저자는 노조미 아베, 타 카 유키, 그리고 Nahoko이 시이 게놈 시퀀싱에 그들의 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 선진적인 일본 사회에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구원, 젊은 과학자 (No.22681029), KAKENHI 특정 한 KAKENHI 특정에 대 한 과학적 연구 (B), 제 17 H 03620는 JSP에서 여는 스미 토모 재단 (No.140340)에서 그리고 야마가타 현 쓰루 오카 시, 일본에서 연구 기금에 의해 부분적으로 기본적인 과학 연구 프로젝트에 대 한 그랜트. tardigrades를 피드 하는 데 사용 되는 클로렐라 vulgaris 클로렐라 산업 주식회사의 제공 했다

1입니다. 준비
<ol><li>2 %agarose 젤 90 m m 플라스틱 문화 접시, 그리고 1% 페니실린/스 DW와 칵테일의 10 mL에 용 매로 증류수 (DW)를 사용 하 여 준비 합니다. 젤 18 ° c.에 설정 하는 인큐베이터에 2-3 주 동안 저장 될 수 있다 참고: 낮은 온도 agarose 젤, 젤과는 tardigrades 갇혀 있을 수 있는 문화 접시 벽 사이의 소문자 간격의 결과로 축소에 대 한 10 ° c, 젤의 어떤 저장을 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 샘플 준비 및 오염 물질 배제
<ol><li>단일 tardigrade 수집 하 고, 준비 한 접시에 그것을 배치 하 고 그것을 씻어 x-모든 나머지 입자를 제거 하는 DW와 함께 3 x 2.</li>
	<li>창 자에서 어떤 과잉 음식 든 지 제거를 24 h에 대 한 18-22 ° C에서 tardigrade 품 어.</li>
	<li>2-6 h P10 피 펫을 사용 하 여 깨끗 한 슬라이드 유리에 소독된 동물을 어떤 세균 오염 제거에 대 한 페니실린/스 항생제에 굶주린된 tardigrade를 놓습니다.</li>
	<li>500 X 확대 현미경 tardigrade 관찰 하 고 나머지 박테리아 없음 확인. 참고:는 stereomicroscope와 높은 확대 최적입니다, 하지만 광학 현미경 또는 coverslip를 적용 하지 않고 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>액체의 5 µ L의 최대 P10 피 펫을 사용 하 여 개인을 수집 하 고 낮은 바인딩 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브에 배치 가능한 훨씬 초과 액체 제거. 참고: microtubes, PCR 튜브, 그리고 피 펫 팁 모두 이어야 한다 DNA의 손실을 최소화 하기 위해 낮은 바인딩. 참고: 빠른 건조에 대 한 균질 화 되도록 빨리 실시 또는 동물의 죽음 크게 게놈 DNA를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
</ol>3. 균질 및 DNA 추출
<ol><li>다음 방법 중 하나를 그것의 게놈 DNA (gDNA)를 얻기 위해 동물을 균질. 참고: 다른 키트 (열과 구슬 기반)이 매우 낮은 입력에서 유효 하지 않습니다에 대 한 다음 DNA 추출 단계에서 재료의 테이블에 에서 표시 된 지정 된 키트를 사용 하 여 중요 한 이다. 게놈 세포의 용 해 버퍼 사용 하기 0.5% 베타-mercaptoethanol 전에 공급 되어 있다.<ol>
<li>그리고 freeze-thaw 주기18와 동물 균질<ol>
<li>바로 다음 단계 2.5, 포함 하는 tardigrade PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>37 ° c 예 열 열 블록 이동 10 분, 10 분, 액체 질소에 PCR 튜브를 배치 2 x이이 단계를 반복 합니다. 참고: 균질 충분 하지 않습니다 또는 수동 분쇄 후 수행할 수 있는 경우이 단계를 반복할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수동으로 동물 호감.<ol>
<li>바로 다음 단계는 stereomicroscope에서 2.5, PCR 튜브 벽에 동물을 눌러 피펫으로 P10 팁 개인을 분쇄 하 고 즉시 100 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가. 참고:이 tardigrade 수 쉽게 빠져나가, 비효율적인 분쇄 gDNA를 추출 실패 귀 착될 것 이다 때문에이 절차는 stereomicroscope 아래를 관찰 하는 중요 한. 세포의 용 해 버퍼는 유기 체에 침투 수 있도록 tardigrade 표 피 손상 되었는지 확인 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>발생 하는 세포에 대 한 실 온에서 30 분 동안 튜브를 품 어. 참고: 30 분의 최소 필요 효율적인 세포에 대 한 하지만 부 화 긴 될 수 있습니다.</li>
	<li>깨끗 한 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 세포 혼합물의 완전 한 볼륨 (100 µ L)를 전송.</li>
	<li>균질을 위해 사용 되었다 며 지금 비어, 낮은 바인딩 PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L을 추가 하 고 단계 3.3에서에서 사용 하는 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 전송에 pipetting 혼합물, 후. 2 x이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>3.4 단계에서 낮은 바인딩 PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 혼합물 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 이동 pipetting, 후. 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube이이 단계 후에 혼합물의 600 µ L를 포함 해야 합니다. 참고:이 단계는 샘플을 여러 번 세척 하 여 PCR 튜브 벽에 바인딩된 gDNA의 손실을 극소화 하는.</li>
	<li>컬렉션 튜브에 배치 스핀 열 세포 혼합물의 600 µ L의 총을 추가 하 고 1 분 x 10000 g에서 원심.</li>
	<li>다시 열을 통해 흐름을 적용 하 고 1 분 x 10000 g에서 원심. 참고:이 단계는 되도록 중요 한 대부분은 gDNA의 열에 바인딩됩니다.</li>
	<li>스핀 열 워시 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 깨끗 한 1.5 mL microtube 스핀 십 분 전송에 대 한 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>10 mm Tris HCl, pH 8.5, 스핀 열, 5 분 대기를 실 온에서 20 µ L을 적용 하 고 1 분 동안 10000 x g에서 원심. 참고: 차입 버퍼 라이브러리 준비 효소와 방해에 대 한, EDTA를 포함 해야 합니다 하지.</li>
	<li>다시 실 온에서 외피의 5 분 후 스핀 열을 통해 흐름을 적용, 10000 x g에서 1 분 동안 원심. 참고:이 단계는 열에 바인딩된 gDNA의 최대 차입을 보장 하기 위해 중요 한.</li>
</ol>4. 도서관 건설 순서
<ol><li>
DNA 파편
	<ol>
<li>DNA 파편에 대 한 15 µ L microtube gDNA eluant의 15 µ L를 전송 하 고 탁상 microcentrifuge를 사용 하 여 1 분 동안 튜브 원심. 참고: 테이블의 자료 에 표시 된 지정된 microtube 낮은 입력에 대 한 최적입니다. 낮은 볼륨 쥡니다와 조각화는 중요 한, 그리고이 효소 조각화 DNA의 매우 낮은 농도 때문에 대체 될 수 없습니다.</li>
		<li>550에 gDNA를 조각 혈압. 참고: 550 bp 설정 사용은 다음과 같습니다: 피크 사고 전원 30 W, 듀티 계수 = = 20%, 버스트 사이클 = 50, 처리 시간 = 23 s.</li>
		<li>철저 한 pipetting 후 깨끗 한 낮은 바인딩 PCR 튜브에 조각난된 DNA 혼합물의 10 µ L을 전송. 참고: 실험 여기 중지 될 수 있습니다. 4 ° C 또는-20 ° c.에 DNA를 보존</li>
	</ol>
</li>
	<li>
라이브러리 건설 순서 참고: 그것은 절대적으로 중요 한 테이블의 자료 입력된 DNA의 낮은 금액으로 인해 다음 절차에에서 지정 된 키트를 사용 하 여.<ol>
<li>서식 파일 준비 버퍼의 2 µ L 및 템플릿 준비 효소의 1 µ L을 추가 하 고는 피 펫 철저 하 게 그들을 믹스.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 서식 파일 준비 반응을 수행: 25 분, 20 분, 4 ° C 보류, 그리고 101-105 ° c.에가 열된 뚜껑에 대 한 55 ° C 22 ° C 반응이 완료 되 면 다음 단계를 진행 합니다.</li>
		<li>서식 파일 준비 반응 제품에 라이브러리 합성 버퍼의 1 µ L 및 라이브러리 합성 효소의 1 µ L을 추가 하 고 (4 ° C 보류)와 40 분 동안 22 ° C에 혼합물을 품 어. 반응이 완료 되 면 다음 단계를 진행 합니다.</li>
		<li>라이브러리 증폭 마스터 믹스 (라이브러리 증폭 버퍼의 25 µ L, 라이브러리 증폭 효소의 1 µ L 및 nuclease 무료 물 4 µ L)의 30 µ L의 인덱싱 시 약 5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>피 펫으로 모든 것을 철저 하 게 혼합 하 고 탁상 원심 분리기와 혼합물을 간단히 원심.</li>
		<li>표 1에서 제시 하는 조건으로 PCR을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>온도</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>3 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>85 ˚C</td>
			<td>2 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>2 분</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>20 초</td>
			<td rowspan="3">4 사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>67 ˚C</td>
			<td>20 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>40 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ˚C</td>
			<td>20 초</td>
			<td rowspan="2">16 주기</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚C</td>
			<td>50 초</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ˚C</td>
			<td>보류</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: PCR 조건입니다.
<ol start="3"><li>
PCR 제품의 정화 참고:이 단계는 다른 정화 방법과 교체하실 수 있습니다. 다른 방법을 사용 하는 경우는 분 광 광도 계를 사용 하 여 결과 DNA의 순도를 확인 해야 합니다. 흡 광도 비율 260/280와 260/230 둘 다 1.8 이상 이어야 합니다.<ol>
<li>마그네틱 구슬의 50 µ L을 추가, 플라스틱 솔루션 10 x, 탁상 microcentrifuge와 함께 간단히 원심 및.</li>
		<li>실 온에서 2 분에 대 한 솔루션을 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 마그네틱 스탠드에 품 어 또는 솔루션을 완전히 될 때까지 취소, 제거는 상쾌한.</li>
		<li>자석 스탠드에 낮은 바인딩 PCR 튜브에 갓된 80% 에탄올의 200 µ L를 추가, 30 s 및 제거는 상쾌한 대기. 2 x이이 단계를 반복 합니다. 비즈를 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>짧게 탁상 원심 분리기와 낮은 바인딩 PCR 튜브 원심 고 마그네틱 스탠드에 어떤 과잉 에탄올을 제거 합니다. 구슬 건조 하지만 overdrying을 피하십시오.</li>
		<li>15 µ L 10 mm Tris HCl, pH 8.5와 구슬 resuspend, 철저 하 게 자기 구슬 균질 분산 되도록 솔루션을 플라스틱, 실내 온도에, 그리고 간단한 원심 분리 후 2 분 동안 튜브를 품 어, 2 마그네틱 스탠드에 품 어 솔루션까지 분은 분명 하다. 참고: 차입 버퍼 없어야 EDTA, 시퀀싱 화학으로 대 합니다.</li>
		<li>새로운 낮은 바인딩 PCR 튜브에 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한, 전송. 참고: 실험 여기 중지 될 수 있습니다. 또는 장기간 저장용-20 ° C에서 4 ° C에서 DNA를 보존.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 품질 검사, 정량화, 및 DNA의 순서
참고: 품질 검사는 DNA의 낮은 금액으로 인해이 단계 전에 실시 하지.
<ol><li>
DNA 라이브러리 크기 분포의 유효성 검사 참고: 다른 높은-민감한 전기 시스템 크기 분포의 디지털 보고 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>전기 이동 법 버퍼 시 약을 카트리지 (범위 25-1000 bp) 실내 온도를 젤.</li>
		<li>시퀀싱 라이브러리의 1 µ L로 전기 이동 법 버퍼 시 약의 3 µ L을 추가 하 고 소용돌이, 그들을 철저 하 게 1 분 동안 혼합 짧게 탁상 원심 분리기와 원심.</li>
		<li>전기 이동 법을 수행 하 고 관련된 소프트웨어와 라이브러리 크기 배포의 유효성을 검사 합니다. 주요 조각 피크 합니다 수 광범위 하 게까지 약 300에서 1000 bp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA의 정량화 참고: 다른 형광 기반 방법 또는 양이 많은 PCR도 사용할 수 있습니다, 하지만 분 광 광도 법, 피해 야 한다 그것은 시퀀싱 라이브러리를 측정을 위해 충분히 정확 하지.<ol>
<li>버퍼 솔루션의 796 µ L 및 형광 시 약의 4 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 그들을 믹스. 2 분석 결과 튜브를 작업 솔루션의 190 µ L 및 1 개의 분석 결과 관에 197 µ L를 분배.</li>
		<li>각 분석 결과 튜브 작업 솔루션의 190 µ L을 포함 하 게 DNA의 알려진 농도가 표준 10 µ L 및 작업 솔루션의 197 µ L를 포함 분석 결과 튜브를 준비 된 도서관의 3 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>소용돌이 관 짧게 탁상 원심 분리기에 원심 및. 3 µ L 설정으로는 fluorometer를 사용 하 여 DNA를 계량.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA 라이브러리 순서 참고: 시퀀싱 플랫폼 지정된 라이브러리 건설 키트와 호환 되어야 합니다.<ol>
<li>준비 제조 업체의 프로토콜에 따라 시퀀싱 라이브러리.</li>
		<li>시퀀싱에 시 약 카세트와 흐름 셀을 설정 하 고 시퀀싱 정보는 제조 업체의 프로토콜을 실행을 입력 합니다.</li>
		<li>시퀀싱을 실행 합니다. 참고: 우리는 두 개의 시퀀싱 실행 실시: 4 개의 샘플 한 실행에서 다중화로 한 샘플/실행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 전산 분석
<ol><li>기본 전화 하 고, 필요한 경우 demultiplex는 읽기.</li>
	<li>FastQC19시퀀스 데이터의 품질을 확인 합니다. 주: 획득된 데이터의 자세한 유효성 검사에 대 한 우리의 이전 보고서16를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anhydrobiosis.">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).</li><li>Mobjerg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+extreme+environments+-+on+the+current+knowledge+of+adaptations+in+tardigrades.">Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades.</a> Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).</li><li>Becquerel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=La+suspension+de+la+vieau+dessous+de+1/20+K+absolu+par+demagnetization+adiabatique+de+L'alun+de+fer+dans+le+vide+les+plus+el&#233;ve.">La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus el&#233;ve.</a> Comptes Rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 231, 261-264 (1950).</li><li>Ono, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ultra-high+pressure+on+small+animals,+tardigrades+and+Artemia.">Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia.</a> Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).</li><li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+anhydrobiotic+eggs+of+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+to+extreme+environments.">Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments.</a> Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).</li><li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DNA+repair+and+protection+in+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+and+Hypsibius+dujardini+after+exposure+to+UVC+radiation.">Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation.</a> PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).</li><li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+tolerance+in+the+tardigrade+Milnesium+tardigradum.">Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).</li><li>May, R. M., Maria, M., Gumard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+diff&#233;rentielle+des+rayons+x+et+ultraviolets+sur+le+tardigrade+Macrobiotus+areolatus,+a+L'&#233;tat+actif+et+dess&#233;ch&#233;.">Action diff&#233;rentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'&#233;tat actif et dess&#233;ch&#233;.</a> Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).</li><li>Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+tolerance+in+the+eutardigrade+Richtersius+coronifer.">Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer.</a> International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).</li><li>Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+a+tardigrade:+Horizontal+gene+transfer+or+bacterial+contamination?.">Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).</li><li>Delmont, T. O., Eren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+contamination+with+advanced+visualization+and+analysis+practices:+metagenomic+approaches+for+eukaryotic+genome+assemblies.">Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies.</a> PeerJ. 4, e1839 (2016).</li><li>Koutsovoulos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+in+the+genome+of+the+tardigrade+Hypsibius+dujardini.">No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).</li><li>Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to+Bemm+et+al.+and+Arakawa:+Identifying+foreign+genes+in+independent+Hypsibius+dujardini+genome+assemblies.">Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).</li><li>Boothby, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade.">Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).</li><li>Arakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade.">No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).</li><li>Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+a+single+tardigrade+Hypsibius+dujardini+individual.">Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual.</a> Scientific Data. 3, 160063 (2016).</li><li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+tardigrades+Hypsibius+dujardini+and+Ramazzottius+varieornatus.">Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans.">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).</li><li>Andrews, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).</li><li>Hashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremotolerant+tardigrade+genome+and+improved+radiotolerance+of+human+cultured+cells+by+tardigrade-unique+protein.">Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein.</a> Nature Communications. 7, 12808 (2016).</li><li>Zimin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaSuRCA+genome+assembler.">The MaSuRCA genome assembler.</a> Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+rearing+system+of+the+extremotolerant+tardigrade+Ramazzottius+varieornatus:+a+new+model+animal+for+astrobiology.">Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology.</a> Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).</li></ol>

저자는 공개 없다.

세균성 오염 미세한 생물의 게놈 시퀀싱에 위협이 포즈. Tardigrade 게놈 시퀀싱에 대 한 이전 연구는 오염 광범위 한 정보학 방법을12,20를 사용 하 여 필터링 하는 동안 우리는 오염 위험을 최소화 하기 위해 하나의 개별에서 게놈 시퀀싱. 개별 tardigrade genomic DNA16 의 약 50-200 pg 포함 되어 있기 때문에 키 틴 질 외 골격의 두꺼운 층에 쌌 다, 오염 물질 및 양질의 DNA 추출의 배제는이 프로토콜에 중요 한 포인트. 기존 tardigrades 문화는 무 균, 그리고 그 수집 된 야생 수행에서 오염 물질의 많은 그들의 창 자에 식품의 표면에. Tardigrades의 이전 게놈 시퀀싱 프로젝트 총칭 한 샘플12,14, 결과 세균 오염에 의해 영향을 받을 가능성이 매우 즉 10000-100000 개인을 시퀀싱 있다. 그들의 보고서에서 Boothby 외. 그들의 부정적인 phototaxis 행동14를 사용 하 여 H. dujardini 개인을 수집 하 고 그룹 항균 메서드를 사용 하지 않았다.
경우에 오염 물질을 시각적으로 검사 하려면 우리 항생제 (페니실린/스) tardigrade incubated 하 고 500 X 현미경 개인 시험. 하나의 개별 절연 하 고 신중 하 게 어떤 오염 물질에 대 한 검사, 우리는 가능한 오염 위험을 최소화. 오염 낮은 수준의 잘16시퀀싱 데이터에서 확인 되었다. DNA 추출에 관해서는 우리는 열 균질18로 서 수동 균질, 고용. 액체 질소를 37 ° C tardigrade 개별 제출 하 여 균열은 키 틴 질 외 골격에 유도 하 고 세포의 용 해 버퍼 신체에 침투 하 여 세포를 lyse 수 있었습니다. DNA 수율 예상 보다 낮은 때, 열 및 수동 균질 수익률을 극대화 하기 위해 실시 수 있습니다.
이 문서에 명시 된 방법에는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 동결 및 해 동 사이클에 의해 균질 nematodes;에 대 한 연구에서 적용 된 따라서, 방법만 ecdysozoa에 대 한 효과가 있을 수 있습니다. 둘째, DNA 시퀀스 라이브러리 단계 DNA 파편의 확대로 인해 PCR 오류의 가능성 무시할 수 없습니다. 따라서, 시퀀스 데이터 읽기 높은 정확도 요구 하는 분석에 대 한 권장 하지 않습니다 (즉, SNP 분석). 또한, 우리는 프로토콜에 명시 된, 재료의 테이블에 에서 표시 된 지정 된 SNA Seq 키트의 사용은 입력된 DNA의 낮은 금액으로 인해 절대적으로 중요 합니다. 이 DNA 라이브러리 건설 키트 ligates 증폭; 이전 Illumina 어댑터 시퀀스 따라서,이 라이브러리는 긴 읽기 시퀀싱 PacBio 또는 Nanopore 기술을 사용 하 여 적용할 수 없습니다. 마지막으로,이 프로토콜 중 생성 된 DNA 도서관의 품질 확인 시퀀싱 도서관 건설 후 한 번만 발생합니다. 이것은 대부분 DNA 정량화 이후 DNA의 낮은 입력 때문입니다 그리고 전기 이동 법 방법 DNA의 50-200 페이지를 검색할 수 없습니다. 따라서, 우리 PCR 확대 후에 전기 이동 법 (그림 1)와 형광 기반의 quantifications 등의 품질 검사를 실시 했습니다.
이 데이터의 생물 정보학 분석의 전체 토론;이 문서의 범위를 벗어납니다. 그러나, 우리는 간단히 우리가 실시 하는 몇 가지 분석을 밝혔다. FastQC19 시퀀싱 데이터의 품질 검사 당 기본 자질, 시퀀스 중복 등 시퀀스 데이터를 검증 된 게놈 어셈블리에 제출 될 수를 계산 합니다. 우리는 MaSuRCA v 3.1.321 132 Mb 게놈을 조립 했다 고 BWA22 와 다른 H. dujardini 게놈 어셈블리16이 DNA 시퀀싱 라이브러리의 QualiMap23 계산 매핑 통계를 비교 했습니다. 또한, 우리 또한 우리의 연구17, 오염 물질의 배제에 대 한이 DNA 시퀀싱 데이터를 사용 하 고 시퀀스 읽기 게놈에 걸쳐 고르게 분산 하는 것을 관찰 했습니다.
Tardigrades24의 경우 대부분 프로젝트 비 모형 유기 체에 충분 한 시료를 배양에서 시작. 문화 기술에서 기술 진보 높은 양의 tardigrade 문화 활성화 하지만 현재 문화 메서드는 아직 무 균, 그리고 그것 게놈을 거의 불가능 되었습니다 대부분 tardigrades 실험실에서 아직도 culturable 이므로, 또는 transcriptome 연속입니다. 이 DNA 시퀀싱 방법 한 개인에서 덜 연구 해양 종 등 드문 tardigrade 종 분석을 가능 하 게. 비교 유전체학 넓은 phyletic 지역에서 실시 하 여 tardigrades에 anhydrobiosis 메커니즘의 더 이해를 얻을 수 있습니다.

Tardigrades는 건조를 직면 하는 때 anhydrobiosis를 호출 하는 ametabolic 상태를 입력할 수 있는 미세한 동물 이다. 그들은 물1,2의 흡수에 의해 복구. Tardigrades는 ametabolic 상태에서 다양 한 극한 환경 극한의 온도 압력3 4,5, 자외선 빛6, x-레이, 그리고 감마선의 높은 복용량을 포함 하는 견 뎌 할 수 있다 7 , 8, 그리고 우주 공간9. 게놈 데이터는 anhydrobiosis의 분자 메커니즘의 연구에 대 한 필수적인 기초.
Tardigrades의 게놈을 시퀀싱 하는 이전 시도 세균 오염10,11,12,,1314의 흔적으로 나타났습니다. 같은 작은 유기 체에서 게놈 시퀀싱 동물의 많은 수를 요구 하 고 세균 오염; 하는 경향이 따라서, 우리는 오염15의 위험을 최소화 하기 위해 tardigrade, 단일 표본에서 시작 하는 ultralow 입력된 메서드를 사용 하 여 연속 프로토콜을 설치 이전 했다. 이러한 데이터를 사용 하 여 높은-품질 resequencing 및 리어셈블리 H. dujardini16,17의 게놈의 더 실시는 우리. 여기 우리가 자세하게에서 게놈 시퀀싱 한 tardigrade 개인 (그림 1에서이 방법을 설명). 이 시퀀싱 방법의 유효성 검사는이 문서의 초점을 넘어 이며 우리의 이전 보고서16이미 철저 하 게 논의 했다.
이 메서드는 두 부분으로 구성: 단일 tardigrade 오염 가능한 낮은와 DNA 그림 수준의 높은 품질 추출의 분리. tardigrade 굶 어 하 고 항생제로 서 물, 철저 하 게 씻어 서 이며 어떤 세균 오염 든 지의 제거를 보장 하기 위해 500 X 확대와 함께 현미경 관찰. 이전 견적 및 측정 tardigrade의 단일 개인 게놈 DNA16, freeze-thaw 주기 또는 수동 균질 키 틴 질 외 골격을 크래킹에 의해 추출 되는 약 50-200 pg 포함 되어 있음을 표시 합니다. 이 게놈 DNA 도서관 건설에 제출 하 고 DNA 시퀀싱 장비에서 시퀀스. 추가 정보 분석 고급 시퀀싱, 뿐만 아니라 오염 이전 tardigrade 시퀀싱 프로젝트에 비해 낮은 수준으로 표시 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="894">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SZ61 microscope</td>
			<td style="width:251px;">OLYMPUS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BactoAgar</td>
			<td style="width:251px;">Difco Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:251px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">VHX-5000 System</td>
			<td style="width:251px;">Keyence</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">0.2mL Silicone coating tube</td>
			<td style="width:251px;">Bio Medical Science</td>
			<td style="width:119px;">BC-bmb20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Quick-DNA Microprep Kit</td>
			<td style="width:251px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3021</td>
			<td>Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">1.5 mL microtube</td>
			<td style="width:251px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">616-201</td>
			<td>See 4.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">HIgh speed refrigerated micro centrifuge</td>
			<td style="width:251px;">TOMY</td>
			<td style="width:119px;">MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Covaris M220</td>
			<td style="width:251px;">Covaris Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4482277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">ThruPLEX DNA-Seq kit</td>
			<td style="width:251px;">Rubicon Genomics</td>
			<td style="width:119px;">CAT. NO. R400406</td>
			<td>Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:251px;">Bioer Technology</td>
			<td style="width:119px;">TC-96GHbC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">AMPure XP reagent</td>
			<td style="width:251px;">BECKMAN COULTER Life Science</td>
			<td style="width:119px;">A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td style="width:251px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">054-027335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">EB buffer</td>
			<td style="width:251px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:119px;">19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">2200 TapeStation</td>
			<td style="width:251px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2965AA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D1000 Reagents</td>
			<td style="width:251px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D1000 ScreenTape</td>
			<td style="width:251px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent</td>
			<td style="width:251px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cubee Mini-Centrifuge</td>
			<td style="width:251px;">RecenttecGenereach</td>
			<td style="width:119px;">R5-AQBD01aqbd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MiSeq 600 cycle v3</td>
			<td style="width:251px;">Illumina Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MS-102-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MiSeq Sequencer</td>
			<td style="width:251px;">Illumina Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultralow input genome sequencing library preparation from a single tardigrade specimen

Tardigrades는 ametabolic 상태가 물 제공 이라고 anhydrobiosis 건조 및 수를 직면 하는 때 그들의 원래 상태로 돌아가기 현미경 동물 이다. Tardigrades 위험 세균 오염 때로는 같은 미세한 동물의 게놈 시퀀싱이이 동물에서 수평 한 유전자 이동의 범위에 관한 예를 들어 잘못 된 해석에 지도 한다. 여기, 우리는 하나의 견본에서 tardigrade, Hypsibius dujardini의 게놈을 시퀀싱 하는 ultralow 입력된 방법을 제공 합니다. 50의 효율적인 추출 함께 엄격한 세척 및 오염 물질 제외를 채용 하 여 ~ 한 개인에서 200 pg genomic DNA, 우리 건설 DNA 시퀀싱 장비 시퀀싱 라이브러리. 이러한 라이브러리 높은 재현성 및 편견, 그리고 다른 H. dujardini 유전자와 시퀀스 읽기의 정보학 분석 오염의 최소한의 금액을 보여주었다. 이 메서드는 이전 방법을 사용 하 여 시퀀싱 할 하지 unculturable tardigrades을 적용할 수 있습니다.

오염 물질 배제:
이 프로토콜은 tardigrade와 오염을 최소화 하기 위해 항생제 치료와 살 균의 철저 한 씻기를 포함 한다. 그것은 또한 이러한 프로세스의 완전성을 보장 하기 위해 시각적 검사 과정을 포함 한다. 유효성 검사 (2.4/프로토콜 단계) 동안 현미경 이미지를 그림 2에 표시 됩니다. 500 X 배율에서 관찰 하는 경우 개별 tardigrade 주위에 이동 하는 작은 입자로 세균 세포를 볼 수 있습니다.
DNA 라이브러리 품질의 유효성 검사:
생성 된 DNA 시퀀스 (Seq) 도서관의 총 금액은 약 109.5 ng (7.3 ng / µ L x 15 µ L)16. 조각화의 길이 분포의 유효성을 검사 하는 전기 영동 패턴 유사 해야 그림 3. 우리가 550 조각화 크기 설정 시스템 전단 DNA와 bp, 라이브러리 550-600 bp, 시퀀싱 어댑터를 포함 하 여 이어야 한다. 그것은 대부분 시퀀스 라이브러리의 200-1000 bp 사이 포함 되어 있으며 복제 (N1 ~ N4) 사이 일치 볼 수 있습니다.
시퀀스 데이터 분석: DNA 시퀀싱 실행 당 대략 20에 25-M 짝된 읽기 생성. 품질의 유효성 검사는 FastQC (그림 4)를 사용 하 여 실시 했다. 시퀀스 읽기에 따라 품질의 분포 300 bp 짝된 실행의 전형 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57615/57615fig1.jpg"> 그림 1:이 프로토콜의 워크플로. 이 그림에이 프로토콜에 대 한 요약입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57615/57615fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57615/57615fig2.jpg"> 그림 2 : 박테리아 없는 tardigrade의 대표 사진. 이 그림 추가 확대 이미지 (아래)와 함께 오염된 (왼쪽된) tardigrade 및 청소 (오른쪽) tardigrade (Hypsibius dujardini)의 이미지를 보여 줍니다. 막대 모양의 세포는 tardigrade 주위 오염 되며, 화살표와 함께 표시 됩니다. 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57615/57615fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57615/57615fig3.jpg"> 그림 3 : 생성 된 DNA 라이브러리의 조각 길이 분포의 유효성 검사. 이 패널은 시퀀싱 라이브러리 크기의 분포를 보여줍니다. 보라색과 녹색 라인 각각 1500 및 25 bp에서 상위 및 하위 마커를 나타냅니다. L = 사다리, S = 1 샘플/실행, N1-N4 = 4 복제/실행. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57615/57615fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57615/57615fig4.jpg"> 그림 4 : FastQC DNA 시퀀스 (Seq) 품질의 유효성 검사의 예. DNA-Seq 데이터 시퀀스 성능을 확인 하기 위해 FastQC를 제출 했다. 기본 시퀀스 품질 당 DRR055040에 대 한 대표적인 결과 (DDBJ 시퀀스 읽기 아카이브 DRA00445516) 표시 됩니다. (A)이이 패널 앞으로 읽기 (R1)를 보여 줍니다. (B)이이 패널 역방향 읽기 (R2)를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57615/57615fig4large.jpg">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen at JoVE.com

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

ultralow-input-genome-sequencing-library-preparation-from-single

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.6K 조회수.  Keio University. 미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.

비디오: Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...