저자는 무균 절차 아래 utero의 electroporation으로 수행하기 위해 그들의 도움 박사 캐슬린 매더스는 박사 장 - 필립 Mocho 박사 욜란다 사베드라 토레스 감사드립니다, 그리고 그녀의 도움 헤일리 우드 그림을 준비합니다. EP는 엘리자베스 피셔와 빅터 Tybulewicz에 Wellcome 신탁 기금에 의해 유럽 생물 학회의 장기 연맹 (FEBS) 친교 및 의학 연구위원회 (MRC) 경력 개발 화목, MAH (080174/B/06/Z)에 의해 지원되었다 , HW MRC의 학생이기 의한 EMBO 장기적인 교제와 RA에 의한. 이 작품은 Wellcome 트러스트 (086947/Z/08/Z)에서 프로젝트 교부금에 의해 및 권한 부여-원조 의학 연구 협의회 (U117570528)부터 FG에 의해 지원되었다

영국에서는 마우스가 위치해 사육 및 동물 (과학적 절차) 법령 1986 하에서 홈 오피스가 승인한 가이드라인에 따라 처리됩니다. 1. 준비 : DNA의 솔루션 및 니들 <ol><li> 내독소 무료 맥시 간이 키트와 플라스미드 DNA를 정화. 물에 원하는 농도로 주입에 대한 플라스미드 DNA 용액을 준비하고 주사를 시각화하는 (0.05 %의 최종 농도) 빠른 그린에 추가합니다. electroporation의 효율이 DNA 농도에 크게 의존. 1 μg / μl의 농도는 일반적으로 사용됩니다. 이 농도는 자신의 발전에 영향을주지 않고 electroporated 뉴런을 시각화하기에 충분합니다. 그러나 플라스미드 벡터뿐만 아니라 크기와 (사이토 메갈로 바이러스 프로 모터 / 확장기, 사이토 메갈로 바이러스 프로 즉각적인 초기 확장기와 닭 β-actin업자 융합 (배속) 발기인과 강한 표현 수준이 낮은 표현 수준)에 사용되는 모터에 따라<html> 표현 단백질의 안정성이 농도 (0.25 μg / μl ~ 5 μg / μl) 조정할 수 있습니다. </li><li> micropipette에 풀러를 사용하여 유리 바늘을 당기세요. </li></ol> 2. 외과의 작성 <ol><li> 수술기구 및 인산염 완충 식염수 (PBS)을 압력솥. </li><li> PBS (Buprenorphine, 30 μg / ML의 Vetergesic, 최종 농도)에 진통 솔루션을 준비합니다. 임신 마우스를 저울질하고 최소 30 분 수술 전에 Vetergesic의 subcutaneously 0.1 밀리그램 / kg를 주입. 이 기간 동안 수술 영역을 준비합니다. 가열 패드 및 복구 챔버를 켭니다. 온수 욕조, 무균 커튼의 모든 멸균 장비와 자료에 무균 PBS를 놓습니다. PBS 채워진 비커에 백금 전극을 배치하고 electroporator에 연결합니다. microloader 팁을 사용하여 DNA의 솔루션 바늘을 기입, 모세관 홀더에 바늘을 연결하고 집게로 바늘의 끝부분을 꼬집어. </li></ol>유전자 주입 및 Electroporation 전에 e_title &quot;&gt; 3. 외과 <ol><li> 마취 유도 챔버를 사용 (산소 2리터 / 분) 산소 캐리어에서 isoflurane과 임신 마우스 (E14.5-E15.5)을 마취시키다. 동물 반사를 righting 잃는 때까지 기다리십시오. </li><li> &quot;사전 수술&quot;마스크에 동물을 전송합니다. 어머니가 전신 마취하에있는 동안 눈 각막 ulceration을 방지하기 위해 눈은 눈 젤 한 방울을 넣으십시오. 복부의 머리를 면도하는 전기 면도기를 사용합니다. 비행 머리카락을 수집 clorhexidine으로 한 음모 지역을 청소하십시오. </li><li> 외과 영역의 보조 마스크에 동물을 전송합니다. 가열 패드에 미치는 뒤쪽으로 마우스를 놓습니다. 페달 반사가 손실되었습니다 수술을 시작합니다. </li><li> 마스크와 멸균 장갑을 끼다. 면도하고 소독되지 않은 피부의 영역에 의해 오염되는 것을 조직하고 악기를 방지하기 위해 무균 드레이프 (복부 위에 작은 구멍)으로 동물을 커버. 면도 면적을 청소하십시오적어도 t clorhexidine로 3 회. 다른 멸균 면봉 때마다 사용하십시오. 피부를 통해 중간선 (~ 1 인치 길이)을 따라 수직으로 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 가위를 사용 linea 알바 (흰색 라인은 콜라겐 결합 조직의 주로 구성)을 따라 복부의 근육과 비슷한 절개를합니다. </li><li> 가장 접근 배아를 선택 두 태아 사이의 고리 집게를 놓고 신중하게 복강의 밖으로 배아 사슬을 당겨. 이 시점부터는 멸균 사전 예열 PBS와 배아가 충분하게. </li></ol> 어떤 현미경은 시각화가 필요하지 않습니다. 4. DNA와 Electroporation의 분사 <ol><li> 쉽게 배아가 electroporated되었다 그중 추적할 만드는 가장 측면 배아들 중 하나와 함께 시작합니다. 이것이 출혈의 위험을 증가하므로 태아에 너무 많이 당기지 마십시오. 링 포셉 및 사용 amniotic SAC 내부 배아의 위치를​​ 조작고리 사이에 태아의 머리를 고정. 배아 가까워 질 벽에까지 밀어 부드럽게 짠다. </li><li> 다른 한편으로 모세관 홀더를 타고 측면 뇌실을 타겟으로하는 반구의 중앙으로 조심스럽게 바늘을 삽입합니다. 빠른 그린 (dendrites을 공부하기 위해 최대 1 μl)와 혼합 DNA 솔루션의 약 1 μl를 주입하기 위해 페달을 누르십시오. 당신은 측면 뇌실을 채우는 녹색 염료를 관찰해야합니다. 중요 단계 : - 바늘의 선명도가 제대로 질 벽에 피어스 중요합니다. 구멍의 확대는 양수 및 배아 사망의 유출을 초래할 것이기 때문에 그것은 자궁 벽의 표면에서, 뇌실에 삽입 후 바늘의 움직임을 최소화하는 것이 중요합니다. 이것은 출혈과 배아 죽음을 초래하므로, 이번에는 질 벽에 천공 혈관을 피하십시오. - 그것이 만들어 낸 것이기 때문에 그것은 측면 뇌실로의 DNA 너무 큰 볼륨을 삽입하지 않는 것이 중요뇌수종 (E14.5에서 2 μl를 초과하지 않음). DNA의 볼륨이 실험의 목적에 따라 조정됩니다. 1μl는 일반적으로 대부분의 실험에 사용되는 경우, DNA (약 0.5 μl)의 작은 볼륨은 dendrite와 척추 분석이 필요합니다. 실제로 몇 절연 세포 electroporated 뉴런의 돌기 아버을 시각화하고 측정하기 위해서는 타겟해야합니다. </li><li> 피질의 electroporation을위한 주입 뇌실이나 해마의 electroporation을위한 주입 뇌실 (그림 2)의 반대쪽에 동일한 측면에 긍정적인 (+) 외륜으로 태아 머리의 양쪽에 전극을 삽입합니다. 그런 다음 1 초 간격으로 다섯 30V 전기 펄스 (50 밀리초 기간)을 적용합니다. 중요 단계 : 이것은 배아 죽음을 초래하므로 태반을 통해 현재 적용하지 마십시오. 임신 마우스의 모든 배아는 어떤 혼동을 피하기 위해 건설 보통 같은 DNA를 함께 electroporated 수 있습니다. 그러나, 긴 수술 감소<html> 배아의 생존율이 뭐니. 복강은 30 분보다 더 열 수 없습니다. </li></ol> 5. 수술 후 electroporation <ol><li> 배아를 electroporating 후 복강으로 PBS를 추가하고 원래 위치에 자궁 경적을 대체하기 위해 고리 집게를 사용합니다. Vicryl 흡수성 봉합과 복부 벽과 피부를 봉합해. </li><li> 그것이 가열 패드에 배치 새장에 전송 후 깨어나면 (보통 5-10 분)과까지 복구 실에서 동물을 놓습니다. </li></ol> 6. 이후 수술 고통, 고통이나 손해를 평가하고 수술 후 동물 24 H 48 H를 저울질하는 생쥐의 동작을 확인합니다. 필요하면 진통제는 통증과 불편을 최소화하기 위해 관리하실 수 있습니다. 7. 조직 재생 실험에 필요한 배아 또는 출생 후의 단계에 electroporated 배아 또는 새끼를 수집합니다. ove_content &quot;&gt; - 배아 단계 (예를 들어 세포 증식 또는 마이 그 레이션을 공부하기)에서 분석을 위해 : 경추 탈구를 통해 어머니를 안락사와 배아를 수집합니다. 잘린 후, 올바르게 electroporated되어 두뇌를 선택한 등의 형광 신호의 크기와 위치로 표시, 형광 쌍안경을 사용하여 두개골을 통해 시각. 두개골의 두뇌를 해부하고 20 %의 자당 / 하룻밤 PBS에 4퍼센트 PFA에서 하룻밤 수정 후 곳이 네요. ° C와 섹션 그라 이오 스탯을 사용하여 -80에서 10월 화합물, 동결에 포함시킵니다. - 출생 후의 단계 (예를 들어 dendrites 및 쪽이을 공부하는)의 분석을 위해 : pentobarbitone의 intraperitoneal 주사 (40-60 밀리그램 / ㎏)와 새끼 또는 성인 생쥐를 마취하고 PBS에서 4퍼센트 PFA 뒤에는 PBS로 transcardial 재관류를 수행합니다. 4퍼센트 PFA 하룻밤의 두개골 및 사후 수정 프로그램의 머리를 해부. vibratome (D 100 μm의 섹션을 사용하여 PBS, 섹션 두뇌의 washings 후endrite 분석). 이미지 dendrites 및 쪽이으로 0.16-0.19 mm 두께 coverslips를 사용하여 아쿠아 폴리 / 마운트의 섹션을 탑재합니다. 8. 대표 결과 그림 3은 CA1 (그림 3C, D)과 해마 (그림 3E, F)의 이가있는 이랑의 대뇌 피질 (인물 3A, B)에서 electroporated 세포의 예제를 보여줍니다. 야생 형 생쥐는 GFP 구조 (PCA-B-EGFPm5 소음기 3)과 뇌 출생 후의 날 (P) 14시 수확했다들과 E14.5에 electroporated되었다. DNA 솔루션의 작은 부피 (1 μg / μl의 용액 0.5 μl 이하)를 주입함으로써, 몇 전지 절연 GFP + 세포 (그림 3)뿐만 아니라 그 쪽이의 돌기 arborization의 시각화을 허용하는 레이블이 있습니다 높은 배율에서 (그림 4). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;강한&gt; 그림 1. dendrites 및 쪽이을 공부하는 데 사용할 수 electroporation 프로토콜의 도식 표현. () GFP의 Electroporation은 야생 형 및 돌연변이 생쥐에서 dendrites 및 쪽이을 비교하기 위해 구축. (B) GFP-shRNA (GFP가 같은 구조로 표현된다)의 Electroporation은 건설 dendrites과 shRNA으로 electroporated 생쥐의 쪽이을 비교하는 관심의 유전자 (X) 또는 제어 shRNA 특정. (C) IUE는 바람직한 기간에 shRNA 표현을 제한하기 위해 Cre의 inducible 시스템을 함께 사용할 수 있습니다. 본 실험에서는 벡터는 4 hydroxytamoxifen에 의해 활성화될 수 Cre의 recombinase의 형태 표현 (를 배속-ER T2 CreER T2, 1 μg / μl) 10은 Cre 부양의 특정 shRNA을 표현 벡터 함께 electroporated있다 방식 (1 μg / μl, 그리고 재조합 표시기 (Cre에 의한 CALNL-GFP 구조, GFP의 발현 inducible와;. 1 μg / μl) 10 efficien최저의 사는 shRNA의 농도를 증가뿐만 아니라 배속-ER T2 CreER T2 농도를 높임으로써 향상시킬 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> 그림 2. electroporation의 공간적 제어합니다. 이 수치는 대뇌 피질이나 해마를 타겟으로하기 위해 DNA를 주입 사이트에 따르면 패들 전극을 배치하는 위치를 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> 그림 3. utero에의 돌기 아버의 시각화는 대뇌 피질과 해마에서 세포를 electroporated. (A, B) GFP + 대뇌 피질의 피라미드 세포 (CD) 피라미드 해마의 CA1에있는 세포 및 (E, F), P14에서 이가있는 이랑의 과립 세포를 보여주는 코로나 섹션. GFP 구조 (PCA-B-EGFPm5 소음기 3) E14.5에서 electroporated되었다. 높은 배율 사진 (B, D, F)는 IUE가 dendrites을 시각화하기위한 효율적인 방법임을 보여줍니다. 스케일 바는 50 μm의 (B, D 및 F), 150 μm의합니다 (A, C, E) 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> 그림 4. 구축을 표현 GFP와 E14.5에 utero에 electroporated되었다 P14 뉴런의 돌기 쪽이의 시각화. (A, B) hippocampal 피라미드 뉴런의 기저 dendrites에서 쪽이 높은 배율 이미지. 스케일 바는 5 μm의 (A) 및 2 μm의를 (B) 나타냅니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

IUE가 우주에서뿐만 아니라 시간뿐만 아니라 유전자 발현을 조작하기위한 강력한 도구입니다. 우리는이 기술은 대뇌 피질과 생쥐의 해마에서 dendrites 및 쪽이을 시각화하고 유전자 조작하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시됩니다. 이전에 인용된 장점 외에, 그것은 IUE이 방법을 잠돌군 Zz와는 달리, immunohistochemistry이나 표현형 electroporated 세포에 대한 예를 들어 허용 원위치 하이브리드화에서 조합하여 사용할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 절차는 상대적 invasiveness에도 불구하고 분명 뇌의 기형을 유발하지 않는다는 언급하는 것도 중요합니다. 또한, 세포 수준에서 IUE는 electroporated 뉴런 13 electrophysiological 속성을 수정하지 않습니다. 우리의 시위가 dendrite와 척추 morphologies의 시각화에 초점을 맞춘 반면, E14.5에서 대뇌 피질이나 hippocampal 뉴런의 IUE은 또 축삭 형성과지도와 같은 다른 발달 이벤트를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 추가할에서ition, 프로토콜의 같은 종류의 서로 다른 인구를 대상으로 배아 발달의 다른 단계에서 구현할 수 있습니다. 예를 들어, E18.5의 발달 늦게 피질 electroporation 패러다임은 astrocytic progenitors 1 식을 운전을 수행할 수 있습니다. E14.5에서 해마의 electroporation도 같은 시간에 CA1-CA3 피라미드 신경 세포의 progenitors과 이가있는 과립 세포 시조를 타겟팅할 수있는 동안 마찬가지로, 늦은 hippocampal electroporation은 (E18.5 또는 초기 출생 후의) 다른 이가있는 과립에 게재되는 것을 허용 것이다 progenitors 14. 이 경우, DNA의 주입 부피는 전류의 강도뿐만 아니라 증가 수 있습니다. IUE에 의해 도입된 Transgenes는 episomal 유지 것으로 보인다 따라서 연속적으로 세포 분열에 따라 세포에서 손실됩니다. 이러한 뉴런과 같은 postmitotic 세포 그러나 episomal transgenes는 장기적인 연구를 할 수 있도록 13 electroporation 후 몇 달 동안 활성 상태로 유지15. 우리의 연구에서 우리는 초기 개발 시간 지점에서 transgene의 영구 식에 IUE 결과를 이용하여 대뇌 피질이나 hippocampal의 연결을 엽 성의 전구 물질을 목표로 그 배아를 나타내는 출산 후 칠주 (우리가 분석한 최신 시점)에 밝은 GFP + 세포를 관찰했습니다 성인 있습니다. 기술의 현재의 한계는 그것이 electroporated 세포의 총수 이상의 미세 제어를 발휘하기 어렵다는 점이다. 그러나 DNA 솔루션의 주입 부피를 줄임으로써, 우리는 몇 세포 레이블을 지정하고 고립된 GFP + 세포뿐만 아니라 쪽이의 돌기 arborization을 시각화하는 것이 가능하는 것으로 나타났습니다. transfected 영역의 차원은 또 현재와 펄스의 숫자 또는 electroporation의 심폐의 직경의 강도 등 electroporation의 매개 변수를 수정하여 조정할 수있다. 개의 IUE는 구현하기가 쉽고 빠른있는 방법이며,생체내의 dendrites 및 쪽이을 공부하는 효율.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> 주사 바늘와 DNA 솔루션의 준비 </td></tr><tr><td> Endofree 플라스미드 맥시 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 12,362 </td><td></td></tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> 시그마 </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 1.0 mm OD X 0.58 밀리미터 아이디 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader 팁 </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Eppendorf 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl를 pipettes 내용 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; NBSP; </td><td> 수술 재료 </td></tr><tr><td> 추가 얇은 홍채 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> 곡선 집게 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> 링 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> 니들 홀더 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Graefe 집게 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Vicryl 흡수성 봉합사 </td><td> Ethicon INC (존슨 앤 존슨) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 커튼 30cm X 45cm </td><td> 버스터 </td><td> 141,765 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 면봉 </td><td> Shermond </td><td> HUBY-340 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 목화 꽃봉오리 </td><td> 클린 크로스 유한 공사 </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphine (Vetergesic) </td><td> Alstoe 동물 건강 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> 아이 겔 Viscotears </td><td> 노바티스 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> 애보트 래버러토리스 </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, Pentobarbitone 나트륨 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Electroporation </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> 플래티넘 Tweezertrod전자 5mm </td><td> BTX, 하버드 장치 </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojet microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojet Microinjector을위한 발 관리 </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> 모세관 홀더 </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 조직 재생 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 슬라이드 </td><td> ThermoScientific (Menzel-Gläser) </td><td> J1800AMN​​Z </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td><td> 22 X 50mm # 1.5 </td></tr><tr><td> 아쿠아 폴리 / 마운트 </td><td> Polysciences, INC </td><td> 18,606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

utero의 electroporation에 (IUE) 배아 신경계 1-5의 여러 영역의 발달을 연구하는 강력한 기술이되고있다. 이 도구는 널리 세포 증식, 분화, 특히 개발하는 대뇌 피질의 연결 6-8에서는 마이 그 레이션의 규정을 연구하는 데 사용되었습니다 데이트를합니다. 다음은 세부의 프로토콜을 utero에서 대뇌 피질과 해마를 electroporate이 접근법은 두 대뇌 지역 dendrites 및 쪽이을 공부하는 데 사용될 수있는 증거를 제공합니다. 차 문화의 뉴런의 시각화 및 조작은 dendrite, 척추 및 시냅스 개발에 참여 과정의 더 나은 이해에 기여했습니다. 그러나 체외에서 성장 뉴런은 정상 개발하는 동안 dendrite 및 / 또는 척추 형성과 유지 보수에 영향을 미칠 수있는 모든 생리적 단서에 노출되지 않습니다. dendrite와 척추 구조의 지식 <e야생 형 또는 돌연변이 생쥐에서 생체내의 M&gt;은 잠돌군 Zz-콕스 방법 9를 사용 관찰에서 주로 온다. 그러나 잠돌군 Zz의 염색법은 예측할로 간주됩니다. 실제로 신경 세포와 섬유 책자의 그룹이 인접한 부분 염색법을 찾아볼 수없는 반면 특정 영역은 종종 완전히 스테인드 등장으로 무작위로 분류됩니다. 최근 연구 형광 구조의 IUE은 돌연변이 / 야생 형 생쥐 10-11 (그림 1A)에 dendrites, 쪽이뿐만 아니라 시냅스를 공부하는 매력적인 대안 방법을 대표하는 것으로 나타났습니다. 또한 마우스 knockouts의 세대에 비해, IUE는 특정 시간 창 동안 세포의 특정 인구에서 기능 연구의 이득과 손실을 수행하는 빠른 방법을 나타냅니다. 또한, IUE이 성공적으로 RNAi는 유전자 또는 shRNA 12 표현 이상의 시간적 제어를 수정하기 위해 접근 inducible 유전자 발현이나 inducible 함께 사용되었습니다. IUE 이러한 장점 때문에 opene했습니다D 새로운 치수뿐만 아니라 특정 대뇌 구조 (그림 1B)에서뿐만 아니라 발전의 특정 시점 (그림 1C)에 dendrites와 쪽이의 유전자 발현 / 억제의 효과를 공부할 수 있도록. 마지막으로, IUE은 dendrite, 척추 및 / 또는 시냅스 개발에 관련된 유전자 사이의 기능적 상호 작용을 식별할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 사실, 이러한 바이러스 같은 다른 유전자 전달 방법과는 달리, 그것은 세포의 동일한 인구에서 여러 RNAi 또는 transgenes을 결합하는 간단합니다. 요약에서는 IUE 이미 뇌 기능과 질병의 기본 분자 메커니즘의 특성화에 기여했으며 그것도 dendrites와 쪽이의 연구에 도움이되어야 강력한 방법입니다.

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Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.9K 조회수.  MRC National Institute for Medical Research. 이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

연구

신경과학

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...