ブルターニュは、その技術支援のジェシカ Onyak、リュー親切に私たちは彼 epifluorescent 顕微鏡を使用させるために感謝したいと思います。サポートの確認: NIH R15EY026255-01 とカール ・ Kirchgessner 財団。

<ol>
	<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li><li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina.">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li><li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites:+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina.">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li><li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types.">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li><li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina.">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li><li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice:+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina.">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131 (2014).</li><li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes.">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li><li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+selectivity+in+the+retina:+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function.">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li><li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. 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A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map.">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938 (2013).</li><li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion.">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina.">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612 (2015).</li><li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma.">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li><li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function+of+the+M4+cell,+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision.">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li><li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina:+Rod+and+cone+photoresponses.">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+type,+size,+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts.">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li><li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors:+differences+between+an+albino+(Swiss)+and+a+pigmented+(C57/BL6)+strain.">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice.">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina.">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li><li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space.">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li><li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+eye:+Opsins,+photoreceptors,+retina+and+eye+cup.">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li><li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina:+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package.">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ない包括的な標準化されたプロトコルを確認し解剖学的スペースでマウス単離網膜の方向をラベリングされています。プロトコルの詳細ここで標準化することによって、この空白を埋めるしようと深い解剖学的ランドマークを使用する方法について詳しく説明するポイントを確実に参照として識別網膜の方向。このプロトコルの深い解剖学的ランドマークが角膜の火傷22など表面的なランドマークよりマウス網膜の方向付けのためのより正確で信頼性の高いメソッドを提供することが示されています。したがって、網膜の方向の角膜の火傷に頼ってきた研究にあったかもしれないより大きいエラー脈絡裂、腹直筋などのランドマークに頼ってきた研究よりも向き。この不一致は、結果を解釈し、正確な網膜の向きに依存する研究間で比較を行うこの標準化された議定書の意義と必要性を強調表示します。全体的にみて、ビジョン研究者に従うの一般的な方法を提供する標準化されたプロトコルがなくなり、網膜を識別するための標準メソッドを使用が発生するデータ集録の交絡変数の存在向きです。
紹介した方法は、簡単に再現性と実験的プロトコルの多くの種類に適用されます。実際には、このプロトコルの最大の利点の 1 つはその適応性です。データ集録 (テーブルを最適化する実験的パラメーターに最適なランドマークを選択ことができます脈絡裂、s オプシン式と直筋ランドマークすべて発見されている網膜方向22を確実に同定するため1). さらに、郭清の方法はさらに網膜の方向を明確にまとめることができます。網膜のすべての 4 本の棒を方向づけるために s オプシン免疫組織化学と脈絡裂カットを組み合わせることができますたとえば、: 脈絡裂カットによって鼻と一時的な半球を識別でき、s オプシン免疫組織化学を識別することができます腹側と背側の半球。まだ、このプロトコルの適応性は、生理学実験の時間に敏感な性質によって制限可能性があります。ランドマークを識別、角膜のやけど、緩和カットを実行にかかる時間は、体外実験で重要な組織死で起因できる、未満の最適なこれらの郭清の方法のいくつかあります。幸いなことに、深いランドマークを識別し、緩和、解剖に脈絡裂または上直筋解離法に精通するなるとカット迅速に郭清のルーチンの部分になるし、大幅追加しないでください。郭清の長さ。組織の生存率はもはや問題 (図 3 網膜向きのホックを投稿の s オプシン グラデーションを使用してお勧めただし、ここで説明されている手順非常に時間に敏感な実験の時間に追加できることを認識、).S オプシンは、すべての 4 本の棒を特定すること、網膜を方向づけるための効果的な方法のために網膜を染色: 背側と腹側の極に網膜を分割し、可能にするかどうかによって鼻と時間の同定が極 s オプシン染色網膜右または左の目 (図 3) からです。したがって、このプロトコルが実験的パラメーターを満たすことができる正確な網膜方向法の信頼性と再現性のあるセットを提供と考えています。
として、任意の変更された網膜の郭清を伴う、郭清法の有効性は切開と隔離されている組織の品質の精度によって制限されます。解剖時に任意の組織が失われた場合、正確な再建のため、網膜が破損するとあまりにも Retistruct と MATLAB プログラムされません確実に再構築および網膜の方向を設定することができます。したがって、実験データ収集のために使用前に郭清法を実践することが重要です。解剖の種類は、ここで困難ではありませんを説明しながら、特定のランドマークと網膜の方向を識別する再現性の確保に練習されなければなりません。さらに、正しいランドマークと確信させるのにデータ収集を開始する前に解剖学的ランドマークを視覚的に識別する解剖実習が使用されていることが不可欠です。特定の凝固切開装置の精度を確認する方法の 1 つはいずれかの脈絡裂にカットまたは上直筋を切り取って固定マーカーは、したがって、dissectio の精度に依存しないので s オプシン グラデーションにカットの位置を比較(名) 潜在的な dissectors は、カットは図 1に示すように正確なランドマークと再建された網膜の例に再建された網膜を比較することもと図 2。基本的には、潜在的な解剖特定解離型のこのプロトコルで説明されている手順を実行する必要があります、かどうかは上直筋または脈絡膜裂法と結果の妥当性を確立する s オプシン グラデーションを比較、特定のバイナリ。網膜の不正確な方向に切開がランドマークの場所について確認の場合がありますので、デフォルトに影響を与えるデータの収集と解釈。

網膜神経科学の重要なと時々 見落された側面は適切な方向と全体マウント網膜の分析記録の部屋に電気生理学や組織学的のスライドの網膜の方向かどうか。これは、哺乳類の視覚系の調査のための最も広く使用されているモデルは、現在マウスの網膜を含む調査のため特に重要です。マウス網膜空間的に均一ではないが、メラノプシン神経節細胞、過渡 OFF α 神経節細胞、錐体オプシン1,2 などの機能的に異なる網膜細胞型の密度とサイズ グラデーションの最近の発見を明らかに ,3,4,5。その結果、網膜の方向性を決めるための手法がありますセル型オプシン分布2,3,6を含む実験結果方向が方向性のチューニング神経節細胞7,8,9, と網膜変性症10、11,12,13,14 の地形パターン.実際には、報告しないどのように網膜の方向を報告を引き起こす可能性が不一致文献および混乱の研究の間でデータを比較する際。したがって、研究者がこのような研究の結果を正確に解釈できるように網膜の方向を識別する方法を報告することが重要です。
網膜の方向の眼球摘出1,3,12,15,16,17 前に背側、腹側、鼻または一時的な角膜を得点によって識別される一般的 ,18,19外眼筋6,7など目の深い解剖学的ランドマークを染色したり、によって脈絡膜裂20,21, またはまたはs オプシン グラデーション2,3。腹直筋は上直筋、下直筋、内側直筋、外側直筋、いずれかの添付ファイルを二等分深い緩和カットすることによって背側、腹側、鼻と一時的な網膜をそれぞれ識別するために使用できます。ただし、ほとんどの実験では、1 つの直筋を用いたことで網膜22の方向付けのため十分です。目の開発の残骸である脈絡裂は、目の後ろにかすかな水平線として表示できます。この線の両端は、鼻腔またはグローブ23時間極のいずれかで終了します。最後に、s オプシンの発現は非対称マウスの腹側網膜に分散し、s オプシン抗体は免疫組織化学実験1で腹側の網膜を明らかにする使用ことができます。
Stabioらによる最近の仕事22角膜火傷等表面的な眼のランドマークが解剖学的スペース、ヒューマン エラーと角膜のやけどを作る時間と内側を使用する場合に可変性の原因で網膜の方向付けのため信頼性の低いメソッドであることを示した基準点として canthi。対照的に、上直筋、脈絡裂のオプシン グラデーションなどの深いランドマークは網膜22の方向付けのためのより信頼性の高い、正確なランドマークに示されています。しかし、これらの解剖学的ランドマークの同定文献で詳細に説明されていないユニークな解剖の手順が必要です。したがって、このプロトコルの目標は、上直筋、脈絡裂および s オプシン グラデーションを使用してマウス網膜の空間的なオリエンテーションを正確に識別する方法に関する包括的なチュートリアルを提供することです。さらに、我々 は s オプシン免疫組織化学のためのプロトコルと同様に、2 つのオプシンの抗体の有効性の比較を含まれています。
正確な網膜の向きに依存する研究に追加課題の 1 つは、記録室、料理、またはスライドで wholemount 網膜を平らにするために必要な大規模な緩和カットです。これはフラット二次元構造物としてイメージが作成されたとき、何が当然立体構造の解析のための課題を導入できます。それから収集したデータを分析する前に、その立体構造にフラット wholemount 網膜に戻ります Retistruct24と呼ばれるプログラムを使用できます。したがって、このプロトコルのセクションは Retistruct ソフトウェアを使用して、s オプシン immunostained マウス網膜の再構築に必要な手順を強調する専用です。我々 はまた正確に回転とオリエントのマウス網膜のオプシンとステンド グラスを開発した当社のカスタム MATLAB スクリプトを使用するためのプロトコルのセクションを含まれています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1499px;" width="1498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">0.1 M Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:125px;">P5244</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Axioplan2 Epifluorescent Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Zeiss</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Clear Nailpolish</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS6780FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Costar TC-Treated 24-well Plates</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:243px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;">SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Goat Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey anti-Rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Donkey Normal Serum</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">566460</td>
			<td>Use at 5.2% (52 &#956;L with 86 &#956;L of 20% Triton X-100 and 863 &#956;L of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Goat anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Santa Cruz Biotechnologies&#160;</td>
			<td style="width:125px;">sc-14363</td>
			<td>Not commerically available as of 2017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Graefe Curved Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">ImageJ or FIJI</td>
			<td style="width:243px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td>
			<td style="width:243px;">Bovie Medical Corporation</td>
			<td style="width:125px;">AA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">MATLAB</td>
			<td style="width:243px;">MathWorks</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">At least version 2007b or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Micro Cover Glasses&#160;</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Micro Slide Trays</td>
			<td style="width:243px;">VWR International</td>
			<td style="width:125px;">82020-913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Moira Ultra Fine Forceps</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:125px;">11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">HAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:243px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">15714-S</td>
			<td>Use at 4% (25 &#956;L and 875 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm)&#160;</td>
			<td style="width:243px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:125px;">305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Pyrex Glass Petri Dish</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">CLS3160152</td>
			<td style="width:751px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">R</td>
			<td style="width:243px;">The R Project for Statistical Computing</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software; version 3.4.3 or later</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Rabbit anti-s-opsin</td>
			<td style="width:243px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">ABN1660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Retiga R3 Microscope Camera</td>
			<td style="width:243px;">Qimaging</td>
			<td style="width:125px;">01-RET-R3-R-CLR-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Retistruct</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:751px;">Freely available software&#160; compatiable with Windows 7 or Windows 10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td>
			<td style="width:243px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">14-390-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:243px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">T8787</td>
			<td>Use 1.7% (86 &#956;L of 20% Triton-X with 52 &#956;L of Donkey Normal Serum and 863 &#956;L of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:380px;">Vannas Spring Dissection Scissors&#160;</td>
			<td style="width:243px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:125px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">5MP USB Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:243px;">AmScope</td>
			<td style="width:125px;">MU500</td>
			<td>To be used with the Olympus Dissection Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

where you cut matters: a dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks

正確かつ確実にマウス単離網膜の空間的なオリエンテーションを識別する視覚神経科学、密度の解析や網膜のセルタイプのサイズ グラデーションなど、多くの研究の重要な方向性のチューニングの方向神経節細胞といくつかの網膜疾患における地形変性パターンの検討。ただし、多くの異なる眼郭清の方法を文献で報告し、マウス網膜における網膜の方向をラベルに使用するがあります。方向のような調査で使用される方法はしばしば見落とされて、報告しないどのように網膜の方向を決定を引き起こす可能性が不一致文献および混乱の研究の間でデータを比較する際。角膜のやけどなど表面的な眼のランドマークが使われませんが最近腹直筋、脈絡裂のオプシン グラデーションなど深いランドマークより信頼性が低いことが示されています。ここでは、正確に分析し、マウス単離網膜の空間的なオリエンテーションを文書化する深い眼のランドマークの使用のため包括的なガイドを提供します。また 2 つのオプシンの抗体の有効性を比較して s オプシン免疫組織化学のためのプロトコルが含まれています。S オプシン グラデーションによると網膜の方向は、Retistruct ソフトウェアによる網膜再建とカスタム コードの回転を必要とするため、私たちはこれらのプログラムの両方を使用するために必要な重要なステップを発表しました。全体的に、このプロトコルの目標は、最も実験的プロトコルに適応できる正確な網膜向きのメソッドの信頼性と再現性のあるセットを提供することです。この作品の包括的な目標は、将来研究のため網膜方向メソッドを標準化することです。

正確かつ確実に直筋を二等分単一緩和カットは、背側の網膜 (図 1) を識別します。脈絡裂正確かつ確実に鼻と一時的な網膜を深い緩和時間と鼻の脈絡裂 (図 2) に沿って識別します。この例では、緩和のカットもしました背側網膜の網膜 (図 2D、垂直の矢印) の背/腹軸を識別するために。将来 dissectors によってレプリケーションの目的のこれらのプロセスの手順を示します。S オプシン免疫組織化学の組み合わせ (図 3 a と3 D)、(3 b, 3 e) Retistruct ソフトウェアによる再建とカスタム MATLAB コード (3 C、3 f) と正確な回転が可能、鼻と時間極これは網膜が右または左目 (図 3) かどうかがわかっている場合と同様に、網膜の腹側と背側半分の id。S オプシン コーン (図 4A ~ D) をラベリング効果の 2 つの一般的に使用される s オプシン一次抗体も比較した: 両方ヤギ アンチのオプシンの一次抗体、ウサギ抗のオプシンの一次抗体に効果的にラベルを付ける同じマウス s オプシン コーン (図 4E)。
緩和カットされた s オプシン再建 immunostained 網膜上識別され、s オプシン勾配によって決定される方位の場所を比較しました。当社のカスタム MATLAB コード (補足資料参照)、網膜のオプシン染色の最高濃度のある腹、真配置、正確に回転しました (直) の 90 ° で 0 ° (鼻の真の鼻背脈絡裂) と時間 (時間的脈絡裂) の 180 ° 真します。角をカット緩和個々 の価値は、網膜を s オプシン グラデーションによると回転した後に ImageJ で角度ツールを使用して決定されました。各緩和カットタイプの平均角度を計算したし、ポーラー プロット (図 6) でプロットしました緩和カット種類ごとの平均値。平均すると、筋肉のカットは上直筋識別 96.3 ± 4.3 ° 背極 (n = 11) (図 6)。鼻の脈絡裂 6.7 ± 5.8 ° 鼻ポールと一時的な脈絡裂示さ 172.0 ± 4.4 ° 時間極 (n = 9;図 6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg"> 図 1: 右目の背側の網膜を正確に識別する上直筋を使用しています。(A) 焼灼ペン (白い矢印) で作られた角膜強膜の国境近くの背側角膜火傷の例。上直筋はこのビュー (白い矢印) に表示されますも。全体の例 (B) 除去のマウントされた網膜は、上直筋を二等分して背側網膜に作られたカット。矢印は、上直筋を二等分によって背側網膜に作られたカットを緩和深を示しています。網膜は一次抗体ヤギ抗-s-オプシンと汚れる (材料の表を参照) と二次抗体ロバの反やぎ Alexa 594 (材料の表を参照してください励起: 590 nm; 排出量: 620 nm) (水色)。網膜をテキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡をイメージしました (595 nm)。(C) A 網膜 Retistruct で再建され、MATLAB のカスタム コードを使用して回転 (補足資料を参照してください)、上直筋効くと目に見えるカット (白い矢印)。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg"> 図 2: 脈絡裂を使用して正確に右目の網膜の鼻と時間の極を識別する。(A) 焼灼ペンで作られた角膜強膜の国境近くの背側角膜火傷の例。(B) 脈絡膜裂強膜 (白い矢印) で目の後ろに表示されます。背側の角膜のやけどは時間的脈絡裂から約 90 ° に位置する、このビューに表示も。(C) 脈絡膜裂強膜、角膜強膜の枠線を走行視神経からの目の後ろに表示されます。(D) は網膜に染まったヤギ抗-s-オプシン (材料の表を参照してください) と二次抗体ロバの反やぎ Alexa 594 (材料の表を参照してください励起: 590 nm; 排出量: 620 nm) 脈絡裂カット (水平 (シアン)矢印) 切り (垂直方向)、背側の緩和します。網膜をテキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡をイメージしました (595 nm)。(E) 網膜は Retistruct で再建され、背の緩和カットと鼻で、一時的な脈絡裂カット表示 (白い矢印) カスタム MATLAB コード (補足資料を参照してください) を使用して回転します。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg"> 図 3: s オプシンのグラデーションを使用して網膜のすべての 4 本の棒を識別する。S オプシンのラベルに immunostained をされており、テキサス赤フィルター付き epifluorescent 顕微鏡を用いたイメージング右目から網膜の例 (A) 解剖 (595 nm)。地形向き、s オプシン グラデーションによって決まりますので、この網膜でカット、任意です。(B) Retistruct A で網膜の再建の結果。S オプシン グラデーションがない正しく並んでいること網膜がカスタム MATLAB コード (補足資料を参照してください) を実行されていないので注意してください。(C) カスタム コードで網膜を回転の結果。網膜は、s オプシン染色の最高濃度は下部にありますように回転し、腹側の網膜として識別されています。網膜は、右の目からは、一時的なポールは位置 90 ° 背極から反時計回りに、鼻ポール位置 90 ° 背極から時計回りに。(D) 網膜の例は左眼のオプシンのラベルに immunostained をされており、テキサス赤フィルターでイメージから解剖 (595 nm)。地形向き、s オプシン グラデーションによって決まりますので、この網膜でカット、任意です。(E) Retistruct と D で網膜をデジタル再構成の結果。S オプシン グラデーションがない正しく並んでいること網膜がカスタム コードによって回転されていないので注意してください。(F) カスタム コードと D で網膜を回転の結果。網膜は、s オプシン染色の最高濃度は下部にありますように回転し、腹側の網膜として識別されています。網膜は、左の眼からは、鼻のポールの位置 90 ° 背極から反時計回りと一時的な棒が位置 90 ° 背極から時計回りに。D: 背, v: 腹側、t: 時間、n: 鼻。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg"> 図 4: s オプシン コーンをラベルに 2 つのプライマリ s オプシン抗体の比較。(A) A 網膜ヤギ抗のオプシンの一次抗体で染色 (材料の表を参照してください)。 (B) 同じマウスの他の網膜に染まったウサギ抗のオプシン一次抗体 (材料の表を参照してください)。(C) A ヤギ抗のオプシンの一次抗体で染色網膜から代表 (0.1 × 0.1 mm2)Epifluorescent 顕微鏡を用いた 40 倍の倍率で撮影した画像。網膜から (D) の代表的な地域 (0.1 × 0.1 mm2) に染まったウサギ抗-s-オプシン (材料の表を参照)、一次抗体の代替。イメージは、40 倍の倍率で epifluorescent 顕微鏡で撮影されました。(E) 両抗体のラベル s コーンの外側のセグメントの数が同じヤギ抗-s-オプシンとウサギ抗-s-オプシン テスト網膜の染色陽性の錐体の数に差がないので離心率 (n = 2;アドホックの記事ボンフェローニ テストと分散分析p > 0.05)。スケール バー = 1 mm (A B);25 μ m (C ・ D)。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg"> 図 5: s オプシンと網膜 immunostained を再構築する Retistruct ソフトウェアを使用するための視覚的なガイドします。アウトライン表示で Retistruct で開かれた A (A) 網膜と、「涙」に追加。「涙」のポイントは、スーパーイン ポーズの白い矢印で示されます。この網膜にあるすべてのカットは、します解剖時に網膜の方向をマークする特定のランドマークが使用されていない任意の。重要なボタンの輪郭が赤に。すべての「涙」追加 (B) A 網膜と網膜の端に"D"が付いて背網膜。「網膜の再構築」ボタンが表示されます注意してください。重要なボタンの輪郭が赤に。(C) 網膜の再建のプロセス。再建された網膜の極座標は、シアン (青い矢印のカット位置を明確にする重ね合わせ) でカット、緩和を示す右に表示されます。(D) Retistruct を通じて網膜を実行する最終的な結果。元 wholemount 網膜そのまま左側と右側再建された網膜に表示されます。緩和のカットは、シアン (カット位置を明確にする重ね合わせ白い矢印) で表示されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg"> 図 6: 上直筋と脈絡膜裂を正確にマウス網膜の向きを使用できます。カットを緩和、上直筋から得られる角度の極座標または脈絡裂は Retistruct と再建されている網膜にカットできます。緩和カットされた s オプシン再建 immunostained 網膜に識別され、s オプシン グラデーションの場所の場所を調べた。カスタムの MATLAB のコードを使用すると、正確に網膜を回転して s オプシン染色の最高濃度が腹側に位置する、真背 (90 ° 上直筋)、真の鼻 (鼻脈絡裂の 0 °)、真の一時的な脈絡膜のための一時的な (180 °裂) 各網膜を求めた。カット アングルは、ImageJ と平均の角度で決定されたそれぞれの個別緩和の値は、緩和の型をカットごとに算出しました。上直筋カット識別 96.3 ± 4.3 ° 背極 (n = 11)。鼻の脈絡裂 6.7 ± 5.8 ° 鼻ポールと一時的な脈絡裂示さ 172.0 ± 4.5 ° 時間極 (n = 9)。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>深いランドマーク</td>
			<td>角膜のやけどの場所</td>
			<td>識別される網膜の極</td>
			<td>実験的アプリケーション</td>
		</tr>
<tr>
<td>上直筋</td>
			<td>背側</td>
			<td>背側</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>鼻の脈絡裂</td>
			<td>背側</td>
			<td>鼻</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>一時的な脈絡裂</td>
			<td>背側</td>
			<td>一時的です</td>
			<td>ライブまたは固定</td>
		</tr>
<tr>
<td>S オプシン グラデーション</td>
			<td>どれも</td>
			<td>背、腹、鼻、時間</td>
			<td>固定</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 深いランドマーク、網膜の極彼らを識別するとかライブや固定組織のアプリケーションに使用できます。

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Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

このプロトコルは、正確かつ確実に東洋の解剖学的領域でマウス単離網膜に深い眼のランドマーク、s オプシン免疫組織化学、Retistruct、およびカスタム コードを使用するため包括的な郭清と分析のガイドを提供します。

事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K ビュー.  The University of Akron. このプロトコルは、正確かつ確実に東洋の解剖学的領域でマウス単離網膜に深い眼のランドマーク、s オプシン免疫組織化学、Retistruct、およびカスタム コードを使用するため包括的な郭清と分析のガイドを提供します。

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

神経科学

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

の活動の定量化シス</em植片エレクトロポレーションによってマウス網膜で>調節エレメント

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

ラットの脳から脳表面血管系および関連髄膜の解剖と脈絡叢のビジュアル解説

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

ザリガニのSwimmeretシステム：神経索と運動パターンの細胞外記録の解剖のための実践ガイド

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. Lineage-specific transcription factors are considered to play essential roles in cell specification and differentiation during development. ChIP coupled with high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) is widely used to analyze genome-wide binding sites of transcription factors (or its associated complex) to genomic DNA. However, a large number of cells are required for one standard ChIP reaction, which makes it difficult to study the limited number of isolated primary cells or rare cell populations. In order to understand the regulatory mechanism of oligodendrocyte lineage-specific transcription factor Olig2 in acutely purified mouse OPCs, a detailed method using ChIP-seq to identify the genome-wide binding sites of Olig2 (or Olig2 complex) is shown. First, the protocol explains how to purify the platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFR&#945;) positive OPCs from mouse brains. Next, Olig2 antibody mediated ChIP and library construction are performed. The last part describes the bioinformatic software and procedures used for Olig2 ChIP-seq analysis. In summary, this paper reports a method to analyze the genome-wide bindings of transcriptional factor Olig2 in acutely purified brain OPCs.

Here we present a protocol which is designed to analyze the genome-wide binding of the oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2) in acutely purified brain oligodendrocyte precursor cells (OPCs) by performing low-cell chromatin immunoprecipitation (ChIP), library preparation, high-throughput sequencing and bioinformatic data analysis.

PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;