우리는 EPR 및 사슴 분석기에 대 한 액세스를 제공 하기 위한 박사 H. Mchaourab와 박사 T. 로젠바움 전장 시스테인-덜 TRPV1 플라스 미드를 제공 하기 위한 매우 감사.

저자는 공개 없다.

표현과 포유류 막 단백질의 정화에 대 한 현재 기술 분 광 연구14,15,,1642단백질의 충분 한 양을 얻을 수 만들었습니다. 여기, 우리 표현, 정화, 다시 구성, TRPV1에 분 광 분석을 수행 하는 이러한 기술을 적응 시켰다.
프로토콜에 중요 한 단계 중 아래는 TRPV1에 대 한 트러블 슈팅을 수행한 우리 하 고는 다른 단백질을 위해 조정 될 수 있습니다. 0.5-1 mg/mL 단백질 세제 정화;의 생성 하는 템플릿을 생성 하려면 DNA 시퀀스 수정 미만 0.5 mg/mL 단백질의 생성 하는 템플릿, 돌연변이 당 해야 할 것 이다 곤충 세포 문화 6 리터 이상 성장 이후 도전적. 단백질 해야 집중 될, 이상 2 mg/mL, 스핀 라벨 효율 증가에 한 TCEP 없이. 낮은 단백질 농도에 또는 TCEP 존재 라벨 흔적 시끄러운 EPR 스펙트럼을 생성 합니다. 단백질 정화 중 4 ° C에 보관 됩니다, 하지만 스핀 효율 향상을 위해 RT에서 라벨을 수행 하기 위해 필수적 이다. 정화 및 라벨, 글리세롤 단백질 안정성 향상 그러나, 그것은 제거 되어야 한다 완전히 재구성, 전에 리에는 단백질의 양이 감소 하 고 시끄러운 EPR 스펙트럼을 생성. 재구성; 중 관행은 CMC 아래 세제 농도 감소 그러나, TRPV1는 리에 통합 하기 전에 침전 경향이 있다. 이 문제를 해결 하려면 TRPV1 단백질 강 수를 방지 하 고 채널 proteoliposome 준비에서의 수량 증가를 CMC에서 정확 하 게 미리 형성 된 리와 하룻밤 incubated 했다. TRPV1이 완전히 기능 asolectin 리28; 따라서,이 프로토콜에 사용 되는 기본 지질 혼합물 이었다. 그러나, 분 광 분석을 진행 하기 전에 특정 단백질 기능 (예:콜레스테롤)은 지질 구성 결정에 필수적 이다.
분 광 접근 같은 선물로 EPR 및 사슴을 포함 한 몇 가지 제한: 생 화 확 적인 안정성을 개선 하는 단백질 템플릿 순서에서 변경 기능26;에 영향을 미칠 수 기본이 아닌 단일 시스테인, 스핀 라벨의 소개 수도 잘 용납 되지; 단백질의 특정 지역에서 얻는 많은 양의 레이블이 단백질; 그리고 제한 된 구조적 변화 세제 micelles에 사슴으로 거리를 결정할 때. 그러나, 후자의 제한 TRPV1 돌연변이 nanodiscs19,43재구성의 Q-밴드 주파수 스펙트럼을 수집 하 여 극복 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방법의 장점은 글로벌 역학, 각, 그리고의 주어진된 위치에서 더 이상 거리의 패턴에서 주로 온다.
온도 감도 가장 흥미로운 중 하나 이며 덜 이해 제어 메커니즘; 따라서, 분 광 방법을 사용 하 여, 그것은 가능한 것 막 단백질 막 환경에서 단백질 모션으로 열 에너지를 번역 하는 어떻게 결정 하. 중요 한 것은, 열 게이팅 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM을 사용 하 여 이러한 기술은 냉동 온도에서 수행 되는 동안 구조 변화를 확인 하기 위해 도전 것입니다. 미래 실험 TRPV1 구조적 변경 열 종속 게이팅 EPR, 사슴, 또는 형광을 사용 하 여 호환 확인으로 이동 합니다. 그래서 우리는 위에서 설명한 프로토콜을 사용해 서, 우리는 약물-바인딩을 사용 하 여 포유류 이온 채널의 활성화의 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻게 될 것 이다 기대 EPR 분광학 간결한 이온 채널에 대 한 자세한 기계적 모델을 제공 하고있다 광 접근입니다.

단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)의 최근 발전, 포유류 이온 채널 구조는 특별 한 속도로 얻은 되었습니다. 특히, 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 같은 polymodal 이온 채널의 구조 연구를 제공 추가 활성화 메커니즘1,2,3, 의 이해 4 , 그러나 5., 막 환경에 포함 된 이온 채널에 대 한 동적 정보는 그들의 polymodal 제어 및 약물-바인딩 메커니즘을 이해 하는 데 필요한.
전자 상자성 공명 (EPR) 및 이중 전자-전자 공명 (사슴) spectroscopies 이온 채널6,7,,89 에 대 한 가장 확실 한 기계적 모델의 일부를 제공합니다 , 10 , 11 , 12 , 13. 이러한 접근의 간결한 검사에 주로 제한 되었습니다 및 archeal 이온 채널을 때 박테리아에 overexpressed 세제 정화 단백질 많은 양의 얻을. 곤충과 포유류 세포 기능 및 구조 특성화14,,1516진 핵 막 단백질 생산의 개발, 그것은 지금 생화학 얻을 수 분 광 연구에 대 한 세제 정화 단백질의 금액.
EPR 및 사슴 신호 단백질에서 단일-시스테인 잔류물에 연결 된 paramagneticspin 레이블 (SL) (즉, methanethiosulfonate)에서 발생 한다. 스핀-레이블을 보고 세 가지 유형의 구조 정보: 모션, 각, 및 거리. 이 정보는 잔류물 단백질 내 매장 하거나 막 또는 apo에 ligand 바인딩 상태13,17,,1819수성 환경에 노출 되는 수 있습니다. 고해상도 구조 (사용 가능한 경우)의 맥락에서 EPR 및 사슴 데이터 제공 가역 제어 전환 (즉, 폐쇄, 오픈, 모니터링 하는 동안 그들의 네이티브 환경에서 동적 모델을 파생에 대 한 제약 조건의 컬렉션 응, 그리고 desensitized). 또한, 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-그들 확인 하기 어려울 수 있습니다 유연한 지역 2 차 구조는 단백질20내의 위치 할당을 이러한 환경 데이터 집합을 사용 하 여 얻을 수 수 있습니다. 이온의 게이팅에 대 한 귀중 한 정보 채널3,,2122,,2324, 를 제공 하는 곳을 알아내는-EM 구조 지질 nanodiscs에서 25; 그러나, 분 광 방법 구조적 하는 상태에서 (예를 들어, 열 변경) 곳을 알아내는-그들을 사용 하 여 결정 하기 어려울 수 있습니다 동적 정보를 제공할 수 있습니다.
EPR와 사슴, 단백질 기능의 부족을 포함 하 여 모든 시스테인 잔류물 (특히 풍부한 포유류 채널에서), 낮은 단백질 수확량, 단백질 불안정성을 제거 하는 정화 동안 고 스핀 라벨링 후 구현 하 많은 어려움을 극복 한다 그리고 단백질 집계 세제 또는 리. 여기, 우리는 이러한 중요 한 장벽을 극복 하 여 포유류 감각 수용 체에 대 한 사슴 및 EPR 스펙트럼 정보를 얻은 프로토콜 설계. 여기 목적은 식, 정화, 라벨, 및 기능 최소화 시스테인-덜 쥐 TRPV1의 재구성 (eTRPV1) 분 광 분석에 대 한 구성에 대 한 방법론을 설명 하는 것입니다. 이 방법론은 그 막 단백질 이황화 결합을 형성 하는 시스테인을 포함 하는 또는 시스테인 잔류물의 제거에도 불구 하 고 그들의 기능을 유지 하는 것에 적합 합니다. 프로토콜의이 컬렉션은 다른 포유류 이온 채널의 분 광 분석에 대 한 적응 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1048px;" width="1047">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:292px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:251px;">210519-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Albumin Bovine Serum (BSA)</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-420-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amylose resin</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E8021L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aprotinin</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>A-655-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Asolectin from Soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10359016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Biobeads SM-2 Adsorbents&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate glass pipettes (3.5&#39;&#39;) (oocyte inyection)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings)</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-110-10HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2 2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Carbenicillin (Disodium)</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>C-103-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cellfectin Reagent</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10362-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cellSens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C606SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Critiseal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Maltose Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">High glucose medium (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0572&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O2783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td>
			<td>Epoch Life Science, Inc</td>
			<td>2160250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GenCatch PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Epoch Life Science, Inc</td>
			<td>2360050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capillary (25 &#181;l)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53432-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Flask 2800 mL</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>4423-2XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK293S GnTl-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside)</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>I2481C25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:292px;">Fisher bioReagents</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leupeptin Hemisulfate</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>L-010-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2 6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4 7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MOPS</td>
			<td>Fisher bioReagents</td>
			<td>BP2936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc</td>
			<td>O873900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pepstatin A</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>P-020-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pluronic Acid F-127 (20%)</td>
			<td>PromoKine&#160;&#160;</td>
			<td>CA707-59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PMSF</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-L-lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sealed capillary</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>special order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SF-900 II SFM (insect cell medium)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10902-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sf9 Cells (SFM Adapted)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Soybean Polar Lipid Extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td>541602C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29091596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TCEP HCl</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tetracyclin Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td>0123-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">X-gal</td>
			<td>GoldBio.com</td>
			<td>X4281C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xenopus oocytes</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00935M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XL1 - Blue Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td>0127-01-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:339px;">Econo-Pack chromatography column</td>
			<td style="width:292px;">Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels</td>
			<td style="width:292px;">Bio-Rad</td>
			<td>17000436</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">pFastBac1 Expression Vector</td>
			<td style="width:292px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:251px;">10360-014</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DH10Bac Competent Cells</td>
			<td style="width:292px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:251px;">10361-012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critiseal capillary tube sealant</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>02-676-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABI Model 3130XL Genetic Analyzers</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4359571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipete</td>
			<td>Fishebrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanoject II</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and reconstitution of trpv1 for spectroscopic analysis

Polymodal 이온 채널 transduce 다른 성격의 여러 자극에 allosteric 변화; 이러한 동적 conformations 확인 하 고 크게 불명 하 게 남아 도전입니다. 주 작동 근 바인딩 사이트의 구조적 특징 및 여러 이온 채널의 활성화 메커니즘에 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 발산 빛의 최근 발전, 무대는 그들의 게이팅의 깊이 있는 동적 분석에 대 한 설정 분 광 방법을 사용 하 여 기계 장치입니다. 이중 전자-전자 공명 (사슴)와 전자 상자성 공명 (EPR) 분 광 기술을 대량으로 순화 될 수 있는 간결한 이온 채널 연구에 주로 제한 되었습니다. 대량의 기능과 안정적인 막 단백질에 대 한 요구 사항을 이러한 방법을 사용 하 여 포유류 이온 채널 연구를 방해 했다. EPR 및 사슴 이기는 하지만 낮은 해상도에서 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM 얻으려면 어려울 수 있습니다, 구조 결정 및 모바일 단백질 영역의 동적 변화를 포함 하 여 및 가역 게이팅 모니터링 많은 장점을 제공합니다 (즉, 폐쇄, 오픈, 응, 그리고 desensitized) 전환. 여기, 우리는 기능성 세제 solubilized 일시적 수용 체 잠재적인 양이온 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 사슴 및 EPR 분광학에 대 한 분류 수 밀리 그램을 얻기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

최소한의 시스테인-덜 TRPV1 구성 (eTRPV1) 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성
분 광 연구 향한 첫 번째 단계 엔지니어 및 시스테인-덜 단백질 구조 (그림 2A) 기능 및 단백질의 생 화 확 적인 금액을 산출 하는 특성입니다. eTRPV1는 Ca2 + 이미징 및 TEVC (그림 2B-C)에 의해 결정 된 대로 작동 합니다. 또한, eTRPV1 EPR 및 사슴 실험 (0.5-1 mg Sf9 셀의 리터 당)에 대 한 세제 정화 단백질의 충분 한 양을 제공 한다26. 소개 하는 특정 단백질 영역에서 단일 시스테인 그들의 기능에 영향을 수 있습니다. 그림 2B HEK293 포함 하는 eTRPV1에 TRPV1 길 항 제 (예, capsaicin) 추가 될 때 그들의 형광 강도 증가 때문에 야생 유형 (WT) 처럼 동작 하는 eTRPV1에 단일-시스테인 돌연변이 (E651C 및 A702C)의 몇 가지 예를 보여 줍니다. 셀, 캘리포니아2 + 26영상에서 같이. 다른 한편으로, A680C로 형광은 배경에서 구별할 수 비 기능 시스테인 돌연변이의 전형적인 예입니다. A680C 돌연변이 추가 분석을 위해 제외 되었다. 후 Ca2 + 이미징 실험, 단일-시스테인 돌연변이 기능 그들의 생물 속성을 평가 하기 위해 TEVC 또는 패치 클램프를 사용 하 여 테스트 됩니다. 그림 2C 돌연변이 바깥쪽 정류 TRPV1 TEVC26정한 ph 5, 도전 때의 특성을 정리를 보여 줍니다. 단일-시스테인 돌연변이의 기능 분석 식 및 정화 프로토콜을 착수 하기 전에 첫 번째 검사점입니다.
ETRPV1 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성
위에서 설명한 정화 프로토콜 TRPV1 순서를 따라 시스테인 화학식 수정 (예:fluorophores, 회전 표시 [SL] 메 틸-methanethiolsulfonate)를 통해 표시 될 수 있다 세제 solubilized 단백질 생성 분 광 분석입니다. 최소 TRPV1 시스테인 잔류물을 포함 하는 채널 안정 및 단 분산 종족으로 마이그레이션 (~ 13.6 mL), 크기 배제 크로마토그래피 (그림 3)에 의해 결정. eTRPV1 및 단일-시스테인 스핀 표시 된 돌연변이 (E651C-SL와 SL A702C) 최소한의 TRPV1 구조 (그림 3)26여 보안과 차입 프로필 정리. 차입 프로필 단일 시스테인 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 뮤턴트 들 다 수 있습니다. 어떤 경우에 돌연변이 형성 집계; 그리고 샘플의 분수 수 열 (8-9.5 mL), (그림 3, 빨간색 아래쪽 화살표) tetramer로 마이그레이션합니다 단백질의 양을 감소의 무효 볼륨에 elute. 이 경우에, 셀 문화 볼륨 집계 분수 또는 하나에 단백질 추가 분석에서이 돌연변이 제외 하 고 이웃 잔류물 테스트 진행 수에 대 한 보상 확장할 수 있습니다. 다른 예로 tetramer에 해당 하는 피크의 확대. 그들은 멀티 포함 주요 봉우리 3 mL 보다 넓은 분 광 분석에 대 한 권장 하지 않습니다-종 분산. 스핀 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성화 사업 재구성 및 분 광 분석 하기 전에 두 번째 검사점입니다.
기능 특성의 재구성 회전 표시 된 eTRPV1 단일-시스테인 돌연변이
EPR 및 사슴 신호 시스테인 잔류물을 상자성 스핀 라벨 부착에 의존 하기 때문에 그건 스핀-라벨의 위치 단백질 기능 변경 여부를 확인 하는 것이 중요. 회전 표시 된 단백질, 평면 지질 bilayer 실험, 패치 클램프, 및 TEVC를 포함 하 여 재구성 후 기능에 대 한 테스트 하는 방법은 여러 가지가 있습니다. TEVC는 거시적인 전류를 기록 하는 동안 회전 표시 된 채널의 다 수의 평가 허용 한다. 회전 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 기능을 평가 하기 위해 채널은 미리 형성 된 asolectin 리에서 재구성 된다. 이 단계는 정화를 통해 글리세롤 리로 단백질 재구성의 효율성 감소 이후 10% 글리세롤을 제외 하는 것이 중요입니다. 그림 4 는 대표 A702C SL TRPV1의 결과 asolectin 리 재구성 및 Xenopus oocytes에 microinjected. 예상 했던 대로, pH 5 elicits 강력한 겉으로 정류 전류37 TRPV1 길 항 제 (CPZ, 블루 추적) capsazepine26의 공동 응용 프로그램에 의해 차단 되는. 스핀 라벨 및 재구성 후 기능을 유지 하지 않는 돌연변이 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 재구성된 스핀 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성화 사업 분 광 분석 전에 세 번째 검사점입니다.
구조 역학의 회전 표시 된 eTRPV1 돌연변이 의해 모니터링 CW EPR과 사슴
Nitroxide 스핀 라벨은 주변 환경에 민감한 고 라벨은 단백질 백본의 유연성 첨부17. 따라서, CW-EPR 수 주어진된 회전 표시 된 시스테인;의 동적 처방의 결정 즉, 위치 수성 미디어 나 막에 노출 되는 단백질 단백질 상호 작용17제한 보다 더 역동적인. 그림 5A TRPV1 이동성 매개 변수를 모니터링 하도록 선택의 Glu651, Ile679, 및 Ala702 위치를 보여줍니다. 스핀 레이블 프로브의 이동성 매개 변수를 계산 하려면 하나 (그림 5B, 검은 선 ΔHo−1) 첫 번째 파생 흡수 스펙트럼의 중앙 선 두께의 역을 계산 합니다. 예를 들어, E651C-SL (그림 5B)는 괴기 한 선 모양 및 이동성 값을 표시 (0.24) 막 인터페이스26동적 위치에 일반적으로 발견 합니다. 다른 한편으로, I679C-SL와 SL A702C (점선 참조) 스펙트럼과 이동성 값 감소의 확장을 전시 (0.16 및 0.18, 각각; 그림 5B) 26 곳을 알아내는-EM 구조1에 따르면 그들의 제한 된 주변 환경 (단백질)와 일치 하는.
그림 5C asolectin 리에서 재구성 후 회전 표시 TRPV1 돌연변이의 스펙트럼을 보여준다. 예상 했던 대로, 그들의 모양 및 이동성 값은 막 환경26에서 솔루션에 동일 E651C SL와 SL A702C에 대 한 스펙트럼의 동적 기능 재구성, 후 변화 하지 않았다. 다른 한편으로, I679C-SL 보여줍니다 시끄러운 스펙트럼을; 따라서, (파란색 화살표)과 높은 (빨간 화살표) 필드 구성 요소 덜 분명 되었다. 시끄러운 스펙트럼은 하지 일반적으로 원하는, 그들은 회전 표시 위치 이동성을 과소 평가 하는 경향이. 강력한 솔루션에서 I679C SL 신호 이므로 이와 같은 스펙트럼에서-라벨, 보다는 오히려 비효율적인 단백질 재구성의 제품 수 있습니다.
사슴 데이터 합계 진동, 정현파 신호 부패 한다 상호 작용 스핀 레이블38,39의 거리 배포에 대 한 정보를 포함 하는. 기간 및 복잡 한 감퇴의 직접 기본 거리 분포를 반영 한다. 거리 유통 구조 부품 샘플 및 그들의 장애에 수 구성 됩니다. 시간 영역 신호는 배위에서 파생 하는 따라서, 일반적으로 배경 지 수 감퇴 원인이 솔루션에 고정 되지 않은, 먼 스핀 레이블 사이의 커플링, andrigidly 결합 같은 단백질19,40내 스핀. 특히, 사슴 스핀 표시 된 잔류물19사이 내 단백 장거리 거리 (20-70 Å)의 결정을 허용 한다. 그림 6 신호 감퇴 E651C SL의 해당 거리 배포를 보여 줍니다. Glu651의 분포는 24, 36, 및 58 Å26에 해당 하는 3 개의 봉우리를 보여줍니다. 닫힌된 TRPV1 구조와 일치 하는 두 개의 짧은 거리 (23, 32 Å Cβ Cβ 거리, 각각)1, 반면 3 58 Å 피크 단백질 집계 일치 수도 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig1.jpg"> 그림 1입니다. 실험 개요. 표현, 정화, 및 EPR 및 사슴에 대 한 eTRPV1를 다시 구성 하는 데 필요한 실험 개요의 도표. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57796/57796fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig2.jpg"> 그림 2입니다. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성. (A)의 분 광 분석에 사용 되는 TRPV1 구문 도식 표현 (eTRPV1: 시스테인-덜 TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 세포 표현 WT TRPV1, eTRPV1, 및 돌연변이 (Ca2 +로드-민감한 Fluo-4-오전) capsaicin (10 µ M)에 대 한 분석 했다-형광 캘리포니아2 + 이미지를 사용 하 여 응답을 불러 일으켰다. 색상 막대 형광 강도, 블루와 레드 최저 / 최고를 나타내는 상대적 변화를 나타냅니다 세포질 캘리포니아2 +, 각각. 흰색 바 100 µ m. (C) 왼쪽, TRPV1 tetramer 구조 단일-시스테인 잔류물 (노란색 구체) 채널 시퀀스에 따라 도입 강조의 1 개의 소 단위 (S5, 기 공 나선, S6 및 TRP 도메인)를 나타냅니다. 오른쪽, 전류-전압 관계 Xenopus oocytes WT TRPV1, eTRPV1, 및 단일-시스테인 돌연변이 ph 5 도전 표현에서 TEVC 기록에 의해 결정 됩니다. 백그라운드 전류 (bkgrd)입니다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57796/57796fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig3.jpg"> 그림 3입니다. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성화 크기 배제 크로마토그래피 DDM solubilized eTRPV1 및 단일-시스테인 스핀 표시 된 돌연변이 식 및 Sf9 세포에서 정화 후의 프로 파일. 삽입: SDS 페이지 젤 (원래 그림26에서 수정) 단위체 eTRPV1 MBP 융합 단백질을 보여주는. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57796/57796fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig4.jpg"> 그림 4입니다. 회전 표시 eTRPV1 돌연변이의 기능 특성화 A702C ph 5 (레드) 도전 및 capsazepine에 의해 차단 전류-전압 관계 Xenopus oocytes 스핀 표시 된 포함 하는 proteoliposomes와 microinjected에서 TEVC에 의해 결정 (CPZ, 블루: 40 µ M). 백그라운드 전류 (bkgrd)입니다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57796/57796fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig5.jpg"> 그림 5입니다. CW-EPR에 의해 결정 하는 회전 표시 eTRPV1 돌연변이의 mobilities. 스핀 라벨 spectroscopies 사이트 감독을 통해 조사 하 여 아미노산 잔류물 (노란색 구체)를 강조 하는 TRPV1 tetramer 구조 (A) 2 subunits (S5, 기 공 나선, S6 및 TRP 도메인) DDM-솔루션에 스핀 표시 된 시스테인 돌연변이의 CW EPR 스펙트럼의 (B) 첫 번째 파생. (C) 회전 표시 된 시스테인 돌연변이 asolectin 리 재구성의 CW EPR 스펙트럼의 첫 파생. 스펙트럼은 pH 7.4 (닫힌된 상태)에서 얻은 했다. ΔHo−1 는 이동성 매개 변수의 크기를 나타냅니다. 검은 점선은 스펙트럼의 확대를 강조 표시 합니다. 파란색과 빨간색 화살표는 스펙트럼의 낮고 높은 필드 구성 요소를 각각 나타냅니다. EPR 스펙트럼 스핀 라벨의 총 수를 정상화 했다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57796/57796fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57796/57796fig6.jpg"> 그림 6입니다. 세제에는 eTRPV1 돌연변이의 거리 분포입니다. 사슴 에코 (A)와 거리 배포 (B) 스핀 표시 된 돌연변이 E651C; 가우시안의 합계는 사슴 데이터에 장착 했다. P(r) 스핀 쌍41의 거리 배포를 나타냅니다. 스펙트럼은 pH 7.4 (닫힌된 상태)에서 얻은 했다. 원래 그림26에서 수정. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57796/57796fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K 조회수.  University of Tennessee Health Science Center. 이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

연구

생화학

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Ganglioside 추출, 정제 및 프로파일링

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...