이 간행물은 부여 번호 아래 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반  체 1708237입니다.

1입니다. 정화에 대 한 준비
<ol><li>셀 무료 원유 추출의 준비<ol>
<li>대장균 (BL21) overexpressed 태그 polyhistidine metalloprotein25 50 mL 원뿔 튜브에 그의 9 ~ 10 g 셀 펠 렛을 얻습니다.</li>
		<li>셀 펠 릿 총 볼륨 ~ 45-50 ml의 9 ~ 10 g을 방 임시 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미)의 그램 당 5 mL를 추가 합니다. 해산을 장려 하기 위해 주기적으로 소용돌이입니다. 펠 릿, 냉동 면 미지근한 물 욕조에 녹여.</li>
		<li>얼음 물 목욕을 사용 하 여, 진정 세포 세포의 용 해에 대 한 준비에 ~ 3 ° C에 세포 현 탁 액. 참고:이 시점에서 세포 세포의 용 해 쥡니다, 비드 밀링 또는 다른 방법에 의해 가능 하다. 비드 밀링 때문에 급속 한, 상대적으로 저렴 한, 그리고 귀 보호를 필요 하지 않습니다 여기 증명 됩니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 챔버 밀링 50ml 비드 조립.</li>
		<li>채우기의 전체 절반 비드 밀 챔버 냉장-20 ° c.에 저장 된 0.1 m m 유리 구슬</li>
		<li>냉장된 셀 서 스 펜 션 챔버의 나머지와 4 ° C 세포/바인딩 버퍼를 사용 하 여 챔버를 완전히 채우기.</li>
		<li>비드 밀의 샤프트를 회전 하는 구슬 세포 현 탁 액을 혼합 작은 주걱을 사용 합니다.</li>
		<li>피펫으로와 모든 큰 거품을 제거 하 고에 뚜껑을 나사.</li>
		<li>어떤 누설에서 챔버 드라이.</li>
		<li>명확 하 고, 플라스틱 자 켓에 얼음의 약 1 컵, 얼음 가득 재킷과 나사 폐쇄로 채워진된 50 mL 챔버를 반전.</li>
		<li>모터에 얼음 외피 챔버를 보호 합니다.</li>
		<li>비드 밀 15,800 rpm에서 15 초 동안에 모터 설정 후 45 초 동안 휴식을 허용. 8 회 반복 한다.</li>
		<li>8 주기 완료 되 면 50 mL 또는 더 큰 튜브 고속 원심 분리 (25000 g x 이상)에 대 한 평가로 전체 세포 세포 현 탁 액을 가만히 따르다. 작은 세포 파편과 유리 구슬에 4 ° C에서 40 ~ 45 분 스핀 25000 x g에서 원심 분리기에 균형된 관의 쌍을 놓습니다. 참고: 50 mL 또는 고속 원심 분리에 대 한 평가 큰 튜브 사용할 수 없는 경우에서 centrifuging 여 유리 구슬 제거 작은 양의 세포 현 탁 액 (25 mL) 작은 volum에 decanted 수 있는 수익률 50 mL 원뿔 튜브에 2-3 분 동안 g x 1000-2000 e 튜브 고속 원심 분리에 대 한 평가.</li>
		<li>원심 분리가 완료 되 면 가만히 따르다, 노란색 셀 무료, 원유 추출 물 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브로. 알아서 하지 어떤 세포 파편을 전송.</li>
		<li>SDS 페이지26에 의해 정화의 나중에 분석 셀 무료 원유 추출의 작은 샘플을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아이맥 칼럼의 준비<ol>
<li>수 지 입자, Luer 잠금 콘센트 및 Luer 잠금 피팅을 포함 하는 상위 모자를 유지 하기 위해 낮은 침대 지원을 갖춘 1.5 x 20 cm 열을 가져옵니다. 흐름을 제어 하는 자 지와 Luer 잠금 콘센트에 맞게.</li>
		<li>안전 하 게 벤치탑에서 working, 링 스탠드에는 열을 탑재 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 저장 된 20% 에탄올에 니켈 바인딩된 nitriloacetic 산 (Ni-NTA) 수 지의 50% 슬러리를 얻기</li>
		<li>부드럽게 균등 하 게 다시 중단 수 지 병을 소용돌이 친다.</li>
		<li>실내 온도에 및 벤치탑, 사용의 1 mL을 보장할 슬러리의 2 개 mL를 철회 졸업된 피펫으로 정착 수 지 바인딩 polyhistidine의 50-60 밀리 그램의 단백질, 태그와 열에 슬러리 전송에 작업.</li>
		<li>자 지를 열고 수 지에서 중력에 의해 배수 하는 과잉 스토리지 솔루션을 허용 합니다.</li>
		<li>자 지를 안전 하 게 닫으십시오</li>
		<li>파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 냉장된 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미) 추가 수 지-적어도 30 mL의 열. 알아서 하지 방해 수 지 표면. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
		<li>세포/바인딩 버퍼 컬렉션 비 커에 중력에 의해 열에서 천천히 배출 함으로써 수 지 equilibrate.</li>
		<li>세포/바인딩 버퍼는 대부분 물기를 때 세포의 용 해 버퍼의 ~ 5 mL 수 지 위에 때 버퍼의 흐름을 중지 하려면 자 지 닫고 열, 직 립, 진행 준비가 될 때까지 또는 최대 1 주에 대 한 탑재를 두고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 정화 태그 Polyhistidine 아이맥으로 대상의
<ol><li>워시 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 mM NaCl, 20mm 이미 pH 8) 및 차입 버퍼 (인산 염, 300 mM NaCl, 250 m m 이미 10% 글리세롤 pH 8 m 50 m)를 준비 합니다. 4 ° c.에 진정</li>
	<li>자 지를 열고 남은 세포/바인딩 버퍼 Ni NTA 수 지를 통해 중력에 의해 배수를 허용 하 여 Ni NTA 열 셀 무료 원유 추출의 추가 대 한 준비. 모든 버퍼는 물기와 수 지 표면 노출는 자 지를 닫습니다.</li>
	<li>파스퇴르 피펫으로, 신중 하 게 피펫으로 사용 하 여 셀 무료 원유 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용 수 지에 추출 합니다. 원유 추출 물 튀는 것을 방지 하려면 열 벽을 아래로 실행 합니다. 원유 추출 물 적용의 볼륨은 polyhistidine 태그 단백질;의 표현 수준에 따라 원유 추출의 총 볼륨 포함 50-60 밀리 그램 이하의 Ni NTA 수 지의 mL 당 대상 단백질의 (1.2.4 단계 참조).</li>
	<li>때 모든 원유 추출의 열으로 전송 되었습니다, 그래서 열이 중력에 의해 배수 할 수 있다는 자 지를 엽니다. 이 흐름을 통해 수 지-SDS 페이지에 의해 정화의 향후 분석을 위해 수집 100 μ에 바인딩되지 않은 단백질으로 구성 된다. 26
</li>
	<li>셀 무료 원유 추출의 점성 열의 중력 흐름을 상당히 느려질 수 있습니다. 흐름의 속도 높이려면 간단한 "손 펌프"를 적용:<ol>
<li>10 mL Luer 잠금 주사기를가지고 하 고 플라스틱 튜브 및 열 모자와 주사기 Luer 잠금 피팅 사이 짧은 길이 사용 하 여 열의의 모자를 연결 합니다. 주사기 플런저 밖으로 그리고 단단히 적합 열 상단 열 모자.</li>
		<li>부드럽게 수동으로 졸업된 실린더;에 eluent 수집 하 여 흐름 속도 평가 하는 동안 주사기의 플런저를 압축 분 당 1-2 mL의 수 지 및이 설치와 호환 됩니다. 부드럽게 유량으로 주사기 플런저의 압축을 증가.</li>
		<li>수 지에 공기의 도입을 방지 하려면 열 뚜껑을 제거 적용된 액체의 초승달 모양에 도달 하면 수 지 침대 위에 5-10 m m 손 펌프를 연결 및 중력에 의해 배수 하는 나머지 볼륨을 허용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 무료 원유 추출 물 배출 완료 하 고 수 지 표면에 다시 노출, 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 워시 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
	<li>자 지를 열고 워시 버퍼 열을 통해 배수를 허용 합니다. 이 프로세스는 수 지에서 약하게 바인딩된 단백질을 제거 합니다. Eluent는 삭제 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼를 배출 하는 동안 준비 16, 표시, 1 mL 분수를 수집 하기 위해 microcentrifuge 튜브.</li>
	<li>워시 버퍼는 물기, 수 지 표면에 다시 노출 되는 자 지를 닫습니다. 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 차입 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
	<li>자 지를 천천히 열고 열에서 태그 polyhistidine 단백질을 elute 차입 버퍼를 허용 합니다. 각 표시 된 microcentrifuge 튜브, 1 16-eluent의 1 mL를 수집 합니다.</li>
	<li>단백질 시 약 또는 악기 제조 업체27,28여 Bradford 분석 실험 또는 특정 방법에 따라 UV 보이는 분광학 등 색도계 단백질 분석 결과 사용 하 여 분수를 테스트 합니다. 같이, 색도계 분석 결과 Coomassie blue를 사용 하 여이를 축소 100 μ 볼륨 각 분수에서만 작은 볼륨을 희생 하기 위하여.</li>
	<li>색도계의 100 µ L 각 분수의 혼합 3 μ 시 약을 시험 하 고 수동으로 분수; 단백질의 존재를 나타내기 위해 어떤 색깔 든 지의 형성 탐지는 분석기와 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>단백질 분수 16에에서 있으면 1 mL 분수와 단백질에 대 한 분석 결과 정기적으로, 방출까지 계속 eluted 분수 이상 단백질의 상당한 금액을 포함.</li>
	<li>깨끗 한 원뿔 관으로 포함 하는 단백질 분수를 결합 하 고 나중에 분석 100 μ 샘플 SDS 페이지26에 의해 철회.</li>
	<li>금속 이온 공동 인자의 재구성으로 진행 하거나 3 mL aliquots-80 ° c.에 있는 단백질을 고정 그 10% 글리세롤 포함 한지는 차입에 버퍼가 cryoprotectant 동결 동안 순수 단백질을 안정.</li>
	<li>Ni NTA 열의 차입 완료 되 면, 즉, 모든 단백질은 열에서 고 분수에서 수집, 전달 열을 통해 차입 버퍼의 또 다른 25 mL 단기 저장을 위해 차입 버퍼의 ~ 5 mL에 4 ° C에 열을 저장 또는 장기 저장을 위한 20% 에탄올과 세포/바인딩 버퍼.</li>
</ol>3. Fe2 + 대상 단백질의 재구성
<ol><li>Fe2 + 의 추가 참고:이 예제에서 아미노산의 일종 dioxygenase 같은 효소 바인딩 비 heme 철 (II) 필요는 Fe2 + 이온 활동; 그러나, 철 (II)는, 철 (III), 쉽게 산화 하 고 전혀 어떤 철 없이 정화 단백질의 일부분.<ol>
<li>금속의 재구성을 시작 하려면 차입 버퍼에 순화 된 효소의 3 mL을 구하십시오. 냉동, 미지근한 물 목욕을 사용 하 여 빠르게 해 동 하 고 한 번 해 동, 얼음에 단백질을 넣어.</li>
		<li>튜브에 단백질의 볼륨을 사용 하 여, 나트륨 하는데 (198.1 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다. 또한, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다.</li>
		<li>단단한 나트륨 하는데 및 DTT 추가 하 고 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 완전히 분해를 혼합. 알아서 하지 지나치게 공격적 혼합 단백질 강 수 발생할. 단백질 견본을 철 (II) 황산 염 heptahydrate (MW 278.01 g/mol)의 작은 금액을 추가 합니다.</li>
		<li>몇 가지 1 철 소금, 수돗물의 충분히 작은 수량을 얻기 위하여 mm FeSO4•7H2O 밖으로 단단한 조각에의 립 종이 무게과 립, 종이 접고 고 금속 주걱의 편평한 측으로 그것을 분쇄.</li>
		<li>단백질의 튜브를 결과 분말의 입자를 추가 합니다.</li>
		<li>혼합 하는 소용돌이 장미빛 핑크 색 튜브에 표시 됩니다.</li>
		<li>단백질, 얼음에 10-30 분 출장의 분홍색 솔루션을 품 어. 핑크 색상 천천히 시간이 지남에 사라질 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 여과<ol>
<li>약 6, 000의 분자량 제외 제한와 10 mL 저수지도 갖춘 1.5 x 12 cm 열 µ m 90-180의 수 화 입자 크기 범위 구형 polyacrylamide 젤 10 mL 포장 젤 여과 열을 사용 합니다. 열은 낮은 갖추고 상단 침대 지원 열에 수 지를 유지 하 고 수 지 침대 건조 실행에서 방지 30 um 다공성 폴 리 에틸렌 디스크의 형태로 확인 합니다. 젤 여과 열 링 스탠드를 탑재 합니다.</li>
		<li>사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 뚜껑을 제거 하 고 상단 침대 지원 위에 초과 버퍼에서 부 어.</li>
		<li>열, equilibrate에 버퍼 후속 분석 결과 및 저장, 예를 들어 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤과 호환 되는 저수지를 작성 하 여 시작 합니다.</li>
		<li>사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 버퍼의 흐름을 시작 하 여 노출 Luer 슬립 피팅 젤 여과 열의 아래쪽 끝에서 스냅. 열, Luer 슬립 끝에 자 지를 맞게 하지만 고 열 중력 드립에 허용.</li>
		<li>버퍼 열에서 뽑아가 고 상단 침대 지원 노출, 자 지, 닫고 노출된 상단 침대 지원에 솔루션 pipetting으로 열에 Fe (II) 재구성 metalloenzyme ~ 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>자 지를 열고 전체 3.0 mL 샘플 중력에 의해 열을 입력을 허용 합니다. Eluent의이 첫 3 mL을 삭제 합니다. 솔루션을 처리 하는 동안 형성 된 핑크 색상 열의 상단에 갇혀 있을 것입니다.</li>
		<li>열 물이 뚝뚝 떨어지는 중지 하 고 상단 침대 지원 노출, 열에 젤 여과 버퍼 (예를 들어, 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤)의 4 개 mL를 추가 합니다. 자 지를 열고 microcentrifuge 튜브 8 0.5 mL 분수는 eluent 수집 합니다.</li>
		<li>앞에서 설명한 대로 색도계 단백질 분석 결과 또는 UV 마주27,28 를 사용 하 여 단백질에 대 한 분수를 테스트 합니다.</li>
		<li>결합 단백질이 포함 된 분수.</li>
		<li>SDS 페이지 분석26에 대 한 샘플을 철회 한다.</li>
		<li>분석 결과 또는 샘플의 스토리지와 함께 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2,3-dioxygenase,+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis.">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li><li>Johnson, K. 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J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

저자 아무 공개 있다.

재조합 형 단백질을 아이맥에 의해 그들의 정화 polyhistidine 태그의 추가 생 화 확 적인 문학3,4,5, 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션에에서 거의 유비 쿼터 스 되는 생화학에 스파스, 남아 가르치는 실험실 및 게시 방법을 항상 교육의 자원 한계를 고려 하지 않습니다 연구소20. 또한, 교육 연구소에 아이맥의 사용 평가 활동 및 순수성, 효소는 이상적인 교육 활동의 아이맥 정화를 만드는 실험에 결합 될 때 가장 효과적입니다. 아이맥의 효소, metalloenzymes를 포함 하 여 교육 실험실에서의 정화에 응용 프로그램을 확장 하기 위해 안정적이 고 저렴 한 방법 필요 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 벤치탑 아이맥 또한 종속 iron(II)를 재구성 하 여 metalloproteins22아이맥의 응용 프로그램에서 한계를 해결 하는 동안 쉽게 구할 수 있고 저렴 한 실험실 공급을 사용 하 여 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 정화 게시. 8 학생 그룹에 대 한 소모품의 비용입니다 $500-600 그림 1 과 그림 2에서 설명 하는 분석 단계를 포함 하 여이 프로토콜을 실행 하는 학기 당 사이 예상 시 약 및 자료를 사용 하 여.
용이성은 Fe2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24 와 Fe2 + 의 손쉬운 산화 O2 Fe3 +, 비-헤의 재구성으로 인해 재조합 metalloenzyme에 iron(II) 아미노산 킬레이트 화 되는 효소 정화의 일반적인 구성 요소입니다. 클래식 크로마토그래피를 사용 하면 일부 경우32, 철 분의 총 손실을 방지 하기 위해 가능 하다 그러나 철 (II)를 추가 하 여 다시 감소 시키는 대리인33,,3435, 의 존재는 더 자주, 36 및 과잉 철은 어떤 경우에는 혐 기성 분위기가37,,3839, 아래 자주 제거33,,3436, 복잡 모든 후속 분석 결과입니다. 클래식 크로마토그래피와 혐 기성 분위기의 연속 단계 학부 실험실,이 프로토콜의 개발을 자극에 대 한 현실 되지 않습니다.
동안 Ni NTA 열의 수동 준비 및 중력에 의해 크게 샘플의 처리는 추가 시간 및 노력 때 사전 패키지 된 열에 비해 크로마토그래피 계측 자동화, 수동 단계 허용에 대 한 실습 학습 과정의 뒤에 과학의 증가 이해에서 발생 하는 학생에 의해. 여기에 설명 된 조건 하에서 철 (II) 소금의 추가 초과 dithiothreitol에 특히 민감합니다. 학생 dithiothreitol의 과잉, 실수로 추가 강수량 이벤트가 높습니다. 우리는 도움이 필요 시 수량 계산 실험실 시간 벤치에 가장 효과적으로 사용할 수 있도록 실험실에 도착 하기 전에 수행 하는 학생을 발견 했다. 세포-세포 단백질 차입-하에서 전체 벤치탑 아이맥 정화-재구성 및 이후 실험실 기간 분석 결과 1 4 시간 실험 기간에 수행할 수 있습니다.

고정된 금속에 의해 히스티딘 태그의 chelation를 사용 하 여 호스트 유기 체의 추출 물에서 태그 polyhistidine 단백질의 정화의 첫 번째 보고서는 문학 19881,2입력. 그때 이후로, 재조합 단백질 및 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 그들의 정화 태그 polyhistidine 추가 되었다 생 화 확 적인 문학3,4,에에서 거의 유비 쿼터 스 5. 아이맥 정화 방법 자동된 크로마토그래피를 사용 하 여 벤치탑 및 스핀 열 형식을 구현할 수 있습니다. 친 화력 정화 방법, 특히 아이맥, 연구 실험실에서 널리 이용 된다, 그러나 그들은 보다 적게 일반적 학부 교육 연구소. 생화학 실험실에 대 한 가장 널리 사용 되는 실험실 교과서 정기적으로 치지 않는다 이러한 방법, 대신 더 전통적인 이온 교환 또는 염료 바인딩 크로마토그래피6,,78 선택 , 9. 예를 들어 앤더슨10 젖 산 효소의 정화 염료 바인딩에서 선호도 사용 하 고 소 우유 α-lactalbumin7,11 Boyer에 의해 정화 사용 니켈 nitriloacetic 산 행렬, 하지만 아무 재조합 폴 리 히스티딘 태그, 수 지에 대 한 단백질의 본질적인 선호도에 대신 의존. 일부 현대 학부 실험실 교과서 및 출판물 녹색 또는 빨간색 형광 단백질12,13와 같은 폴 리 히스티딘은 단백질 목표에 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 구현 14,15,16, 항 체 및 선택한 효소17,18,,1920, 심지어 알 수 없는 함수21일부. 확실 하 게, 효소의 정화는 교육 연구소에서 바람직 대상 수 수 분석 활동에 대 한 후속 세션에서 학생; 편에서 "진짜 과학"의 경험을 풍부 하 게 하기 때문에 사실, 실험실 경험의이 종류는 출판 하 고 학생 들의 학습에 도움이 결과 보고17,18,,2021. 생화학 실험실 스파스, 유지 및 게시 방법 일반적으로 사용할 수 있는 크로마토그래피 계측에 대 한 액세스를 감히 심지어 수 있습니다 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션 교실 실험실에서 사용 하는 아직, 그리고 20. metalloproteins, 특히 그 활동22에 필수적인 산화 환 원에 민감한 divalent 금속 묶는 아이맥의 응용 프로그램에 제한이 있다. 자주, 금속 이온은 분실 또는 정화 저조한 학부 실험실에 어울리지 비활성 효소 중 산화.
효소의 전체 1/3 바인딩 금속 이온23, 그리고 모든 형태의 생활23에 대 한 거의 보편적인 요구에도 불구 하 고 철 틀림 없이 enzymology에서 가장 금속 이온 중. 비 헤 Fe2 + 바인딩 효소는 아이맥; 중 특히 손실 및 금속의 산화 하는 경향이 heme는 Fe와2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24용이성 같은 전용된 유기 ligand의 결여 때문에 아마도 또한, Fe2 + Fe3 + 산소 의존 산화 용액, 부정적인 자유 에너지 변화와 Fe3 +의 상대적인 안정성 때문에 자연입니다. 종종, 이러한 과제는 혐 기성 분위기 및/또는 비-아이맥 컬럼에 방법22의 사용에 의해 극복 된다. 이 문서에서는, 우리 벤치탑 정화는 Fe2 + 종속 metalloenzyme l 아미노산의 일종 dioxygenase 사용 하 여 간단 하 고 저렴 한 크로마토그래피 소모품, Fe2 +, 활성 사이트의 재구성에 의해 다음 아이맥의 사용을 시연할 예정 이다 하 고 효소 분석 실험입니다. 이러한 방법 6-12 학생 그룹의 우리의 자신의 학부 생화학 실험실에 있는 표준 및 효소 조사 학부 수준에서의 레 퍼 토리를 확장 하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 태그 polyhistidine 단백질의 학부 학생 들에 의해 쉽게 마스터 그리고 현대 문학에서 가장 널리 사용 되 단백질 정화 방법 되고있다. 하지만, 산화 철, 민감한 금속에 특히 그들 금속 바인딩 단백질 친화성 크로마토그래피의 응용 프로그램은 종종 실험실 글러브 박스-일상적으로 학부에서 사용할 수 있는 장비에 대 한 액세스 제한 실험실입니다. 이 문서에서 설명 하는 절연, 아이맥 폴 리 히스티딘 태그의 정화 및 금속 이온 재구성, 산화 환 원 활성, 비 heme 철 바인딩 extradiol dioxygenase 및 다양 한 기판으로 dioxygenase의 분석 결과 대 한 우리의 벤치탑 메서드 농도 그리고 산소를 흠뻑 젖 게입니다. 이러한 메서드는 학부 학생 들에 의해 실행 되 고 액세스할 수 있고 주로 학부 기관에서 저렴 한 계측과 학부 교육 및 연구 실험실에서 구현.

이러한 대표적인 결과 BCM 341의 2 개의 과정 실험실 기간 동안이 프로토콜을 실행 그들은 학부 학생 들에 의해 수집 된: Muhlenberg 대학에서 실험 생화학. 그림 1 보여줍니다 20 kDa 폴 리 히스티딘의 정화의 결과 4 시간 교실 실험실 기간 동안 두 학부 학생에 의해 수행으로 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 태그와 같은 SDS 페이지 분석 후속 실험 기간 동안 학생입니다. 폴 리 히스티딘은 단백질이 효과적으로 정화 (그림 1, 2 차선). 폴 리 히스티딘 태그에 대 한 항 체를 사용 하 여 젤의 immunoblot 나타냅니다는 흐름-를 통해 (데이터 표시 되지 않음), 폴 리 히스티딘 태그 대상 단백질의 작은 금액을 손실 됩니다 가능성이 있기 때문에 대상 단백질에의 100 밀리 그램 양 보다 큰에 수 지의 바인딩 용량 초과 lysate.
그림 2 에서는 철 (II)와 여과 젤-후속 프로토콜에서 설명 된 대로 재구성 후 폴 리 히스티딘 태그 metalloenzyme 대상, l 아미노산의 일종 dioxygenase의 효소 반응에 학생 수집 활동 데이터를 보여 줍니다. 여기. 데드 타임 데이터 수집 전에 시작 5 초 처음으로이 기술을 실행 하는 학생 들의 전형 이다. metalloenzyme의 강력한 활동 게시 된 분석 결과 사용 하 고 정상 상태 운동 매개 변수 게시 결과29일치를 굴복 발견 되었습니다. 정상 운동 매개 변수 피팅 그림 2에 표시 된 진행률 곡선30 에 의해 결정 되었다 그러나, 기질 농도의 시리즈를 통해 수집 하는 초기 속도의 비 선형 최소 제곱법 피팅 가능한31똑같이 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> 그림 1입니다. 폴 리 히스티딘의 SDS 페이지26 분석 하기 전에, 동안과 정화 후 단백질을 태그. 레인 1-분자량 마커, 2 순화 단백질 (20 kDa) 게시물 Ni NTA, 4-셀 무료 원유 추출 물 정화, 5 이전-세포 파편 펠 릿 게시물 세포 '를 통해 3-Ni-NTA 흐름. 샘플 샘플/로딩 버퍼 x 5를 사용 하 여 준비 하 고 프리 카스트 4-20 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법 체계를 사용 하 여에 분리 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> 그림 2입니다. 정상 상태 분석 결과 철 (II)의 버퍼 (인산 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8) 기판 (l 아미노산의 일종-5 µ M (빨강), 25 µ M (녹색), 50 µ M (블루))와 metalloenzyme를 (즉, l 아미노산의 일종 dioxygenase, 10µM)를 재구성 된다. 흔적 묘사 414nm에서 제품 형성. 흡 광도 데이터 지속적으로 분할 빔 스캐닝 자외선 보이는 분 광 계29에 1 mL 메타 크 릴 산 큐 벳을 사용 하 여 인수 했다. 원시 데이터는 Michaelis-Menten 정상 상태 근사 (KM 30.8 µ M ± 14.4, k고양이명백한 2.3-1 ± 0.05)30의 모델에 맞게 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

여기 우리가 현재 벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 정화 태그 polyhistidine의 후속 재구성에 대 한 프로토콜, 비 heme 철 바인딩 dioxygenase 학부 교육 실험실에 적합.

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.1K 조회수.  Muhlenberg College. 여기 우리가 현재 벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 정화 태그 polyhistidine의 후속 재구성에 대 한 프로토콜, 비 heme 철 바인딩 dioxygenase 학부 교육 실험실에 적합.

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known small molecule-protein interactions and to find potential protein targets for natural products. Compared with other methods, DARTS uses native, unmodified, small molecules and is simple and easy to operate. In this study, we further enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The protein-ligand interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used the mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case for establishment of our protocol. From the proteolytic curve we saw that the proteolysis of mTOR by pronase was inhibited by the presence of rapamycin. The dose-dependency curve allowed us to estimate the binding affinity of rapamycin and mTOR. This method is likely to be a powerful and simple method for accurately identifying novel target proteins and for the optimization of drug target engagement.

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

In this study, we enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case.

라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

선호도 크로마토그래피 수지의 신속한 개발을 위한 활성화된 상호 연결 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 포획

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...