이 일 병 리의 부, J.C.S.B.에 유타 대학에서 시작 그랜트에 의해 지원 되었다

1. 식별 오버랩2 방법 (O2M)에 의해 화학 유전학 Dataset에서 시너지 예측 돌연변이
참고: 이것은 시너지 예측 돌연변이 니콜스 외에서 게시 된 데이터 집합을 사용 하 여 식별 하기 위한 방법입니다. 대장균에서 17 . 그러나,이 모든 화학 유전학 dataset 및 미생물에 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터 세트의 녹아웃 돌연변이 100 개 이상의 작은 분자의 성장 각 작은 분자에 각 돌연변이 대 한 양적 성장 점수를 주는 라이브러리 포함 되어 있습니다. 1 개의 상승 쌍을 알고 있어야 합니다, 그리고 성장 점수는 데이터 집합에 포함 된 두 작은 분자에 대 한 되어야 합니다.
<ol><li>
모든 돌연변이 각 작은 분자의 단일 농도의 성장에 대 한 평균 성장 점수와 표준 편차를 계산 합니다. 참고:이 수행할 수 있는 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여. 브라운 실험실을 사용 하 여 Excel 기능 =AVERAGE(B3:B3981)와 작은 분자의 열 각의 계산에 대 한 =STDEV(B3:B3981).<ol>
<li>다른 데이터 집합을 사용 하는 경우이 방향이 다를 수 있지만 의미 및 작은 분자의 각 열에서 표준 편차를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>니콜스 외에서 동일한 데이터 집합을 사용 하 여 작은 분자의 각 농도 대 한 Z 점수를 계산 합니다. 스프레드시트 프로그램에서 17 . 이 대 한 음수 z 점수 Z(2.5) 것 = 의미-2.5 * 표준 편차, 그리고 긍정적인 z 점수 Z(2.5) 것 = 평균 + 2.5 * 표준 편차.</li>
	<li>어떤 유전자 돌연변이 포함 되 고 확실 하 게 그 분자의 모든 농도에서 알려진된 시너지 쌍을 구성 하는 작은 분자의 중요 한 Z 점수를 결정 합니다. 음수 Z (2.5) 보다는 작은 성장 돌연변이의 점수는 점수 또는 그 작은 분자에 대 한 긍정적인 Z (2.5) 점수 보다 큰, 그것은 중요 한 간주 됩니다.</li>
	<li>중요 한 유전자 돌연변이의 한 오 페론에 속하는 경우 결정 합니다. 참고: 대장균, 저자 추천 "Ecoli 위 키" 정보에 대 한 검사에 관한 유전자는 polycistronic RNA의 일환으로 복사할 경우.</li>
	<li>다른 농도 작은 분자의 대부분에 공통 된 유전자/오 페론 돌연변이 식별 (예. 항생제 trimethoprim와 synergize 분자 식별 표시 중요 한 Z 돌연변이 찾고 때, 점수 trimethoprim와 sulfamethizole 또는 sulfamethoxazole와 같은 알려진된 시너지 파트너의 성장 하는 때). 이들은 상 상속 시너지 예측 돌연변이입니다.</li>
</ol>2. 예측 O2M에 의해 화학 유전학 데이터 집합 내에서 Synergizers
<ol><li>데이터 집합17되돌립니다 시너지 예측 돌연변이에서 상당한 성장 점수를 elicits 작은 분자의 각 농도 식별 합니다. 이것은 작은 분자의 각 농도 대 한 계산 된 Z 점수 보고에 의해 이루어집니다. 다시 말하지만, 상당한 성장 점수는 부정적인 Z 점수 보다 보다 작거나 작은 분자의 그 농도 대 한 긍정적인 Z 점수입니다. 참고: 분자의 농도 중도에 나타납니다, 분자 예측된 synergizer를 간주 됩니다. 중요 한 성장 점수를 유도 하지 않는 어떤 분자 예측된 비-synergizer입니다.</li>
</ol>3입니다. 예측된 시너지 상호 작용의 유효성 검사
<ol><li>예측 된 synergizers의 최소 억제 농도 (MIC)를 찾는.
	<ol>
<li>37 ° c.에 M9 최소한의 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장 참고: 모든 숙박 문화 관심의 유기 체에 대 한 적절 하 게 정의 된 매체에서 자란 수 있습니다. 브라운 실험실 파운드 또는 YPD 같은 리치 미디어를 권장 하지 않습니다. M9 최소한의 미디어 10.5 g/L M9 국물, 0.2 %casamino 산, 0.1 m M CaCl2, 0.4% 포도 당, 1 M MgSO4, 0.25% 니코틴산 산, 및 이루어져 H2o. 티 아민 0.33%</li>
		<li>마이크 데이터의 병원 체 작은 분자를 받으면 문학에서 발견 분해 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 높은 농도에서 하는 경우 (> 10 mg/mL).</li>
		<li>96 잘 접시를 사용 하 여 각 우물에 M9 미디어의 100 µ L를 추가 합니다. 그래서 200 µ L의 총 포함 열 1에서에서 M9 미디어의 추가 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>열 1에에서 집중 된 작은 분자 솔루션의 임의의 금액 (~ 10 µ L)를 추가 합니다. 열 1 (접시 당 8 작은 분자)의 당 하나의 작은 분자. 참고: 이들은 synergize 것으로 예측 하는 관심, 작은 분자입니다. 갈색 연구소는 일반적으로 대장균을 억제할 수 있는 100 %DMSO 금액은 매우 집중된 작은 분자 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>일단 작은 분자를 추가 접시의 x 축에 걸쳐 작은 분자를 희석. 열 1에서에서 솔루션의 100 µ L를가지고, 열 2에에서 놓고 혼합 합니다. 열 2에서에서 100 µ L를 받아 3 열에 놓고 혼합 합니다. 100 µ L 11 열에 배치 됩니다 때까지이 과정을 계속 합니다. 열 11 섞으십시오, 그렇다면 해당 열에서 100 µ L 고 버리고. 데이터 정규화를 그냥 미디어에 열 12 두고.</li>
		<li>접시 접종 야간 문화에서 광학 밀도를 (OD600)를 가져옵니다. 문화와 OD600 0.002의 M9 미디어 솔루션 준비 (또는 적절 한 농도의 원하는 유기 체에 대 한 500 세포 / µ L를 나타내는). 그래서 잘 당 1000 셀 문화 솔루션의 2 µ L 플레이트의 각 음에 플라스틱.</li>
		<li>부드럽게 접시를 흔들어 하 고 읽고 0 h의 OD600 . 37 ° C 24 h. 얻기 읽기 24 h에 대 한 OD600 에서 성장 플레이트를 하자. 참고: 적절 한 사용 조건 다른 유기 체에 대 한 관심의 증가.</li>
		<li>잘 사용 하 여 각 스프레드시트 프로그램에 대 한 net 성장을 계산 합니다.</li>
		<li>평균 평균 약 성장이를 열 12의 순 성장. 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 마약 성장이의 평균에 다른 우물을 정상화. 10% 미만으로 어떤 잘 봐는 MIC90를 식별 하는 성장. 어떤 50% 미만으로 잘 성장은 MIC50를 나타냅니다. 그 우물에 작은 분자의 농도 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>공동 성 상호 작용에 대 한 분석 실험 바둑판
	<ol>
<li>앞으로 M9 최소한의 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장. 참고: 적절 한 사용 조건 다른 유기 체에 대 한 성장.</li>
		<li>96 잘 접시 및 열 1에에서는 여분의 100 µ L의 각 음에 M9 미디어의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>추가 테스트 작은 분자 (~ 8 마이크 x) 각 열 1에서에서 잘 하 고 두 배 농도 추가 (~ 16 마이크 x) 잘 a 1를 (접시 당 1 개의 작은 분자 테스트). 참고:이 금액에서 마이크 테스트 완료 사전 결정 되 고 각 잠재적인 synergizer에 대 한 다릅니다.</li>
		<li>열 1에서에서 100 µ L를 복용 하 고 열 2 전송 하 여 x 축에 그라데이션 희석을 만듭니다. 100 µ L 열 11에 추가 될 때까지이 과정을 계속 합니다. 혼합, 그렇다면 열 11에서에서 100 µ L 고 처분. 열 12 (그림 1A)에 어떤 약물을 추가 하지 마십시오.</li>
		<li>입력된 약물에 대 한 y를 통해 두 번째 약물 그라디언트를 설정 합니다. 추가 행 A. 혼합 입력된 분자의 마이크와 행 A와 B. 계속 100 µ L 행 G. 믹스에에서 배치 될 때까지 배치에서 앞으로 희석, 100 µ L x 2를 포함 하는 미디어의 100 µ L, 100 µ L 고, 보장 하지 행 헤에에서 어떤 입력된 약물을 추가 하려면 행 높이 및 열 (그림 1B) 테스트 마약 쌍의 개별 마이크 포함 12 수 있습니다.</li>
		<li>접시 접종 각 잘 (당 잘 1000 셀)를 세600 0.002의 대장균 문화의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>OD600 0 h 읽기에 대 한 접시에 각의 측정.</li>
		<li>37 ° c.에 24 h에 대 한 접시를 품 어</li>
		<li>OD600 24 h의 각을 측정 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>닦아내기에서 소수 억제 농도 인덱스 (FICI)을 계산
	<ol>
<li>접시의 각 잘 순 성장 OD600 스프레드시트 프로그램에서 24 시간에 0 h에서 OD600 을 빼서 계산 합니다.</li>
		<li>더 작은 분자를 포함 각 잘에 의해 잘 H12 나누어 소프트웨어에 성장을 표준화 됩니다.</li>
		<li>열 12 입력된 분자의 MIC90 및 잠재적인 의존적인 행 H. MIC90</li>
		<li>90%의 성장 억제 하는 모든 우물을 찾습니다.</li>
		<li>물론 그 중 하나는 낮은 (시너지) 아래에 대 한 FICI90를 계산 또는 (대립) 위의 높은 방정식을 사용 하 여 두 MIC90 값: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>어떤 FICI ≤ 0.5로 시너지 고려 및 FICI ≥ 4 대립 (그림 2). 참고:이 또한 행 해질 수 있다 MIC50와 (성장의 50% 저해) MIC 값에 기반 하는 FICI50를 얻을.</li>
	</ol></li>
	<li>블 리스 독립 분석 결과 참고: 블 리스 독립 자체에 마이크 하지 않은 어떤 잠재적인 의존적인 함께 실행 됩니다.<ol>
<li>이전 처럼 37 ° C에서 M9 미디어에서 대장균 의 숙박 문화를 성장. 참고: 다시, 관심의 다른 유기 체에 대 한 적절 한 성장 조건 사용할 수 있습니다이 단계에서.</li>
		<li>잠재적인 시너지 분자, 입력된 분자, 조합, 및 치료 비 제어를 테스트 하기 위해 96 잘 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>각 우물에 M9 미디어의 50 µ L을 추가 하 여 잠재적인 의존적인 접시를 만듭니다. 행의 각 음에 잠재적인 synergist의 설정된 농도 (10 µ M 또는 100 µ M)를 포함 하는 미디어의 50 µ L를 추가 합니다. 접시 당 8 분자를 테스트 합니다.</li>
		<li>각 우물에 미디어의 50 µ L을 추가 하 여 입력된 분자 접시를 만듭니다. 50 µ L 4 x 포함 된 추가 열 1에 있는 각 음을 입력된 약물의 마이크. X 축 따라 그라데이션 희석 마이크 번호판, 열 1에서에서 50 µ L를 복용, 분산 및 혼합 열 2에서에서 비슷한 만듭니다. 열, 12 열 12에서에서 50 µ L를 폐기 때까지이 과정을 계속 합니다. 추가할 미디어의 추가 50 µ L 각 잘 각 잘 끝 총 100 µ L 이므로.</li>
		<li>96 잘 접시를 사용 하 여 조합 접시 만들기, 각 잘을 미디어의 50 µ L를 추가 합니다. 50 µ L 4 x 포함 된 추가 열 1에 있는 각 음을 입력된 약물의 마이크. 마이크 번호판, 열 1에서에서 50 µ L를 복용, 분산 및 혼합 열 2에서에서 비슷한 x 축을 따라 희석. 이 열, 12 열 12에서에서 50 µ L를 처분 하는 길 내내 계속 합니다. 50 µ L 10 µ M 또는 100 µ M는 행의 각 음에 잠재적인 의존적인 포함 된 미디어를 추가 합니다. 또, 하나의 농도 또는 행 당 약 이어야 한다.</li>
		<li>접시의 모든 우물을 M9 미디어의 100 µ L을 추가 하 여 처리 되지 않은 컨트롤을 만듭니다.</li>
		<li>앞으로 각 잘 하 0.002 또는 1000 셀의 OD600 와 세균성 문화 2 µ L을 추가 하 여 모든 접시를 예방.</li>
		<li>0과 24 시간에서 각의 OD600 을 측정 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>블 리스 독립 점수 계산
	<ol>
<li>접시의 각 잘 순 성장 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여 24 시간에 성장에서 0 h에서 OD600 을 빼서 계산 합니다.</li>
		<li>스프레드시트 프로그램에서 아무 약물 접시에서 평균 성장에 우물을 정상화.</li>
		<li>스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 빼면 1에서 net 성장 저해를 계산 합니다.</li>
		<li>평균만 입력된 그라데이션 스프레드시트 소프트웨어에 포함 된 컨트롤 플레이트에 열.</li>
		<li>방정식으로 각 잘 행복 점수 계산: 행복 점수 = (잘 X + 입력된 열 X) -잘 X 결합
</li>
		<li>웰 스는 입력의 MIC90 아래에 부정적인 점수에 대 한 보세요. 참고: 여러 농도 걸쳐 부정적인 점수는 공동 성 상호 작용을 나타내는 것 이다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 높은 처리량 화면 시너지 예측 돌연변이 소설 시너지 쌍을 확인 하려면
<ol><li>
시너지 예측 돌연변이 확인 참고: 단계 1.5 putative 시너지 예측 돌연변이 확인. 여기, 우리는 이러한 돌연변이의 시너지 약물에 대 한 높은 처리 화면에서 최고의 작동 합니다 결정 합니다. 우리 Bioscreen 기계에서이 분석 결과 수행 하지만 96 잘 접시 독자 또한 허용 해야 한다.<ol>
<li>각 상 상속 시너지 예측 돌연변이 야생-타입 셀 M9 최소한의 미디어에 있는 성장.</li>
		<li>100 설정 잘 플레이트 (또는 96 잘 접시) 적절 한 성장 매체, 성장 매체 + 입력된 마약, 성장 매체 + 입력된 마약, 그리고 성장 매체 + 알려진된 비 시너지 약물의 알려진된 시너지 파트너에 벌집. 차량 컨트롤을 포함 하도록 확인 하십시오. 참고: 4 각 스트레인/마약/농도 대 한 웰 스 복제 것이 좋습니다.</li>
		<li>잘, 빈 제어 웰 스를 포함 하 여 당 1000 셀 접종</li>
		<li>떨고와 37 ° C에서 48 h를 성장 하 고 읽고 OD600 매 20 분.</li>
		<li>가장 큰 성장 사이의 차이 보여줍니다 야생-타입 및 시너지 예측 입력된 약물 및 알려진된 시너지 파트너의 존재 돌연변이 세포 약물 농도 시간 포인트를 결정 합니다. 최적의 시간 포인트와 농도, 거기 해서는 안됩니다 많은 성장 차이 야생-타입 및 시너지 예측 돌연변이 세포 입력된 약물 (그림 3)와 함께 공동 성으로 행동 하지 알려진 약물의 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시너지 약물에 대 한 높은 처리 화면
	<ol>
<li>야생-타입 세포와 M9 최소한의 미디어에서 시너지 예측 돌연변이 세포 성장. 참고: 적절 한 성장 매체를 사용 하 여 관심의 유기 체에 대 한.</li>
		<li>라이브러리에서 미디어 그래서 각 100 µ L 미디어는 이전 단계에서 확인은 설정된 농도에 작은 분자를 포함 하는 잘 된 약물을 추가 합니다. (셀) 없이 빈 우물과 우물 차량 컨트롤 포함 (e.g., DMSO) 약물 희석 차량 어떤 성장 저해에 대 한 계정.<ol>
<li>접시, 이상적으로 흩어져 있는 잘 위치 효과 대 한 계정에 접시 당 적어도 4 개의 차량 제어 웰 스를 준비 합니다. 분석은 변수, 다음 행/열 당 잘 하나 이상 차량 제어를 포함 하 고 뿐만 아니라 컨트롤 각 행/열 제어를 사용 하 여 각 행/열 대신 전체 접시 (단계 4.2.5)에 대 한 Z 점수를 계산 하.</li>
		</ol>
</li>
		<li>앞으로 각 잘에 문화의 2 µ L를 추가 합니다. (야생 타입 박테리아와 예측된 시너지 돌연변이 박테리아에 대 한 하나의 플레이트 한 격판덮개).</li>
		<li>C. neoformans에 대 한 0과 18 h 대장균 또는 48 h에 OD600 을 평가 합니다.</li>
		<li>스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 차량 제어 우물에서 빈 우물의 OD600 빼서 그물 성장 계산. Z-점수가-2.5의 웰 스를 식별 (Z 점수 = 평균-2.5 * 표준 편차). 이 우물에는 잠재적인 의존적인 작은 분자 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>3 단계에서 설명한 방법을 사용 하 여 화면 안타를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Hsp90+Genetic+Interaction+Network+in+Candida+albicans+Reveals+Environmental+Contingency+and+Rewired+Circuitry.">Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry.</a> PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).</li><li>Robbins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Antifungal+Combination+Matrix+Identifies+a+Rich+Pool+of+Adjuvant+Molecules+that+Enhance+Drug+Activity+Against+Diverse+Fungal+Pathogens.">An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens.</a> Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).</li><li>Wildenhain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Synergism+from+Chemical-Genetic+Interactions+by+Machine+Learning.">Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning.</a> Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).</li><li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole.">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

시너지 작은 분자 쌍 미생물 감염을 치료에 강력한 도구가 될 수 있습니다 아직 시너지 쌍을 식별 하는 도전 때문에 그들은 그들의 전체 임상 잠재력을 도달 하지 않은. 이 문서에서는 간단한 없음을 조합 보다 훨씬 빠르게 상승 쌍을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 화학 유전학 데이터 집합을 사용 하 여 O2M 다음 시너지 쌍을 예측 하기 위해서는 화면 큰 라이브러리 작은 분자의 판독으로 사용 될 수 있는 유전자 knockouts와 돌연변이 식별 합니다. 작은 분자를 예측 하는 능력에 시너지 파트너의 대규모 식별에 게 스크린, 높은 확장성에 대 한 수 있습니다. 확인 후 시너지 쌍, 명료 하 게 하는 분자 메커니즘 기본 시너지 상호 작용, 다음 합리적으로 디자인 추가 시너지 쌍11수 하나.
O2M 화학 유전자 데이터 집합 및 알려진된 시너지 쌍을 필요합니다. 다행히, 화학 유전학 데이터 집합은 다양 한 미생물19,,2021에 대 한 일반적 이다. 브라운 실험실 이전 O2M 성공적으로 C. neoformans 및 대장균11,12시너지 쌍을 찾을 수 있다고 설명 했다. 이 광범위 한 영향 O2M 다양 한 생물에 광범위 하 게 적용 되는 확장 가능한 방법으로는 보여 줍니다. 여기에 나열 된 모든 단계는 비교적 비슷한 결과, 따라서 만들기 O2M 시너지 쌍의 일반 id에 대 한 유용한 도구와 다른 미생물의 성장에 대 한 변경할 수 있습니다. 다른 여러 그룹 O2M 이러한 방법 중 하나 이상 프로그래밍 지식이 필요 하지만 다른 분석 방법으로 시너지 조합 화학 유전학 데이터 집합에서 식별 됩니다. 각 메서드는 시너지 항생제 또는 antifungals 18,,2223,24, 제안 많은 시너지 쌍 발견 남아의 다른 세트를 식별 합니다. O2M 및 다른 시너지 예측 방법 또한 잠재적으로 암 약물 조합을 식별을 포함 한 포유류 시스템에 적용 됩니다.
합계에서는, 화학 유전학 데이터 집합에서 시너지 쌍에 대 한 화면을 빠르게를이 방법에 설명합니다. 이 방법은 다른 시너지 쌍 클리닉에 더 가능한 치료 옵션이 될 도움이. 또한, O2M의 신속 하 고 일반적인 방법 증명 한다 그것은 유용한 도구가 시너지 작은 분자 쌍 추구 때.

항생제 내성 박테리아 발생할 2 백만 이상의 감염과 23000 죽음 매년 CDC1에 따르면 미국에서. 새로운 치료는 이러한 감염을 극복 하기 위해 필요 하다. 이러한 새로운 치료를 식별 하는 전략에는 새로운 항균 약물의 개발 이나 작은 분자 치료 미생물 감염2,,34다른 조건에 대 한 승인의 재사용 포함 됩니다. 그러나, 새로운 약물의 발견은 매우 비싸고 시간이 많이 소요. 마약을 재사용 소설 마약을 식별할 수 있습니다 또는 약물 대상5,6. 우리의 실험실 시너지 조합 치료로 알려진 세 번째 전략에 초점을 맞추고. 시너지 조합 두 작은 분자는 함께 그들의 개별 신진대사7의 첨가제 효과 보다는 효능을가지고 하는 경우 발생 합니다. 또한, 시너지 조합 큰 잠재적인8,9, 렌더링 덜 원치 않는 오프 대상 효과 이외 쌍에 있는 작은 분자 중에 병원 체 저항에 대 한 효과가 될 수 있습니다. 10.
시너지 쌍 드물다, 약물 조합11,,1213의 약 4-10%에서 발생. 따라서, 인덱스도 스크린 등 전통적인 기술 도전과 백 분자의 작은 도서관에서 잠재적인 조합의 수천 시간이 있습니다. 또한, 공동 성 상호 작용 일반적으로 예측할 수 없습니다 화합물14의 활동에서. 그러나, 저자 오버랩2 방법 (O2M)12라는 시너지 쌍에 대 한 화면에 대 한 높은 처리 접근을 개발 했다. 여기서 설명 하는이 방법을 이러한 시너지 쌍의 빠르고, 보다 효율적인 식별 수 있습니다. O2M 알려진된 시너지 쌍 및 화학 유전학 데이터 집합 사용을 해야합니다. 녹아웃 돌연변이의 도서관은 많은 다른 작은 분자의 성장 하는 때 화학 유전학 데이터 집합 생성 됩니다. 그 같은 돌연변이에서 표현 형을 elicits 다른 작은 분자 알려진의 각 멤버와 또한 synergize 해야 경우 알려진된 시너지 쌍에서 한 분자 두 번째 시너지 분자 처럼 특정 녹아웃 돌연변이에서 동일한 표현 형을 유도, 시너지 쌍입니다. 이 근거 시너지 항생제 쌍 대장균 (대장균) 에 대 한 활성 및 병원 성 균 류 Cryptococcus neoformans (c.에 대 한 활성 시너지 항진균 약물 쌍을 식별 하는 갈색 실험실에서 사용 되었습니다. neoformans)11,12. O2M만 다양 한 병원 균에 대 한 적응력은 하지만 쉽고 빠르게 상승 쌍을 확인 하려면 분자의 큰 도서관의 심사에 대 한 수 있습니다. O2M 식별 유전자 돌연변이와 심사 시너지에 대 한 예측만 그 작은 분자를 확인 하기 위해 수 있습니다. 따라서, 쌍 2000 분자 라이브러리를 테스트 걸릴 것 이라고 개월, 반면에 있던 경우에 20 분자 synergize 것으로 예측 하는 해당 라이브러리에서 일의 문제가 걸립니다 지금은 시너지에 대 한 테스트. O2M 프로그래밍 기술, 필요 하지 않습니다 이며 필요한 장비 대부분 연구소 나 핵심 시설에서 사용할 수 있습니다. 연구팀은 약물 조합에 관심이, 뿐만 아니라 O2M 분석 약 화면을 완료 하 고 중요 한 약물-약물 상호 작용을 식별 하 여 그들의 명 중을 확장 하 고 싶어 누가 누구에 게 관심입니다. 아래는 박테리아, 시너지 작은 분자 식별로 잘 알려진 분석15,16예측된 공동 성 상호 작용을 확인 프로토콜이입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

항균 약물 극적으로 증가 수명과 삶의 질20 세기에서 비록 항균 성 저항 조직의 감염을 치료 하는 우리의 전체 사회 능력을 위협 한다. 년 및 비용 추가 건강에 약 20 십억 달러는 미국에서 혼자, 항생제 내성 감염 약 23000 명 죽 일. 항균 성 저항에 대처 하기 위해 한 가지 방법은 조합 치료, 감염의 중요 한 초기 단계에 특히 유용 하다 전에 감염 유기 체와 약물 저항 프로필 확인 되었습니다입니다. 많은 항균 성 치료는 조합 치료를 사용합니다. 그러나,이 조합은 대부분의 첨가물, 결합 된 효능은 개별 항생제 효능의 합계와 같은 의미. 일부 조합 치료는 시너지: 결합 된 효능 첨가제 보다 훨씬 큽니다. 때문에 그들은 항균 약물 저항 종자의 성장을 억제할 수 있는 시너지 조합은 특히 유용 합니다. 그러나, 이러한 조합은 희귀 하 고 식별 하기 어려운 있습니다. 이것은 없음을 방식으로 테스트 하는 데 필요한 분자의 완전 한 숫자 때문 이다: 1000 분자의 도서관은 1 백만 잠재적인 조합. 따라서, 시너지 효과 대 한 분자를 예측 하기 위해 노력 되었습니다. 이 문서에서는 중복2 방법 (O2M)로 알려진 시너지 작은 분자 쌍을 예측에 대 한 우리의 높은 처리량 방법. O2M 화학 유전자 데이터 집합에서 사용 하 여 과민 시너지 쌍에서 각 분자를 하지만 다른 분자는 돌연변이 식별. 브라운 실험실 돌연변이 하지 야생-타입 세포의 성장을 억제 하는 분자에 대 한 높은 처리 화면을 수행 하 여이 성장 차이 이용 한다. 실험실의 작업은 이전 항생제 trimethoprim와이 전략을 사용 하 여 항진균 약물 fluconazole synergize 분자 식별. 여기, 저자 여러 미생물에 대 한 변경 될 수 있습니다 새로운 시너지 조합에 대 한 화면을 방법 제시.

바둑판 분석 실험은 공동 성 상호 작용을 측정 하기 위한 반 정량 방법. 최종 점수 출력, FICI, 결정 약물 조합 시너지 (FICI ≤0.5)으로 간주 됩니다, 만약 비-상호 작용 (0.5 < FICI < 4), 또는 대립 (FICI ≥4.0). 그림 1 에 바둑판 분석 결과에서 마약 그라디언트를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 일반적인 결과를 보여 줍니다. 성장을 (보라색 우물) 90% 성장 억제 보다 적게 표시 하는 것이 좋습니다. 각 접시에서의 OD600 , 측정 후 우리 정상화는 마약 통제에 모든 잘. 정규화 된 값으로 아무것도 > 0.1 (10% 잘 컨트롤의 OD600 의) "성장"으로 점수입니다. FICI 점수 다를 수 있습니다에 따라 잘 고른 이다; 우리는 각 접시에 대 한 낮은 FICI를 주는 잘을 선택 합니다. 그림 2A, 잘 F9 (열 번호가 매겨집니다, 글자 행) 될 것 이라고, 그는 FICI와 0.07 =. 그림 2B는 FICI 잘 c 3에서 계산 (FICI = 1.0). 반목 상호 작용에 대 한 가능한 가장 높은 FICI 점수를 찾고 있습니다. 그림 2C에 FICI 8.0 FICI에 게는 잘 a 1에서 계산 됩니다.
최적의 검사 조건 시간과 비용을 저장 하는 화면에서 잘못 된 반응의 높은 숫자를 막을 것 이다. 우리가 시너지 예측 돌연변이 균 Cryptococcus neoformans에 대 한 최적화, 우리가 입력된 약 (fluconazole), 4 개의 알려진된 비 시너지 약물 (카페인, climbazole, trimethoprim, 및 brefeldin A), 및 5 fluconazole의 테스트 시너지 파트너 (rifamycin, myriocin, nigericin, rapamycin, FK506 Chandrasekaran, S. 외. 에서 설명한 모든 18). O2M 분석 (섹션 1과 2), 우리는 선택적으로 시너지 예측 돌연변이 세포만 아니라 야생-타입 세포의 성장을 억제 하기 위해 알려진된 synergizers 예상을 통해 이러한 분자 발견 이후. 예상된 성장 차이 최대화 하기 위해 대부분의 하위 했다 각 작은 분자에 대 한 농도의 범위를 테스트 했습니다.
예를 들어 결과 그림 3에 표시 됩니다. 행동 하지 않는다 synergistically fluconazole, brefeldin A, 저해 야생-타입 및 시너지 예측 돌연변이 성장만 약간 분자 그리고 대략 동일한 금액. Rifamycin (그림 3B), 시너지 예측 돌연변이 (cnag_03917Δ)의 성장을 저해 했다 하지만 야생-타입 세포 성장 했다. 최고의 성장 차이 32와 49 h 후 접종, 심사에 대 한 timepoint 이었습니다이 범위 사이 했다. 다른 시너지와 시너지 비 분자의 성장 곡선 닮은 rifamycin과 brefeldin, 각각.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig1.jpg"> 그림 1 : 3 단계에서 분석 결과 바둑판의 묘사. 시험 약물 및 입력 마약 그라디언트에 설명 된다 A 그리고 B, 각각. 최종 분석 결과 플레이트 C. 같이 나타납니다 <a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig2.jpg"> 그림 2 : 바둑판 분석 결과의 그래픽 결과. 시너지, 삽화 없음, 대립 상호 작용에서 묘사 되 고 A, B, 및 C, 각각. <a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig3.jpg"> 그림 3 : 상영 시간을 식별 하기 위한 예제 데이터. (A) 야생-타입 (녹색) 그리고 하지 fluconazole을 synergize 알려진 brefeldin A, 작은 분자의 성장 C. neoformans 의 시너지 예측 돌연변이 (파란색). 야생-타입 컨트롤 (진한 녹색) 및 약물 치료 (밝은 초록색) 시너지 예측 돌연변이 제어 (진한 파란색) 및 약물 치료 (밝은 파란색) 성장에 유사한 차이가 있다. (B) 야생-타입 및 시너지 예측 돌연변이 fluconazole을 synergize 알려진 rifamycin, 작은 분자의 성장. 야생-타입 컨트롤 (진한 녹색) 및 약물 치료 (밝은 초록색) 시너지 예측 돌연변이 (진한 파란색)과 약물 치료 (밝은 파란색) 보다 더 작은 성장 차이가 있다. 가장 큰 차이 알려진된 시너지 분자에 대 한 48 h에 관찰 하 고 차이점은 알려진된 비 시너지 분자에 대 한 해당 시간 점에서 유사. <a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K 조회수.  University of Utah. 시너지 마약 조합은 어렵고 경험적으로 확인할 수 있다. 여기, 우리는 식별 하 고 시너지 작은 분자를 확인 하는 방법을 설명 합니다.

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

연구

유전학

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...