우리는 브리트니 일과 그들의 기술 지원에 대 한 제시카 Onyak와 박사 류 알려주셔서 친절 하 게 그의 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 감사 하 고 싶습니다. 지원의 승인: NIH R15EY026255-01 '과 칼 Kirchgessner 재단.

<ol>
	<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li><li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina.">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li><li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites:+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina.">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li><li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types.">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li><li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina.">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li><li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice:+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina.">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131 (2014).</li><li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes.">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li><li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+selectivity+in+the+retina:+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function.">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li><li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Ikbkap+causes+slow,+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia.">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li><li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map.">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938 (2013).</li><li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion.">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina.">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612 (2015).</li><li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma.">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li><li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function+of+the+M4+cell,+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision.">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li><li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina:+Rod+and+cone+photoresponses.">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space.">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li><li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+eye:+Opsins,+photoreceptors,+retina+and+eye+cup.">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li><li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina:+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package.">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

확인 하 고 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막의 방향을 라벨 없음, 표준화 된 프로토콜이 되었습니다. 프로토콜 상세 표준화 함으로써이 공 허를 채우기 위해 시도 여기 고 깊은 해부학 적 랜드마크를 사용 하는 방법을 자세히 참조 포인트를 안정적으로 망막 방향을 식별 합니다. 그것은이 프로토콜에서 깊은 해 부 랜드마크 방향을 마우스 망막 각 막 화상22같은 피상적인 랜드마크 보다 더 정확 하 고 안정적인 방법을 제공 표시 되었습니다. 따라서, 망막 방향에 대 한 각 막 화상에 의존 해야 하는 연구 방향 곧바로 근육, 맥락 막 균열 등 랜드마크에 의존 해야 하는 연구 보다 큰 오류 했다가지고 수 있습니다. 이 불일치에 대 한 필요성 및 결과 해석 하 고 연구 된 정확한 망막 오리엔테이션 사이 비교에 관하여이 표준화 된 프로토콜의 중요성을 강조 표시 합니다. 전반적으로, 표준화 된 프로토콜 제공할 것입니다 비전 연구자에 따라, 일반적인 방법은 망막을 식별 하기 위한 비 표준화 된 방법의 사용으로 발생할 수 있는 데이터 수집에 혼란 변수의 존재 없다 방향입니다.
여기에 제시 된 방법 쉽게 반복 하 고 실험 프로토콜의 많은 종류에 적용할 수 있습니다. 사실,이 프로토콜의 가장 큰 장점 중 하나는 그것의 적응성입니다. 맥락 막의 균열, s opsin 표현과 곧바로 근육 랜드마크 모든 발견 되었습니다 안정적으로 망막 방향22 를 식별 하기 때문에 랜드마크 실험적인 매개 변수에 가장 적합 한 데이터 수집 (테이블을 최적화 하기 위해 선택 될 수 있다 1). 또한, 해 부의 방법을 더 망막의 방향을 명확히 하기 위하여 결합 될 수 있다. 예를 들어 맥락 막 게 인하 결합 될 수 있다 s opsin immunohistochemistry 망막의 모든 4 개의 극의 방향을 위해: 맥락 막 게 상처, 비 강 및 일시적인 반구를 식별할 수 있습니다 및 s opsin immunohistochemistry 식별할 수 복 부와 등 쪽 반구입니다. 그러나,이 프로토콜의 적응성 생리학 실험의 시간-민감한 성격에 의해 제한 될 수 있습니다. 랜드마크를 식별, 각 막 화상, 고 구호 컷을 실행 하는 데 걸리는 시간 ex vivo 실험에서 중요 한 조직의 죽음 귀 착될 수 있었다, 때문에 일부 이러한 절 개 방법의 최적의 수 있습니다. 다행히도, 깊은 랜드마크를 식별 하 고를 완화 하는 것 맥락 막 균열 또는 우수한 곧바로 근육 해 부 방법, 익숙한 되고있다 일단 인하 해 부 루틴의 일부가 빠르고 크게 추가 하지 마십시오 해 부의 길이입니다. 우리는 여기서 설명 하는 단계 시간에 매우 민감한 실험 시간에 추가할 수 없습니다 인정 할 조직의 생존 능력은 더 이상 문제 (그림 3 때 망막 방향 특별 게시물 에 대 한 s opsin 그라디언트를 사용 하 여 것이 좋습니다. ). S opsin로 모든 4 개의 극을 식별할 수 있는 망막, 하는 효과적인 방법에 대 한 망막을 얼룩이 지기: s opsin 얼룩 망막 등 쪽과 복 부 극으로 나누고 비 강 및 임시의 식별 여부에 따라 기둥을 허용 망막 오른쪽 또는 왼쪽 눈 (그림 3)에서 이다. 따라서, 우리는이 프로토콜 실험적인 매개 변수를 충족 수 있습니다 정확 하 게 망막 방향에 대 한 방법의 안정적이 고 반복 가능한 집합을 제공 믿습니다.
어떤 수정 된 망막 해 부 해 부 방법의 타당성은는 것과 고립 된 조직의 품질의 정확도 의해 제한 됩니다. 어떤 조직을 절 개 하는 동안 손실 됩니다 경우는 망막은 너무 정확한 재건에 대 한 손상, Retistruct 및 MATLAB 프로그램 되지 않습니다 안정적으로 재구성 하거나 망막의 방향을. 그것은 따라서 실험 데이터를 수집 하기 위해 그것을 사용 하 여 전에 절 개 방법을 연습 하는 것이 중요입니다. 해의 종류 설명 여기 어려운 되지 않습니다, 하는 동안 그들은 특정 랜드마크 망막 방향 식별의 반복성을 보장 하기 위해 연습 해야 합니다. 또한, 올바른 랜드마크 특정 게 데이터 수집을 시작 하기 전에 해부학 적 랜드마크를 시각적으로 식별 하는 것 연습 사용이 필수적입니다. 특정 것의 정확성을 확인 하는 방법 중 하나는 어느 맥락 막 균열 수 있도록 인하 또는 우수한 곧바로 근육 하 고 고정된 표식 이며 따라서 dissectio의 정확도에 의존 하지 않습니다 이후 s opsin 그라데이션을 상처의 위치 비교 명. 잠재적인 dissectors 또한 인하는 그림 1 에 표시 된 정확한 랜드마크와 재건된 망막의 예에 그들의 재건된 망막을 비교할 수 있습니다 및 그림 2. 본질적으로, 잠재적인 것 특정 해 부 형식에 대해이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 수행 해야 합니다, 여부 우수한 곧바로 근육 또는 맥락 막 균열 방법, 및 s opsin 그라데이션 설정의 유효성을 결과 비교할 수는 특정 것입니다. 것은 랜드마크의 위치에 대해 확실 하지 않으면 망막의 부정확 한 방향으로 될 수 있기 때문에 것입니다 기본적으로 영향을 데이터 수집 및 해석.

망막 신경 과학의 중요 하 고 때로는 간과 측면은 전기 생리학 기록 실에서 또는 조직학 슬라이드에 망막의 방향을 적절 한 방향 및 고립 된 전체 마운트 망막의 분석 이다. 이것은 포유류 시각 시스템의 조사에 대 한 가장 널리 사용 되는 모델은 현재 마우스 망막과 관련 된 연구를 위해 특히 중요 하다. 최근의 발견 공개 마우스 망막이 공간적으로 균일 하지만 melanopsin 신경 절 세포, 과도 OFF-알파 신경 절 세포, 원뿔 opsins1,2 등 기능적으로 뚜렷한 망막 세포 유형의 밀도 및 크기 그라디언트는 ,3,,45. 따라서, 망막의 방향을 결정 하는 데 사용 하는 방법 실험 결과 셀 형식 또는 opsin 배포판2,,36을 포함을 영향을 미칠 수 방향 선택의 방향 조정 신경 절 세포7,,89, 그리고 망막 변성10,,1112,13,14의 지형 패턴 . 사실, 안 보고 어떻게 망막 방향을 보고 발생할 수 있습니다 불일치 문학과 혼란에 연구 사이의 데이터를 비교 하려고 할 때. 그것은 따라서 연구팀은 이러한 연구의 결과 정확 하 게 해석 될 수 있도록 망막의 방향을 식별 하는 방법 보고.
망막 방향 일반적으로 안구 enucleation1,3,12,,1516,17 이전 등, 복 부, 비 강 또는 일시적인 각 막 점수 구분 ,,1819 또는 절단 또는 깊은 해 부 눈 아 안구 근육6,7같은 얼룩, 맥락 막 게20,21, 또는 s-opsin 그라데이션2,3. 곧바로 근육 식별 하는 등, 복 부, 비음, 일시적인 망막 우수한 곧바로, 열 등 곧바로, 중간 곧바로, 또는 측면 곧바로 근육, 깊은 구호 컷 하나의 첨부 파일을 양분 하 여 각각 사용할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 실험에 대 한 하나의 곧바로 근육을 사용 하 여 망막22방향을 위해 충분 하다. 맥락 막 게 눈 개발의 나머지는 눈의 뒤에 희미 한 가로 라인으로 볼 수 있습니다. 이 선의 각 끝 비음 또는 세계23의 시간 극에서 종료합니다. 마지막으로, s-opsin 식 쥐, 복 부 망막에 비대칭으로 배포 되 고 s opsin 항 체 immunohistochemical 실험1에서 복 부 망막을 사용할 수 있습니다.
최근 작품 Stabio, 외. 22 각 막 화상 등 피상적인 눈 랜드마크는 해 부 공간, 인간의 오류 및 임시 및 중간 사용 하는 경우 각 막 화상에 변화 가능성이 높습니다에 망막 방향을 위한 덜 안정적인 방법 시연 참조 점으로 canthi입니다. 반면, 우수한 곧바로 근육, 맥락 막 균열 및 s opsin 그라데이션 같은 깊은 랜드마크 망막22방향을 위한 더 안정적이 고 정확한 랜드마크 될 표시 되었습니다. 그러나, 이러한 해부학 적 랜드마크의 식별 문학에서 자세히 설명 되지 않은 독특한 절 개 단계를 요구 한다. 따라서,이 프로토콜의 목표는 우수한 곧바로 근육, 맥락 막 균열 및 s opsin 그라디언트를 사용 하 여 마우스 망막의 공간적 방향 정확 하 게 식별 하는 방법에 대 한 포괄적인 자습서를 제공 하는 것입니다. 또한, 우리는 두 s opsin 항 체, s opsin immunohistochemistry에 대 한 프로토콜의 효과의 비교를 포함 했다.
정확 하 게 망막 방향에 의존 하는 연구를 한 추가 도전 wholemount 망막 녹음 실, 접시, 또는 슬라이드에 병합 하는 데 필요한 큰 구호 컷입니다. 이 편평한 2 차원 구조로 군데는 무엇 인지 자연스럽 게 3 차원 구조 분석에 대 한 문제를 발생할 수 있습니다. Retistruct24 라는 프로그램 돌아갑니다 플랫 wholemount 망막의 3 차원 구조 그것에서 수집 된 데이터를 분석 하기 전에 사용할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜의 섹션 Retistruct 소프트웨어를 사용 하 여 s opsin immunostained 마우스 망막을 재구성 하는 데 필요한 단계를 강조 전용입니다. 우리는 또한 s opsin로 얼룩진 정확 하 게 회전 하 고 동양 마우스 망막에 개발 되었다 우리의 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용 하 여 프로토콜의 섹션을 포함.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1499px;" width="1498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">0.1 M Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:125px;">P5244</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Axioplan2 Epifluorescent Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Zeiss</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Clear Nailpolish</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS6780FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Costar TC-Treated 24-well Plates</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;">SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Goat Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey Normal Serum</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">566460</td>
			<td>Use at 5.2% (52 &#956;L with 86 &#956;L of 20% Triton X-100 and 863 &#956;L of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Goat anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Santa Cruz Biotechnologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">sc-14363</td>
			<td>Not commerically available as of 2017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Graefe Curved Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">ImageJ or FIJI</td>
			<td style="width:243px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td>
			<td style="width:243px;">Bovie Medical Corporation</td>
			<td style="width:125px;">AA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">MATLAB</td>
			<td style="width:243px;">MathWorks</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">At least version 2007b or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Micro Cover Glasses&#160;</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Micro Slide Trays</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">82020-913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Moira Ultra Fine Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:125px;">11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">HAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:243px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">15714-S</td>
			<td>Use at 4% (25 &#956;L and 875 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm)&#160;</td>
			<td style="width:243px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:125px;">305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Pyrex Glass Petri Dish</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3160152</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">R</td>
			<td style="width:243px;">The R Project for Statistical Computing</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software; version 3.4.3 or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Rabbit anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">ABN1660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Retiga R3 Microscope Camera</td>
			<td style="width:243px;">Qimaging</td>
			<td style="width:125px;">01-RET-R3-R-CLR-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Retistruct</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software&#160; compatiable with Windows 7 or Windows 10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">14-390-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">T8787</td>
			<td>Use 1.7% (86 &#956;L of 20% Triton-X with 52 &#956;L of Donkey Normal Serum and 863 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Vannas Spring Dissection Scissors&#160;</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">5MP USB Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:243px;">AmScope</td>
			<td style="width:125px;">MU500</td>
			<td>To be used with the Olympus Dissection Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

where you cut matters: a dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks

시각 신경 과학, 밀도의 분석 및 망막 세포 유형의 크기 그라디언트를 포함 하 여 많은 연구에 대 한 중요 하다 정확 하 고 안정적으로 식별 격리 된 마우스 망막의 공간적 방향 방향 선택의 방향 조정 신경 절 세포와 일부 망막 질병에 지형 변성 패턴의 시험. 그러나, 많은 다른 눈 해 부 문학에서 보고 된 사용 되는 방법이 식별 하 고 레이블을 마우스 망막에서 망막 방향 있다. 방향 등의 연구에 사용 하는 방법 자주 간과 하지 보고 어떻게 망막 방향 결정 됩니다 발생할 수 있습니다 불일치 문학과 혼란에 연구 사이의 데이터를 비교 하려고 할 때. 각 막 화상 등 피상적인 눈 랜드마크는 일반적으로 사용 하지만 최근 곧바로 근육, 맥락 막의 균열, 또는 s opsin 그라데이션 같은 깊은 랜드마크 보다 덜 신뢰할 수 표시 되었습니다. 여기, 우리는 정확 하 게 해 부하 고 격리 된 마우스 망막의 공간적 방향 문서화 깊은 눈 건축물의 사용에 대 한 포괄적인 가이드를 제공 합니다. 우리는 또한 두 s opsin 항 체의 효과 비교 하 고 s opsin immunohistochemistry에 대 한 프로토콜을 포함. S-opsin 그라데이션에 따라 망막의 Retistruct 소프트웨어와 함께 망막 재건 및 회전 사용자 지정 코드를 해야 하므로 우리 모두이 프로그램을 사용 하는 데 필요한 중요 한 단계를 제시 했습니다. 전반적으로,이 프로토콜의 목표 안정적이 고 반복 가능한 가장 실험 프로토콜에는 정확 하 게 망막 방향 위한 메서드 집합을 제공 하는. 이 작품의 지배적인 목표는 망막 방향 방법 미래 연구에 대 한 표준화입니다.

정확 하 고 확실 하 게 우수한 곧바로 근육을 양분 하는 하나의 구호 컷 등 쪽 망막 (그림 1)를 식별 합니다. 맥락 막 게 정확 하 고 안정적으로 시간적 및 비 강 맥락 막 균열 (그림 2)에 따라 깊은 구호 상처와 비 강 및 일시적인 망막을 식별합니다. 이 예제에서는 구호 컷도 했다 등 망막에 식별 (그림 2D, 수직 화살표) 망막의 등/복 부 축. 이 프로세스의 단계는 미래 dissectors에 의해 복제의 목적을 위해 표시 됩니다. S-opsin immunohistochemistry의 조합 (그림 3A 및 3D), Retistruct 소프트웨어 (3B, 3E)와 개조와 사용자 지정 MATLAB 코드 (3 C, 3 층)와 함께 정확한 회전 수는 비 강 및 일시적인 극 알려져 있다 (그림 3) 오른쪽 또는 왼쪽 눈에서 망막 인지 하는 경우는 망막의 복 부와 등 쪽으로 식별. 우리는 또한 라벨 s opsin 콘 (그림 4A-D)에 효과 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되는 s opsin 기본 항 체 비교: 두 염소 안티-s-opsin 기본 항 체와 토끼 안티-s-opsin 1 차적인 항 체 효과적으로 라벨 동일한 마우스에서 s opsin 콘 (그림 4E)
덜어 컷 s opsin immunostained 재건 망막에 발견 했다 하 고 그들의 위치 s opsin 그라데이션에 의해 결정 하는 방향으로 비교 했다. 우리의 사용자 정의 MATLAB를 사용 하 여 코드 ( 보충 자료참조), 망막 s opsin 얼룩의 높은 농도 ventrally, 따라서 진정한 배치 되도록 회전 정확 하 게 했다 (대 한 우수한 곧바로) 90 °, 0 ° (코에서 진정한 코 등 맥락 막 게) 180 ° (시간적 맥락 막 게)에서 임시 진정한. 각도 잘라 덜어 각각의 값은 후 망막 s opsin 그라데이션에 따라 회전 했다 ImageJ의 각 도구를 사용 하 결정 했다. 각 구호 컷 유형 평균 각도 계산 하 고 각 구호 컷된 타입의 평균 값 다음 극좌표 플롯 (그림 6)에 표시 했다. 평균적으로, 우수한 곧바로 근육 상처 확인 96.3 ± 4.3 °에 지 극 (n = 11) (그림 6). 비 강 맥락 막 게 식별 6.7 ± 5.8 °에서 비 강 극 하 고 시간적 맥락 막 게 식별 172.0 ± 4.4 °에 측 두 엽 극 (n = 9; 그림 6)입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg"> 그림 1: 우수한 곧바로 근육을 사용 하 여 정확 하 게 식별 하는 오른쪽 눈의 등 쪽 망막에. (A)로 팁 펜 (흰색 화살표)로 만든 scleral 각 막 국경 근처 등 각 막 화상의 예. 우수한 곧바로 근육이이 보기 (흰색 화살표)에 표시 이기도합니다. (B)는 전체 예는 구호와 함께 탑재 된 망막 잘라 우수한 곧바로 근육을 양분 하 여 등 쪽 망막에 만든. 화살표 등 망막에 우수한 곧바로 근육을 양분 하 여 만든 컷을 덜어 깊은 묘사. 망막은 1 차적인 항 체 염소 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조) 및 이차 항 체 당나귀 안티 염소 알 렉 사 594 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 여기: 590 nm; 방출: 620 nm) (청록색). 망막은 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데 (595 nm). (C) A 망막 Retistruct 재건축 및 MATLAB 코드를 사용자 정의 회전 ( 보충 자료참조)는 우수한 곧바로 근육을 덜어 볼 수 컷 (흰색 화살표)와 함께. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg"> 그림 2: 오른쪽 눈의 망막의 비 강 및 시간 폴란드를 정확 하 게 식별 하는 맥락 막 게를 사용 하 여. (A)로 팁 펜으로 만든 scleral 각 막 국경 근처 등 각 막 화상의 예. (B)는 맥락 막 게 sclera (흰색 화살표)에 눈의 뒤에 보이는. 등 각 막 화상 또한 시간적 맥락 막 균열에서 약 90 °에 위치한이 보기에 표시 됩니다. Scleral 각 막 경계에 시 신경에서 여행 sclera 눈의 뒷면에 표시 (C) 맥락 막의 균열. (D) A 망막 염소 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조) 및 이차 항 체 당나귀 안티 염소 알 렉 사 594 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 여기: 590 nm; 방출: 620 nm) 맥락 막 게 인하 (가로 (녹청) 화살표) (수직 화살표)를 잘라 등 완화. 망막은 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데 (595 nm). (E)는 망막 Retistruct에 재건 된 고 등 구호 컷와 비 강 및 시간적 맥락 막 게 컷 표시 (흰색 화살표) 사용자 지정 MATLAB 코드 (보충 자료 참조)와 함께 회전. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg"> 그림 3: s-opsin 그라디언트를 사용 하 여 망막의 모든 4 개의 기둥을 식별 하. (A)는 망막의 예는 오른쪽 눈 immunostained s opsin 레이블이 되었으며 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데에서 해 부 (595 nm). 이 망막에 상처는 임의 지형 방향 s opsin 그라데이션에 의해 결정 됩니다. (B) Retistruct와 A에 망막을 재구성의 결과. 그 s opsin 그라데이션 올바르게 정렬 되지 망막 사용자 지정 MATLAB 코드 ( 보충 자료참조)를 통해 실행 하지 않은 때문에 알 수 있습니다. (C) 회전 하는 사용자 지정 코드 A에서 망막의 결과. 망막은 s opsin 얼룩의 높은 농도 하단에 회전 하 고 복 부 망막으로 식별. 오른쪽 눈에서 망막 이므로 일시적인 극은 지 느 러 미 극에서 시계 반대 방향으로 위치 90 ° 이며 비 극 위치 90 ° 등 극에서 시계 방향으로. (D)는 망막의 예 s opsin 라벨 immunostained 되었으며 텍사스 레드 필터 몇 군데 왼쪽된 눈에서 해 부 (595 nm). 이 망막에 상처는 임의 지형 방향 s opsin 그라데이션에 의해 결정 됩니다. (E) 디지털 d Retistruct와 망막을 재구성의 결과. 그 s opsin 그라데이션 올바르게 정렬 되지 때문에 망막에는 사용자 지정 코드에 의해 회전 되지 알 수 있습니다. (F) 사용자 지정 코드와 함께 d에서 망막 회전의 결과. 망막은 s opsin 얼룩의 높은 농도 하단에 회전 하 고 복 부 망막으로 식별. 왼쪽된 눈에서 망막 이므로 코 극 위치 90도 시계 반대 방향으로 지 느 러 미 극에서 이며 일시적인 극 등 극에서 시계 방향으로 위치한 90 ° 이다. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg"> 그림 4: 라벨 s opsin 콘에서 두 개의 기본 s opsin 항 체의 비교. (A) A 망막 염소 안티-s-opsin 1 차적인 항 체 물 ( 재료의 표참조). (B) 같은 마우스의 다른 망막 토끼 항 체 안티-s-opsin 기본으로 물 ( 재료의 표참조). (C) A 대표 지역 (0.1 x 0.1 m m2) 염소 안티-s-opsin 1 차 항 체로 얼룩진 망막에서. 40 X 확대 epifluorescent 현미경에 찍은 이미지. (D) A 대표 지역 (0.1 x 0.1 m m2)는 망막에서 토끼 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조), 기본 항 체 대체. 이미지는 40 X 확대 epifluorescent 현미경에서 촬영 됐다. (E) 두 항 체의 콘 외부 세그먼트의 동일한 수 라벨 immunopositive s-콘은 염소 안티-s-opsin와 토끼 안티-s-opsin 테스트 망막에서 스테인드 수에 상당한 차이가 있기 때문에 기발 (n = 2; ANOVA와 임시 게시 Bonferroni 테스트; p > 0.05). 스케일 바 = 1 mm (A-B); 25 µ m (C-D) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg"> 그림 5: 망막 immunostained s opsin로 재구성 하는 Retistruct 소프트웨어를 사용 하는 비주얼 가이드. (A) A 망막 표시 개요 Retistruct에 열 하 고는 "눈물" 추가. "눈물"의 포인트는 겹쳐 흰색 화살표와 함께 표시 됩니다. 이 망막에 모든 상처는 임의 아니 특정 랜드마크 해 부 동안 망막 방향을 표시 하는 데 사용 되었다 있습니다. 중요 한 버튼은 빨간색으로 설명 되어 있습니다. 모든 "눈물" 추가 (B) 망막 그리고 망막의 가장자리에 "D"로 식별 하는 등 망막. "재구성 망막" 버튼 표시는 알. 중요 한 버튼은 빨간색으로 설명 되어 있습니다. (C)는 망막을 재구성 하는 과정. 재건축된 망막의 극 작 녹청 (파란색 화살표 컷된 위치를 명확 하 게 겹쳐)에 상처를 덜어 표시 오른쪽에 표시 됩니다. (D)는 망막 Retistruct 통해 실행의 최종 결과. 원래 wholemount 망막 왼쪽에 남아 있고 재건된 망막 오른쪽에 나타납니다. 덜어 삭감 녹청 (흰색 화살표 컷된 위치를 명확 하 게 겹쳐)에서 볼 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg"> 그림 6: 우수한 곧바로 근육 및 맥락 막 게 마우스 망막 하 정확 하 게 사용할 수 있습니다. 어느 우수한 곧바로 근육 상처를 덜어에서 얻은 각도의 극좌표 플롯 또는 Retistruct로 재구성 된 망막에 맥락 막 게 인하. 덜어 컷 s opsin immunostained 재건 망막에 발견 했다 하 고 그들의 위치 s opsin 그라데이션의 위치를 비교 했다. 코 (비 강 맥락 막 균열에 대 한 0 °)를 true와 시간적 (180 ° 시간적 맥락 막에 대 한 진정한 s opsin 얼룩의 높은 농도 ventrally 위치, 진정한 지 (90 ° 우수한 곧바로)는 망막을 정확 하 게 회전을 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용 하 여, 게) 각 망막에 대 한 결정 했다. 각 개별 덜어 컷된 각도 ImageJ에 평균 각도 결정 했다의 값 형식 잘라 덜어 각 산출 되었다. 우수한 곧바로 근육 상처 확인 96.3 ± 4.3 °에 지 극 (n = 11). 비 강 맥락 막 게 식별 6.7 ± 5.8 °에서 비 강 극 하 고 시간적 맥락 막 게 식별 172.0 ± 4.5 °에 측 두 엽 극 (n = 9). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>깊은 랜드마크</td>
			<td>각 막 화상 위치</td>
			<td>식별 하는 망막의 극</td>
			<td>실험적인 응용 프로그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>탁월한 곧바로</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>라이브 또는 고정</td>
		</tr>
<tr>
<td>비 강 맥락 막 게</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>코</td>
			<td>라이브 또는 고정</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간적 맥락 막 게</td>
			<td>지 느 러 미</td>
			<td>임시</td>
			<td>라이브 또는 고정</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsin 그라데이션</td>
			<td>없음</td>
			<td>등, 복 부, 비 강, 시간적</td>
			<td>고정</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 깊은 랜드마크, 망막의 극 그들은 식별, 그리고 여부 그들은 라이브 또는 고정 조직의 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

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Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

이 프로토콜 하 정확 하 고 확실 하 게 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막 깊은 눈 랜드마크, s opsin immunohistochemistry, Retistruct, 및 사용자 지정 코드의 사용에 대 한 포괄적인 해 부와 분석 가이드를 제공 합니다.

어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K 조회수.  The University of Akron. 이 프로토콜 하 정확 하 고 확실 하 게 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막 깊은 눈 랜드마크, s opsin immunohistochemistry, Retistruct, 및 사용자 지정 코드의 사용에 대 한 포괄적인 해 부와 분석 가이드를 제공 합니다.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

연구

신경과학

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

의 활동을 Quantifying CIS</emExplant Electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

쥐의 뇌에서 뇌 표면 Vasculature 및 관련 Meninges의 해부 및 맥락막 얼기의 시각적 설명

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

왕새우의 Swimmeret 시스템 : 신경 코드 및 모터 패턴의 세포 외 녹음의 해부를위한 실무 가이드

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. Lineage-specific transcription factors are considered to play essential roles in cell specification and differentiation during development. ChIP coupled with high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) is widely used to analyze genome-wide binding sites of transcription factors (or its associated complex) to genomic DNA. However, a large number of cells are required for one standard ChIP reaction, which makes it difficult to study the limited number of isolated primary cells or rare cell populations. In order to understand the regulatory mechanism of oligodendrocyte lineage-specific transcription factor Olig2 in acutely purified mouse OPCs, a detailed method using ChIP-seq to identify the genome-wide binding sites of Olig2 (or Olig2 complex) is shown. First, the protocol explains how to purify the platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFR&#945;) positive OPCs from mouse brains. Next, Olig2 antibody mediated ChIP and library construction are performed. The last part describes the bioinformatic software and procedures used for Olig2 ChIP-seq analysis. In summary, this paper reports a method to analyze the genome-wide bindings of transcriptional factor Olig2 in acutely purified brain OPCs.

Here we present a protocol which is designed to analyze the genome-wide binding of the oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2) in acutely purified brain oligodendrocyte precursor cells (OPCs) by performing low-cell chromatin immunoprecipitation (ChIP), library preparation, high-throughput sequencing and bioinformatic data analysis.

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

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망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

의 활동을 Quantifying CIS - 규제 요소

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작

쥐의 뇌에서 뇌 표면 Vasculature 및 관련 Meninges의 해부 및 맥락막 얼기의 시각적 설명

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

왕새우의 Swimmeret 시스템 : 신경 코드 및 모터 패턴의 세포 외 녹음의 해부를위한 실무 가이드

이미징 CA

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

분자 분석을 위한 소뇌 지역 해부