등 RNA 또는 대사 산물 추출, 애벌레의 풀링 요구 하 고 따라서 유일한 특별 게시물 유전형 기술을 사용할 수 있는 경우에 도전적 일 수 있다 genotypes의 사전 식별을 포함. 상기 예제 애벌레 유전형 기법을 정확 하 게 동시에 하 고 전체 복구 및 애벌레의 정상적인 발전의 중요성을 강조 표시 합니다. 초기 단계 zebrafish 유전형 표시 되지 않으면 현재 널리 이용 될; 이 애벌레 genotypes 유전형 실험12,,1314의 실행 전에 보다는 사후 유전형을 통해 식별 되는 질병 모델의 최근 간행물에 의해 반영 됩니다. 이 논문에서는, 애벌레 핀 클립 전략 이전 설립된 유전형 절차를 향상을 목표로 제공 됩니다.
과거에는, K 성분을 소화 유전자 형을 채용 하는 전략 라이브 zebrafish 애벌레 변수 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 효율15이어졌다. 더 최근 미세한 꼬리 생 검 기술은 더 유망한 결과16제공 게시, 비록 우리와 다른 그룹 하지 못했습니다 고효율와 저자에 의해 보고 된 DNA 복구를 재현. 윌 킨 슨 외 에 의해 설명 하는 프로토콜의 주요 좌절 16 PCR 튜브에 꼬리 조직의 전송 될 수 있습니다. 미세한 크기로 인해 fin 수집 및 pipetting으로 적절 하 게 제대로 되었음을 보장 하기 어렵다. 이 배리어를 해결 하기 위해 우리는 유전형 거의 1009라이브 zebrafish 애벌레의 큰 숫자에 대 한 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. microscalpel을 사용 하 여, 지 느 러 미 꼬리의 끝은 제거 하 고 필터 종이 조각에 배치. 조직을 포함 하는 필터 종이 쉽게 시각화 하 고 올바르게 PCR 튜브에 배치 수 있습니다. 게놈 DNA 추출 다음 다음 유전자 형 표본에 관심 영역의 PCR 증폭, 수행 됩니다. 이 방법의 장점은 높은 PCR 효율, 낮은 거짓 긍정적인 평가 낮은 사망률을 포함합니다. 또한, 많은 수의 배아의 유전형이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다. 여기에 설명 된 프로토콜 지 느 러 미-클리핑 수백이 접근 및 genotyped 물고기와 2 일 이내 꼬리 재생의 정확한 식별을 사용 하 여 2-3 h 이내 애벌레의 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue-culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25548A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Chelex 100 sodium form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed 1x</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 system</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1704508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper wipes (Kimwipes&#174; disposable wipers)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb-plus molecylar weight marker&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system)</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1704508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping

Zebrafish (Danio rerio) orthologues를 인간의 질병과 관련 된 것으로 알려진 유전자의 84%를 소유한 다. 또한, 이러한 동물 짧은 생성 시간, 쉽게 처리, 저렴 한 비용, 높은 생식 속도 표시 하는 있고 쉽게 배아에서 DNA의 microinjection에 의해 유전자 조작 의무가 있습니다. 최근 발전 도구를 편집 하는 유전자 돌연변이 제 브라에서 transgenes의 정확한 소개를 활성화는 합니다. 종종 zebrafish에 모델링 질병 해석 genotypes 알려지지 않은 경우에 도전적 일 수 있다 이른 죽음과 애벌레 고기 이끌어 낸다. 이 초기 신분의 genotypes 샘플 풀링 요구 하는 실험에 필요한, 진 식 또는 질량 분석 연구 등 이기도 합니다. 그러나, 광범위 한 genotypic 심사 사후 애벌레 또는 성인 zebrafish에만 수행 됩니다 대부분의 실험실에는 전통적인 방법에 의해 제한 됩니다. 우리는 72 h 후 수정 (hpf)로 빨리 달성 될 수 있는 라이브 zebrafish 애벌레에서 PCR 준비 genomic DNA의 분리 하는 방법에 적응 하 여이 문제를 해결. 이 시간 및 비용 효율적인 기술, 이전 게시 된 유전형 프로토콜에서 향상 된 미세한 핀 biopsies에서 genotypes 식별 수 있습니다. 지 느 러 미는 애벌레 개발에 신속 하 게 다시 생성 합니다. 연구원은 선택 하 고이 높은 처리량 PCR 기반 유전형 절차를 이용 하 여 성인 기에 원하는 genotypes을 올릴 수 있습니다.

protocoll의 효율성 유전형에 의해 입증 되었다 heterozygous 십자가의 자손 (aldh7a1+ ot100, aldh7a1+로 여기 표시) (그림 3A-C)9. Aldh7a1ot100돌연변이 체 대립 유전자에 frameshift와 손실의 기능 때문에 이른 정지 codon9zebrafish aldh7a1 유전자의 첫 번째 코딩 exon 5 기본적인 쌍 (bp) 삽입 합니다. 4 개의 뇌관 WT와 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) genotypes heterozygous (aldh7a1+), 구별 3 독특한 밴드를 다중 반응에서 사용 되었다 (페 냐에서 외. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-기능-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', 그리고 "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). Gen1_FW 및 Gen1_RV 뇌관을 사용 하 여 두 대립 유전자의 증폭 434-bp amplicon 귀착되는. 293-bp 밴드는 돌연변이 체 대립 유전자의 특정 증폭에서 발생 그리고 195-bp 밴드는 WT 대립 유전자를 위해 특별히 그림 3A와 같이. PCR, 각 20 µ L 반응 볼륨의 8 µ L를 다음 그림 3B와 같이 1 %agarose / 나트륨 붕 산 염 젤에 분석 했다. 충분 한 애벌레 DNA 98%에서 발견 되었다 (n = 576) 샘플, 효율 높은 PCR 결과의. DNA 추출 NaOH 기술을 사용 하 여 평균 4.7 0.5 ng / µ L의 지 느 러 미 생 검 절차 ~ 30 µ L 볼륨에 따라 샘플 당 애벌레 DNA 얻습니다. DNA 추출 chelating 수 지를 사용 하 여 유사한 수확량, 평균 3.8 0.5 ng / µ L의 DNA 샘플 당 발생 합니다. 이 양의 DNA 애벌레 핀 transections에서 수집 genotypes 식별 수 있도록 충분 한 품질의 PCR 준비 게놈 DNA를 생성 합니다. 각 DNA 샘플 ˜30 PCR 증폭 반응에 사용할 수 있습니다. 시퀀싱 응용 프로그램9, 성공적으로 식별 homozygous 돌연변이 (aldh7a1-/-) (그림 3C에서 5 bp 삽입 증폭 제품 뇌관 Gen1_FW 및 Gen2_RV를 사용 하 여 얻은 사용하실 수 있습니다. ). 생어 시퀀싱 PCR 제품이 응용이 프로그램에 대 한 적합 한 경우 테스트 하는 외부 서비스를 통해 수행 되었다. Agarose 젤에서 DNA 샘플 확인 homozygous 돌연변이 WTs (n = 3 각) 사용 되었다. 높은 Phred19 점수 (> 30) 첫 번째 및 마지막 40 자료 쌍을 제외 하 고 높은 품질 읽기를 나타내는 가져온.
이 프로토콜은 이후 heteroduplex 분석을 용 해 하 여 다양 한 다른 zebrafish 돌연변이 유전자 형을 사용. Plpbp 유전자의 (그림 4A-D) 각 plpbpot101 및 plpbpot102 돌연변이 대립 frameshift 및 이른 정지 codon으로 이어질. Plpbp식별-null zebrafish 애벌레, 2 개의 뇌관 돌연변이 사이트를 포함 하 여 첫 번째 코딩 exon를 증폭 하는 데 사용 되었다 (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 '와 plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'). WT 동물에 plpbp 단편의 증폭 272-bp amplicon (homoduplex)에서 발생합니다. Plpbpot101 (4-bp 삭제 대립 유전자, 그림 4C)에서 얻은 amplicon 268-혈압의 조각 및 plpbpot102 (5bp 대체, 2 bp 삭제 대립 유전자, 그림 4D)의 이루어져 있다 270-혈압, 그림 4A-B에서 보듯이 변성, 어 닐 링 후 PCR 파편 heterozygous 동물에서 heteroduplex 및 homoduplex DNA17포함 됩니다. Homoduplex 및 heteroduplex 밴드 쉽게 분리 될 수 있다 그리고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 사용 하 여 시각. 돌연변이의 발생으로 인해 불완전 한 어 닐 링에 의해 발생 하는 일치 하 고 일치 하지 않는 DNA 물가 사이 오픈 각도의 heteroduplex homoduplex DNA17보다 훨씬 느린 속도로 마이그레이션할 DNA 발생할. 고유한 마이그레이션 패턴 독특한 돌연변이 의해 생산 됩니다. Heterozygous genotypes (plpbp+ ot101, plpbp+ ot102) 따라서 heteroduplex DNA 파편으로 heterozygous 화합물 (plpbpot101/ot102) (그림 표시 4A-B). 정확한 유전형이이 heteroduplex 독특한 페이지 패턴 각 유전자 형을 획득 하 고 뚜렷한 heterozygous 돌연변이 구상 될 수 있다 분석 결과 용 해 (그림 4A-B)에 의해 얻은. Homozygous 돌연변이 페이지 젤에 homoduplex 패턴을 표시 하 고 따라서 WTs를 구별할 수 있을 것. 이러한 genotypes 구별, 페이지 젤 분석의 또 다른 라운드 WT 대립 필요가17설명 되어 있는 대로, 공부 샘플 혼합에서 PCR 제품에서 수행 되어야 합니다.
약 90% (88/98) WT 및 heterozygous 배아를 성공적으로 성인 기에 올렸다 (> 2 개월). Aldh7a1 와 plpbp 는 이른 죽음 표현 형을 표시 하는 손실의 기능 돌연변이, 치료 되지 않는 동물 성인 기에 발생 하지 수 없습니다. 그러나, 모든 살아남은 WT 및 heterozygous 성인 genotypes genotypes 애벌레 핀 생 검 절차를 사용 하 여 식별에 대 한 100% 정확도 비율을 나타내는 애벌레 핀 클리핑 결과 동일 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig1.jpg"> 그림 1입니다. 애벌레 핀 클립. (A). 3 일 후 수정 (dpf)에서 애벌레 핀 비 절단. 라인은 transection, 안료 간격 내에 있는 사이트를 나타냅니다. 검은 화살표 꼬리 혈액 순환의 한계를 보여 줍니다. (B). 유 충 다음 지 느 러 미 3 dpf에서 클리핑 절차. (C). 5 dpf에 애벌레 zebrafish 핀 자라나. 지 느 러 미 재생 blastemal 대형에서 유일한 2 일 후 느 transection을 관찰 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58024/58024fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig2.jpg"> 그림 2입니다. 애벌레 핀 클리핑 절차. (A). 애벌레 테이프에 놓이고 초과 배아 미디어 제거 됩니다. 그림 1A와 같이 현미경, fin 안료 간격의 지역에서 transected은. microscalpel을 사용 하는 지 느 러 미를 수집 하 고 필터 종이에 배치 하면 터치 (B), 표면 및 검은 반점으로 쉽게 구상 될 수 있다. 필터 종이 지 느 러 미를 포함 하 고 원하는 지역 (C)를 둘러싼 작은 정사각형을 잘라. 96 잘 접시 (D)의 우물에는 지 느 러 미를 포함 하는 필터 종이의 작은 조각을 놓습니다. 해당 유 충 배아 미디어 (E)의 200 µ L에서 평면 아래 96 잘 접시의 해당 배치 되어야 합니다. 필터 종이 조각 세포의 용 해 솔루션 (F)에서 침수 한다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58024/58024fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig3.jpg"> 그림 3입니다. 유전형 애벌레 핀 biopsies에서 aldh7a1 heterozygous 십자가의. (A). 예상된 결과 WT 및 aldh7a1ot100 대립 유전자의 증폭 434-bp amplicon에 결과. 293-bp 밴드 (aldh7a1ot100, 5 bp 삽입), 돌연변이 체 대립 유전자의 증폭에서 발생 그리고 195-bp 밴드는 WT 대립 유전자에 대 한. (B). aldh7a1 애벌레 지 느 러 미 조직에서 예의 PCR 증폭. 1 kb 분자량 마커 레인 7에 표시 됩니다. 레인 1-6 각 단일 지 느 러 미 생을 나타냅니다. PCR 결과 확인 aldh7a1-/- (aldh7a1ot100/ot100) genotypes (1 레인) aldh7a1+ heterozygous genotypes (aldh7a1+ ot100) (3, 4, 및 5 차선)와 무게 ( aldh7a1+ +) genotypes (레인 2, 6)입니다. (C). 정렬 시퀀스 WT 5 bp 삽입 돌연변이의 위치를 보여주는 aldh7a1ot100 대립 유전자 사이. 이 수치는 페 냐 외 의 보충 그림 5에서 적응 시켰다 9 미국의 유전학 사회에서 부여 하는 권한이 있는. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58024/58024fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig4.jpg"> 그림 4입니다. Plpbp 의 유전형 heterozygous (2 bp 삭제/4 bp)에서 삭제 애벌레 핀 biopsies 복합. (A). 예상된 결과 WT 대립 유전자의 증폭 272-bp amplicon에 결과. 4 혈압 삭제 대립 유전자 (plpbpot101)와 2 혈압 삭제 대립 유전자 (plpbpot102)와 5-bp 대체 각각 amplicon 길이 268-혈압과 270-bp의 생산. heteroduplex WT 대립 유전자 (plpbp+) heterozygous 유전자에 돌연변이 체 대립 유전자 사이 형성 된다. 대립 유전자 일치 때문에 heteroduplex의 형성 WT homoduplex에 비해 젤 내의 악대의 지체가 될 수 있습니다. (B). PCR 확대의 자손의 애벌레 핀 잘라낸에서 결과 plpbp+ ot101x plpbp+ ot102 십자가. 1 kb 분자량 마커 레인 1에 표시 됩니다. 차선 2-10 각 단일 지 느 러 미 생을 나타냅니다. PCR 결과 식별 돌연변이 genotypes (plpbp-null 복합 heterozygous plpbpot101/ot102, 2, 4, 및 8 차선), heterozygous genotypes (3, 6, 7, 9, 및 10 차선)와 WT genotypes (5 레인). (C). 시퀀스 WT 및 4-bp 삭제 돌연변이의 위치를 보여주는 plpbpot101 대립 유전자 사이의 정렬. (D). 정렬 시퀀스 WT (굵게) 2-혈압 삭제 및 5 bp 대체의 위치를 보여주는 plpbpot102 대립 유전자 사이. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58024/58024fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>20 μ 반응</td>
			<td>100 반응</td>
			<td>최종 하자마자</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nuclease 무료 H2O</td>
			<td>7.45 Μ</td>
			<td>745 Μ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>이동-Taq 2 (Promega, M7122) x</td>
			<td>10 Μ</td>
			<td>1000 Μ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 Gen1_FW</td>
			<td>0.25 Μ</td>
			<td>25 Μ</td>
			<td>0.125 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 5 nt-기능-specific_FW</td>
			<td>0.3 Μ</td>
			<td>30 Μ</td>
			<td>0.15 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 Gen2_RV</td>
			<td>0.25 Μ</td>
			<td>25 Μ</td>
			<td>0.125 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 WT-specific_RV</td>
			<td>0.25 Μ</td>
			<td>25 Μ</td>
			<td>0.125 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>1.5 Μ</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 멀티플렉스 PCR에 사용에 대 한 반응 조건에서 aldh7a1 이 프로토콜에서 대립 유전자. 사용 하는 뇌관은 다음과 같습니다: Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3', "Gen2_RV": 5'-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3', "5 nt-기능-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3', 그리고 "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. 뇌관 주식 10 µ M 이었다입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>13 μ 반응</td>
			<td>100 반응</td>
			<td>최종 하자마자</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>3.25 Μ</td>
			<td>325 Μ</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>이동-Taq 2 (Promega, M7122) x</td>
			<td>6.25 Μ</td>
			<td>625 Μ</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 FW</td>
			<td>1 Μ</td>
			<td>100 Μ</td>
			<td>0.77 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 RV</td>
			<td>1 Μ</td>
			<td>100 Μ</td>
			<td>0.77 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>1.5 Μ</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. PCR에 사용에 대 한 반응 조건 plpbp 이 프로토콜에서 대립 유전자. 앞으로 뇌관을 사용 했다 PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 '와 반대로, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3'. 뇌관 주식 10 µ M 이었다입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>사이클 단계</td>
			<td>임시입니다.</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>초기 변성</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>3 분</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>변성 시키기</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>30 초</td>
			<td rowspan="3">36</td>
		</tr>
<tr>
<td>어 닐 링 *</td>
			<td>° C X</td>
			<td>30 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>확장</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>20 초/kb</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">마지막 확장</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>5 분</td>
			<td rowspan="2">1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>보류</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3입니다. 이 프로토콜에 사용 되는 PCR 조건.

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High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

13.9K 조회수.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

연구

유전학

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (LC/ESI-MS) is described. DNA extraction is carried out using a silica membrane-based DNA extraction kit. After the PCR amplification using a detergent-free PCR buffer, restriction enzymes are added to the solution without purifying the reaction solution. A reverse-phase silica monolith column and a Fourier transform high resolution mass spectrometer having a modified Kingdon trap analyzer are employed for separation and detection, respectively. The mobile phase, consisting of 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, 15 mM triethylamine (pH 7.9) and methanol, is delivered at a flow rate of 0.4 ml/min. The cycle time for LC/ESI-MS analysis is 8 min including equilibration of the column. Deconvolution software having an isotope distribution model of the oligonucleotide is used to calculate the corresponding monoisotopic mass from the mass spectrum. For analysis of oligonucleotides (range 26-79 nucleotides), mass accuracy was 0.62 &#177; 0.74 ppm (n = 280) and excellent accuracy and precision were sustained for 180 hr without use of a lock mass standard.

An improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method for genotyping pufferfish species by liquid chromatography/mass spectrometry is described. A reverse-phase silica monolith column is employed for separating digested amplicons. This method can elucidate the monoisotopic masses of oligonucleotides, which is useful for identifying base composition.

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...