이 작품 A.B. 부여 NIH GM117446에 의해 지원 되었다

1. 셀에 대 한 준비 흐름 Cytometry 정렬
<ol><li>15 mL 문화 하룻밤 성장 후 1.5 mL 당 107 셀 x 5 x 106 의 밀도 도달 되도록 각 YEPD 국물의 8 mL를 포함 하는 시험관에 접종 (참조 토론 참고 1).</li>
	<li>효 모 세포 (1400 x g, 실 온 또는 4 ° C에서) 5 분에 대 한 15 mL 스크류 캡 원심 관에 다운 스핀, 1.5 mL 70% 에탄올, 실 온에서 1 h 또는 얼음 (에 적어도 3 h이이 앉아 시키는 1.6 mL microfuge 관에 전송 셀 resuspend 4 ° C에서 무기한 저장할 수) (토론 포인트 (2) 참조).</li>
	<li>1 분 동안 microfuge (14000 x g, 4 ° C)에서 효 모 세포를 스핀, 1 분 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2, 스핀 (14000 x g, 4 ° C) 아래에 resuspend, 상쾌한 발음, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2에서 resuspend 0.25 mg/mL 1 시간 또는 밤새 껏 열 블록 또는 물 목욕에서 37 ° C에서 50 ° C에서 RNAse 솔루션 포함.</li>
	<li>50 µ L 성분을 K 솔루션 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5, 2mm CaCl2, 볼륨 글리세롤을 50% 무게에에서 resuspended)를 추가 하 고 50 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>셀 (14000 x g, 4 ° C) 다운 스핀, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2 셀 resuspend, 스핀 다운 (14000 x g, 4 ° C), 진공 상쾌한 발음, 1 mL 1 µ M 녹색 핵 산 피로 50 m m 나트륨 구 연산 염에 resuspended resuspend pH 7.2 및 실 온에서 1 h에 대 한 어둠 속에서 품 어, 2 x 2를 sonicate s 각 (출력 2 와트).</li>
</ol>2. 셀 정렬
<ol><li>그림 1 과 같이 각 세포 주기 단계에서 적어도 1.6 백만 단일 세포를 수집 단계로 G1, S, "초기 g 2는,"와 "늦은 g 2", DNA 내용에 따라 셀 정렬 셀 정렬을 사용 하 여 (토론 포인트 (3) 참조).</li>
	<li>Microfuge 관으로 셀을 전송 하 고 14000 x g는 microfuge에서 4 ° C에 20 분에 대 한 셀 아래로 회전 진공 상쾌한 발음 (-20 ° C에서 무기한 동결 펠 릿을 저장할 수 있습니다; 토론 포인트 (4) 참조).</li>
</ol>3. DNA 추출 및 라이브러리 시퀀싱의 준비
참고: 다음 단계는에 따라 "의정서 I" 효 모 게놈 DNA 추출 키트에에서 ( 재료의 표참조).
<ol><li>"소화 버퍼," 독점 수 있는 버퍼를 효 모 세포 벽, 그리고 효 모 용균성 효소의 5 µ L를 소화, vortexing에 의해 resuspend 및 40-60 분 동안 37 ° C에서 품 어 용균성 효소의 120 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>"세포의 용 해 버퍼," 세제, 그리고 10-20 s 하드 소용돌이 포함 하는 독점 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>250 µ L 클로 프롬을 추가-믹스 철저 하 게 1 분.</li>
	<li>2 분 동안 microfuge에서 최대 속도로 회전 합니다.</li>
	<li>DNA 바인딩 열과 1 분 대는 microfuge 최대 속도에서 분리기에 상쾌한 로드.</li>
	<li>"DNA 세척 버퍼," 에탄올, 그리고는 microfuge 최대 속도에서 1 분 동안 원심 분리기를 포함 하는 독점 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 흐름을 통해 삭제, DNA 워시 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 세척 과정을 반복.</li>
	<li>신선한 microfuge 관 스핀 열 전송, 물 (안 테)의 60 µ L-1-3 분을 기다릴 더하고 다음 10 원심 elute DNA를 s.</li>
	<li>DNA의 5 µ L dsDNA 높은 감도 버퍼에 희석된 1: 200 그리고 교정;에 대 한 제공 된 표준의 10 µ L를 사용 하는 fluorometer에서 측정 형광 되었습니다 dsDNA 높은 감도 시 약의 195 µ L을 추가 하 여 농도 측정 DNA의 총 10, 50 ng 사이 기대 합니다.</li>
	<li>Sonicate (피크 사건 전력 450, 듀티 계수 30%, 버스트 200, 치료 시간 60 s, 물 레벨 6 초당 사이클) 250-350 bp 파편으로 DNA 헤어.</li>
	<li>DNA 샘플 준비 키트를 사용 하 여 라이브러리를 준비 하 고 빠른 모드에서 DNA 시퀀싱 장비에서 그것은 (적어도 10 백만 50 bp 일자형 읽기)을 시퀀싱 (토론 참고 (5) 참조).</li>
</ol>4. 분석 데이터와 복제의 세대 시퀀싱의 프로필
<ol><li>Saccharomyces cerevisiae sacCer3 게놈 Gsnap12 를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 (토론 참고 (6) 참조).</li>
	<li>자료 당 쌍 읽기 Bedtools' "genomeCoverageBed" 소프트웨어13를 사용 하 여 깊이 결정 합니다.</li>
	<li>있는 경우 읽기 깊이에서 artefactual 스파이크를 제거 (토론 참고 (7) 참조).</li>
	<li>부드럽게 읽을 깊이 염색체 R에서 "runMean" 기능을 사용 하 여 창 슬라이딩 20 kb에서 중앙값을 사용 하 여 패키지 "caTools" (토론 참고 (8) 참조).</li>
	<li>플롯 (토론 참고 (9) 참조) 완전히 복제 된 읽기 깊이의 S 단계, 초기 g 2는, 늦은 g 2에 있는 깊이 읽기.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 기술은 강력 하 고 비교적 똑 바른 동안 앞으로, 특정 주의 다음에 전념 한다.
(1) 문화 차이 매니페스트 세포 주기 배포판에 문화는 접종 후 원하는 밀도 그냥 4 h를 도달 하는 데 후 수확 하는 경우 이후 로그 단계를 도달 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 성장 좋습니다. 우리의 가정은 세포 주기 분포는 비교적 안정 된 평형에 도달 했습니다 더 나타내는 "진짜" 로그 단계 배포는 아직 유출 때 포화 문화 양도 되었습니다 최근 신선한 매체 배포 보다.
(2) 고정 하기 전에 셀 아래로 회전의 대신 세포 또한 직접 에탄올의 최종 농도 70% 효 모 문화를 100% 에탄올을 추가 하 여 해결할 수 있습니다. 세포 합성 또는 풍부한 (YEPD) 매체에 성장 될 수 있다.
(3) 세포 주기 단계 530 nm 방출 영역의 기능으로 플로팅 휴대 번호로 정렬에 대 한 시각화 됩니다. 우리는 굴절 포인트 및 S와 g 2는 g 1과 S 사이의 S 단계, 묘사에 대 한 강력한 랜드마크 역할을 하 고 우리을 사용 하 여 g 2 최대 경계로 초기 및 런타임에 g 2를 발견 했다. 우리는 "초기 g 2"와 "늦은 G2" 선명도와 짧음, 세포 DNA 복제를 완료 될 때까지 S 단계에서 기술적으로 의미에서 정확도 희생 해 서 아마도 용어를 사용 합니다. G2-seq의 목표는 늦은 g 2 분수에 공개 될 것으로 예상 된다, 매우 늦은 복제 사이트를 식별 하는 S 단계 및 초기 g 2 셀 셀 사이클의 모든 단계를 통해 복제에 따라 수집 합니다.
(4) 그것은 매우 중요 하다는 셀 수 스핀 다운 신속 하 게 정렬 후입니다. 셀을 아래로 회전 하기 전에 밤새 앉아 하지 마십시오. 우리는 문제 4 ° C에 저장 된 경우 원심 분리에 의해 세포의 복구, 그들은 정렬에 취약 되 고 시간 lyse 제안 했다.
(5) 거의 5 백만 읽기 충분 하지만 플롯 될 덜 읽기의 낮은 숫자와 부드러운. 도 적은 읽기 데이터 집합 20 kb 보다 큰 창문이 부드럽게 하 여 수용 될 수 있습니다 하지만 우리는 이것을 시도 하지 않은.
(6) 널리 사용 된 정렬 소프트웨어 (예를 들어, Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15또는 Gsnap12) 작동 합니다.
(7) 높은 처리량 시퀀싱 데이터에서 효 모 타이 요소를 반영 하는 종종 읽기 깊이에서 가끔 스파이크를 보여줍니다. 우리는 깊이 읽기 깊이 2.5 x 중앙값 보다 큰 반복적인 뻗어 (예를 들어,는 rDNA)을 포함 알려져 지역 외부에 대 한 읽기 평균 샘플 x 2.5를 대체 하 여 제거 합니다. rDNA 및 염색체의 끝은 그들은 알려진 반복 요소를 포함 하기 때문에 제외 됩니다. R 언어를 사용 하 여이 "despiking"의 예는 다음과 같습니다.
# 라는 "읽기"는 데이터를 포함 하는 데이터 프레임을 만듭니다. chr <-담당자 ('기독교', 10) 포스 <-seq (1, 10) rd <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1) 읽고 <-data.frame ('염색체' = chr, '위치' = pos, 'read_depth' = rd) # "despike" 읽기 깊이: 읽기 [, 'despiked'] <-ifelse (읽기 [3], > (2.5 * median(reads[,3])), (2.5 * median(reads[,3])), reads[,3])
"상한" 또는 "despiking" 또한 얻을 수 있는 하나 이상의 위치에 매핑되는 읽기 제외 하지만이 읽기 매핑하는, 예를 들어, 두 위치를 제거 합니다. S. cerevisiae, 누구의 게놈 조상의 중복16에서 결과 작업할 때 둘 이상의 위치에 지도 여전히 유용한 정보를 제공 하는 읽기의 경우 흔히 되지 않습니다.
(8) 우리 R 패키지 "동물원" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html)에서 "rollmedian" 함수와 R 패키지 "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html)에서 "runmean" 기능 비교 결과 얻은.
(9) 우리 모두는 유사한 결과 준 읽기 깊이 정규화 하 수많은 방법으로 실험을 했습니다. 우리의 선호 접근 게놈의 적어도 일부 지역 S 단계 샘플 완전히 복제 가정 기반으로 합니다. 우리는 중간 초기 높은 자신감을 발사 하는 12에 해당 하는 사이트에서 우리의 데이터 세트에 깊이 읽기 전체 복제를 나타내는 읽기 깊이 결정 ("신뢰" 점수 > = 7) 공개적으로 사용 가능한 데이터 집합에서 기원. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & 테이블 Raghu2001_ori & ext_format = = & 형식 탭 =). 대부분의 응용 프로그램에 대 한 정규화에 대 한 접근 방식이 중요 하지 않습니다 하 고 많은 옵션이 합리적인, 그냥 가장 간단 하 게 읽을 수 합계를 정규화 합니다. 그러나, 그것은 샘플 사이 반복 시퀀스의 숫자에 큰 차이가 있다, 읽을 수 합계 정규화 오해의 소지가 있을 수 있습니다 지적 가치가 있다. 예를 들어 누구의 rDNA 배열 다른 여러 배 두 긴장을 비교할 때 읽을 수 총에 정상화 할 수 특정 큰 rDNA 배열 가진 긴장의 게놈의 지역 artefactually와 긴장 보다 나중에 복제 되도록 배열입니다.
요약 하자면, G2-seq 복제 프로 파일링을 위한 기존 기술의 논리적 확장을 나타냅니다. 다른 시퀀싱 및 microarray 기반 기법 처럼 G2-seq 장점이 이상의 2D 젤의 게놈 넓은 범위 분석 및 복제 유래 위치의 지식의 요구의 부족. 후자는 특히 관련, 달리 신진 효 모에 복제 기원에 국한 되지 않습니다 특정 시퀀스 포유류 세포 에서입니다. 다른 한편으로, 2D 젤 g 2이 확장 G2-seq의 세포는 DNA 내용에 따라 정렬할 수 있습니다 다른 유기 체에 의해 완전히 얻기 어려운 DNA 복제에 분자 중간체의 해상도 수준을 상대적으로 곧장 앞으로, 있어야 제공 그러나 높은 진핵생물의 게놈의 높게 반복적인 자연은 더욱 어려운 짧은 읽기 시퀀스의 정렬. 현저 하 게 더 이상 제공 하는 시퀀싱 기술을 신흥 읽을 G2-seq는 상대적으로 더 이상 읽기17와 연결 될 수 있는 높은 오류율을 강력 이어야 한다 때문에 특히 길이 이와 관련, 유용한 증명할 수 있습니다. 우리의 경험에서 문제가 발생할 가능성이 가장 높은 기술 문제 후 정렬 되었습니다 및 DNA의 분리 전에 앉아 셀 풀어 이다. 이러한 세포 특히 취약 하 고 시간, lyse 나타나고 DNA 최대 한 시간이 나 두 분류 내에서 격리 되어야 합니다. 이 기술에 대 한 유망한 미래 방향 S와 G2 단계 늦은 완료 초기 개시에서 게놈 복제의 역학의 높은 해상도 얻기 위해 분수의 숫자를 증가 하는 것을 나누어 포함 됩니다.

진 핵 게놈 복제 복제, 복제에서 포크 (Fragkos 그 외 여러분, 20151에서 검토) 두 방향에서 진행의 기원 이라고 하는 여러 개별 사이트에서 시작 됩니다. 기원 그들의 타이밍 및 발사의 효율성에서 변화 하 고 몇 가지 기술을 복제 원점 활동을 모니터링 하 고이 변화의 원인 명료 하도록 개발 되었습니다. 개별 근원의 활동의 단일 가닥 DNA2, 활성 기원, 주위는 양식 수준에서 추정 될 수 있다 또는 특정 복제 중간체3모니터를 2 차원 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 둘 다로 검출 될 수 있다 방사성 조사 합니다. 이러한 기술을 모두 기원 전에 특정 알려진된 시퀀스에 제한 때문에 더 쉽게 S. cerevisiae 보다 포유류 세포에 적용 됩니다. Microarrays의 도래와 함께 세계적으로 발사 하는 근원 평가 수 되었다. 이 하 여 무거운 동위 원소와 DNA 라벨, 셀 g 1 블록에서 중간 포함 가벼운 동위 원소에 다음 무거운-가벼운 하이브리드 DNA 게놈4에 걸쳐 형성 모니터링 처음 이루어졌다. 높은 처리량 시퀀싱의 소개 허용 비슷한 게놈 넓은 비싼 동위 원소 라벨의 요구 없이 원산지 활동의 모니터링. 세포는 DNA 내용에 따라 교류 cytometer 및 깊은 시퀀싱을 복종 하는 그들의 DNA에 정렬 했다. 시퀀스 범위 S 단계에 걸쳐 2 x 1 x에서 진행, 때문에 상대 복제 타이밍 G1 또는 g 25,6에 S 단계에 있는 세포의 읽기 깊이 비교 하 여 평가 될 수 있습니다. 특히 효 모에 적용 되는 이러한 기술을 어떻게 DNA 순서, chromatin 구조, 그리고 DNA 복제 단백질 근원 타이밍 및 효율성 규제에 대 한 깊은 이해로 이끌어 냈다.
세포질 확산 중 유전 정보의 충실 한 전송 기원에 이루어지는 DNA 복제의 성공 뿐만 아니라 개시 뿐만 아니라 발생 하는 복제 포크 만나는 복제 성공적으로 완료 해야 합니다. 복제의 개시, 같은 복제의 완료의 타이밍 남은 세포 주기에서 늦게도 복제 되지 않은 특정 지역으로 게놈에 걸쳐 다릅니다. 이러한 지역 특히 활성 복제 기원에서 멀리 떨어져 있을 수 있습니다 또는 시퀀스 또는 DNA polymerases를 방해 하는 염색 질 구조를 포함할 수 있습니다. 늦게 영역 복제 염색체 파손 및 높은 돌연변이 속도와 연결 하 고 암과 노화7,,89에 연루 되어 연약한 사이트로 자신을 나타날 수 있습니다. 그러나, 게놈 안정성의 유지 보수에 DNA 복제의 적절 한 완료의 중요성에도 불구 하 고이 일어난 어디서 및 어떻게의 우리의 이해는 복제 개시의 뒤에 멀리 느껴 지. 그리고 개별 유전자의 늦은 복제 질병과 연관 되었습니다 동안 연구 함께, 예를 들어 정량10, 글로벌 연구 elucidating 위치 및 기본 복제는 부족의 원인에서 감독. 여기는 우리가 "G2 seq"는 우리가 결합 cytometry에 게놈 복제의 완료에 빛을 발산 하는 높은 처리량 시퀀싱으로 효 모11을 참조 하는 기술에 설명 합니다. 사소한 변경,이 프로토콜 흐름 DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 셀에 적응 될 수 있다.

<table width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">YeaStar Genomic DNA kit</td>
			<td style="width:135px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-323</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">1 &#181;M SYTOX Green</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">57020</td>
			<td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="width:301px;height:147px;">RNase solution (0.25 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R6513</td>
			<td style="width:167px;">0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:301px;height:42px;">proteinase K solution (20 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher / Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-015</td>
			<td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Model 50 Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>FB50A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">BD Biosciences FACSAria II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Zymo-spin III columns</td>
			<td style="width:135px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td>
			<td style="width:135px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">500219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>15026486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina HiSeq 2500 instrument</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>SY&#8211;401&#8211;2501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:301px;height:63px;">gsnap alignment software</td>
			<td style="width:135px;">open source software / Genentech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://research-pub.gene.com/gmap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

DNA 복제는 세포 주기의 S 단계의 진행에 따라 수많은 기술 개발 되었습니다. 이러한 기술의 대부분의 위치 및 게놈 중복 보다는 그것의 완료의 개시의 타이밍으로 지시 되어 있다. 그러나, 그것은 우리가이 지역 돌연변이, 염색체 파손의 높은 수준의 고통 때문에 마지막 복제를 완료 하는 게놈의 지구를 이해 하 고 그들은 질병과 노화와 연관 된 중요 한. 여기 우리는 어떻게 우리가 대신 마지막 완전 한 복제에 게놈의 그 영역을 식별에 복제 개시를 모니터링 하는 데 사용 된 기술 확장을 설명 합니다. 이 방법은 cytometry 및 높은 처리량 시퀀싱의 조합을 기반으로 합니다. 이 보고서에서는 효 모에이 기술 적용, 접근 교류 cytometer DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 세포와 함께 사용할 수 있습니다.

싹 트는 효 모에 늦게 복제 사이트 식별 위에서 설명한 절차를 사용 했습니다. 테스트는 인공 염색체에 알려진된 늦은 복제 영역을 사용 하 여이 이렇게 정확 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 입증 했다. 우리의 결과 또한 시연 복제의 적시 완료의 생물학 중요성 우리가 우리의 G2-seq 결과 근거 하 여 늦은 복제로 식별, 염색체 7에 늦게 복제 영역 손실 되었음을 표시 하 여 약 three-fold는 유사한 보다는 더 빈번 하 게 지역11제어 합니다.
G2-seq와 결과의 특정 한 예는 그림 2에 표시 됩니다. 우리 했다 가설을 거기 것 이다 특히 늦은 세포 복제 게놈의 지역 부족 단백질 deacetylase Sir2 라는. 그림 2A 야생 타입 (청색) 및 sir2 데이터 분석의 진행 (빨간색)를 보여 줍니다. 원시 데이터 (위쪽 행)는 대부분의 타이 성분의 존재에 큰 스파이크를 포함 합니다. 이 스파이크는 각 샘플 (중간 행)에 대 한 깊이 읽기 중앙값 x 2.5에서 읽기 깊이 상한에 의해 제거 됩니다. Despiked 데이터는 다음 20 kb 슬라이딩 윈도우 (아래쪽 행)으로 부드럽게 됩니다. 마지막으로, 데이터 정규화 되며 g 1에서 수준에 비율으로 꾸몄다. 일반적인 복제 늦은 지역 sir2 돌연변이에 나타나는 그림 2C에서 강조 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56286/56286fig1.jpg"> 그림 1. Flow cytometry 프로필 나타내는 세포 주기 분수 사용; 모든 게이트의 외부 한계 표시. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56286/56286fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56286/56286fig2.jpg"> 그림 2. (A-B) 원시 데이터 (상위 행), 데이터 처리의 진행 데이터 (중간 행)를 despiked 하 고 야생 유형 (A) 및 sir2 (B)에 대 한 데이터 (아래쪽 행)을 부드럽게. (C) 비율의 S 단계, 초기 g 2-, 및 늦은 g 2-g 1을 읽고 깊이. 파란색과 빨간색에서 sir2 에서 야생 유형. 오른쪽 상단에 강조 표시 된 지역 늦은 복제 지역 특정 sir2 돌연변이를 보여줍니다. 규모가 나타냅니다의 완전 한 (2N) 복제; 완전히 복제 되지 않은 셀은 0.5, 1에 완전히 복제 된 셀에 나타납니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56286/56286fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

5.7K 조회수.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.

비디오: G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...