우리는 박사 토마스 Tuschl, RNA 분자 생물학 실험실의 머리 뿐만 아니라 그들의 지원에 대 한와 그의 실험실에 RNAworld 파이프라인에 대 한 액세스를 제공 하는 개발 된 기술을 공유 하기 위한 그의 실험실의 구성원 감사. 우리는 또한 그의 프로토콜을 공유 하 고 그의 초기 절차에 사용 된 모든 생화학 및 효소 단계에 자세한 설명을 제공 하 박사 마르쿠스 Hafner 감사 합니다.

<ol>
	<li>Peir&#243;-Chova, L., Pe&#241;a-Chilet, M., L&#243;pez-, J. A., Garc&#237;a-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality.">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li><li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues:+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients.">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).</li><li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity.">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li><li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues.">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li><li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples.">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li><li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues.">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517 (2013).</li><li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues.">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).</li><li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li><li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR:+the+strengths+and+pitfalls.">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li><li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR.">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li><li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays.">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144 (2011).</li><li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples.">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li><li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue:+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance.">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li><li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+and+cancer.">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li><li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis,+prognosis+and+targets+for+therapy.">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li><li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies.">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500 (2011).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li><li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens.">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).</li><li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+DNA/RNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs,+mRNAs,+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens.">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).</li><li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailovi&#263;, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing.">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li><li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing,+selection,+extension+and+ligation+platform:+assessing+its+performance+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma.">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li></ol>

저자는이 원고에 표시 하는 데이터의 일부를 포함 하는 간행물 Loudig 그 외 여러분 에 의해 분자 과학의 국제 저널에 출판 되었음 공개 하고자 21.

NGS FFPE RNA 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의에 대 한 높은 재현성 및 강력한 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 Hafner 외. 에 의해 설명 하는 절차의 수정 하 고 최적화 된 버전은이 프로토콜에서 제공 됩니다. 22
이 프로토콜의 모든 단계는 FFPE 표본에서 발견 이전 보관 및 손상 된 총 RNA와 함께 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 FFPE RNA의 적은 양을 처리의 핵심 단계 18 독특한 3' 바코드 어댑터와 개별 ligations 후 (즉, 18 개별 100 ng FFPE RNA 샘플) 모든 RNA 샘플의 풀링에서 거주 한다. 이 중요 한 단계 18 FFPE RNA 샘플을 균일 하 게 모든 후속 생화학 및 효소 단계 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해 필요한 수 있습니다. 또한,이 단계 precipitations 겪고 RNA의 양을 극대화 및 젤 담긴 작은 RNA 분자의 캐리어 효과 강화 하 고 촉진 하 여 관찰 작은 젤 선택. 이 프로토콜을 추가 FFPE RNA의 소량을 작업할 때 그 다양성을 강조, 파일럿 PCR 반응 cDNA 라이브러리의 최적의 확대 주기를 식별 하는 데 사용은의 또 다른 주요 기능. 이 단계는 또한 뇌관 이합체 증폭, 대규모 PCR 반응 준비 하 고 정화는 agarose에 작은 RNA 도서관 젤 중요 한 때 대 도서관 증폭의 역학에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 이 프로토콜에 추가 하는 데이터 사이이 방법의 재현성 일치 냉동 최대 35 년 동안 보관 하는 FFPE 표본, 그리고 또한 강조 이전 FFPE RNA에 그것의 적용에서 표본 샘플 보여 줍니다.
낮은 질 및 화학적 수정 하 고 손상 된 FFPE RNA의 수량에서 만든 작은 RNA 라이브러리의 준비를 위해 최적화 되어 있으므로이 프로토콜의 원래 버전에서 수정 되었습니다. 칵테일은 초기 3' 바코드 어댑터 결 찰를 입력 0.026 감소 했다 동안 아군 캘 리브레이 터의 양 관련이 성공적으로 선 하 고 증폭 하는 FFPE 표본에서 작은 RNAs 수정 된이 절차의 한 측면을 방지 하기 위해 nM 낮은 abundancy의 결 찰과 경쟁 작은 RNAs는 FFPE RNA 샘플에 존재합니다. 원래 프로시저에 다른 중요 한 수정이 했다 모든 방사성 레이블된 크기-마커 페이지 젤에 합자 작은 RNAs의 선택 사용의 제거. 이러한 방사선된 크기 마커의 사용 뿐만 아니라 실험실 라디오 동위 원소의 사용 하지만 젤에 RNA 제품의도 막 았된 관찰에 대 한 인증을이 방법의 적용을 제한. 대신,이 최적화 된 프로토콜에서 크기 마커는 웰 스 라이브러리 페이지 젤에 인접 한에서 실행 하 고 합자 작은 RNAs의 절단 하는 형광 염료와 직접 시각. 중요 한 것은, 형광 염료 RNA 제품의 확산을 방지 하기 위해 젤에 가볍게 뿌리 이며 다음 블루 라이트 박스에 시각. 그 후, 예방의 및 삭제 페이지 젤 조각에 포함 된 합자 작은 RNAs의 보급 향상을 측정 젤 분리기 튜브는 균일 하 게 동요에서 4 ° C에서 하룻밤 NaCl 용액에 부 화 하기 전에 젤을 짝사랑 하 사용 됩니다. 이러한 모든 단계는 작은 양의 재료와 함께 작동 하도록 신중 하 게 평가 했다.
이 프로토콜은 서로 다른 양의 시간에 대 한 저장 했다 다른 소스 (장기 및 기관)에서 FFPE RNA 샘플에 적용 되었습니다. 분석 절차를 최적화 사용 하 여이 때 신선 하 고 냉동 표본에서 작은 RNAs를 시퀀싱의 높은 재현성을 공개 했다. 최대 35 년 동안 저장 보관 된 이전 FFPE 표본를 사용 하 여 추가 분석 프로토콜의 광대 한 적용 임상 견본에 입증 되었습니다. FFPE 표본에 대 한 최소 FFPE RNA 입력된 요구 100 표시 했다 니. 이 낮은 요구 사항을 허용 다양 한 병 변은 서로 다른 크기와 가용성,이 프로토콜의 적용 하지만 단일 셀 FFPE RNA의 분석을 허용 하지 것 이다. 그러나 주의 하는 것이 중요 하다,,이 프로토콜 최적화는 또한 함께 사용 되었습니다 미만 1의 입력 exosomes 순환에서 추출 된 총 RNA ng 재현할 매우 작은 RNA 식 프로필 (데이터 표시 되지 않음)를 제공 하 고. 이 낮은 입력 제안 FFPE 샘플 작은 RNAs 비록 원래 신선한 조직의 대표는 exosomes 순환에서 총 RNA에 보다 훨씬 더 낮은 비율에 존재 합니다.
어디이 최적화 된 프로토콜 임상 분류 DCIS FFPE 표본에 적용 된, 최근 작품에 양이 많은 PCR 미르 식 차이 cDNA 라이브러리의 NGS 식별의 유효성을 검사할 수는 발견 했다. 이 작품의 대규모 회고전 연구 [20] 다른 기관에서 보관 된 조직에서 병 변 DCIS를 사용 하 여 타당성을 설명 했다. 이 연구는 또한이 cDNA 라이브러리 준비 재현성 및 분석 결과의 감도 저하 없이 (에서 몇 주 간격), 서로 다른 시간에 수행 될 때의 견고성을 강조 했다.
임상 분류 보관된 FFPE 표본 방대한 고려이 최적화 된 프로토콜 대규모 회고전 분석에서 cDNA 라이브러리의 준비를 위한 및 미르 biomarkers의 잠재적인 식별을 위해 강력한 도구를 제공 암 개발21와 관련 된.

miRNAs는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 표본1,2,3에 너무나 잘 보존 된다. 이러한 짧은 규제 비 코딩 단일 좌초 RNA 분자의 표현을 FFPE 샘플에서 총 RNA를 사용 하 여 성공적으로 평가할 수 있다 고 관련 유전자 표현 데이터 원본 신선한에 비해 제공 이전 작품 시연 하고있다 조직4,,56,7,8. 비판적으로 FFPE 조직 처리 (포름알데히드, 열, 건조, 등), 내 생 RNases miRNAs (~ 18-24의 작은 크기는 견본의 나이 의해 영향을 받을 수 표시 된 큰 크기 메신저 RNAs에 비교 될 때 뉴클레오티드) 저하 방지 및 장기 저장, 보관 된 표본9의 높은 처리량 mRNA 연구를 능가할 미르 식 연구를 통해 증명 또한 탄력 있도록 나타납니다. miRNA 식 연구 주로 소규모 분석에서 수행 되었습니다, 보관 된 임상 견본을 사용 하 여 해당 단일 증명 또는 다중화 정량 PCR 분석 실험, microarray 기술, 그리고 가장 최근 NGS의 종류 수 있습니다. 이 분석 실험10,,1112,,1314의 최적화 후 보존 된 miRNAs의 식을 평가 하기 위해 사용.
그것은 명백한 되고있다 dysregulation 미르 식의 다양 한 인간 악성의 개발과 관련 된 되었습니다 하 고 보관 된 표본 주석는 잠재적으로 거 대 한 공급의 임상,을이 작은 RNA 분자는 잠재적인 암 바이오 마커의15,16,,1718의 유망한 소스를 나타냅니다. NGS 같은 높은 처리량 유전자 표현 기술의 사용 PCR 그리고/또한 microarrays19등 대상된 기술에 비교 될 때 모든 miRNA 성적표의 글로벌 평가 제공의 이점이 있다. 이러한 이유로, NGS 위한 이전 보관 된 표본에서 작은 RNAs의 cDNA 라이브러리 준비를 위한 최적화 된, 저렴 한 가격, 그리고 쉽게 적용 가능한 프로토콜 대규모 회고전 연구20수 있도록 최적화 되었다.
우리는 이전 우리 현대 상업 키트21을 능가할 수 있는 오래 된 보관 된 표본에서 RNA와 DNA의 별도 복구에 대 한 동시 RNA/DNA 추출 프로토콜을 설립. 시간의 연장된 기간 동안 보관 하는 FFPE 직물에서 총 RNA를이 추출 프로토콜을 사용 하 여, 우리 최대 35 년 동안 임상 표본에서 보존 하는 miRNAs의 NGS 위한 cDNA 라이브러리의 준비를 최적화. 또한, 최근에 출판 된 연구에서 우리가 어디에서 임상 분류 ductal 암에 제자리에 cDNA 라이브러리 (DCIS) 표본 준비, 우리는 표시 된 정량 PCR에 의해 검증 된 차동 표현 된 miRNAs 확인 그 특정 miRNA 표정 변화 DCIS 유방암을 개발 하지 않는 환자에서 DCIS 장애에 비해 유방암에 걸린 환자에서 병 변에서 감지 될 수 있습니다.
고려 상업 키트 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해, 그들의 중지에 대 한 잠재력의 비용으로 최적화할 수 없습니다 저작권/특허 보호 시 약의 사용, 우리는 이전 게시 된 적응 하기로 실험실 및 키트 무료 3' 바코드 cDNA 라이브러리 준비 위한 프로토콜 FFPE 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의 NGS,22를샘플링 18의 동시 분석을 허용 합니다. 이 프로토콜 FFPE RNA 견본에 적응에 대 한 중요 했다, 시각 및 기술 평가 검문소와 이상적이 고 강력한 단계별 절차를 제공 하 고 손상 된 또는 어려운 다른 소스를 응용 프로그램에 대 한 강한 잠재력을가지고 이용 하 여 RNA 소재. 원래 프로토콜의 적용 형광 (예를 들어, SYBR 골드)와 방사성 레이블된 크기 마커를 대체 하 여 향상 되었습니다 감지 RNA 크기 마커 큰 polyacrylamide 젤에 합자 라이브러리의 선택 사용. 3' 18 개별 FFPE RNA 견본을에 바코드 어댑터의 결 찰 의존이 최적화 된 프로토콜 다음 5' 어댑터 결 찰을 함께 풀링된 리버스-전사, 그리고 파일럿 PCR 분석에 대 한 맞춤형 최종 cDNA의 증폭 높은 처리량 시퀀서에 대규모 PCR 증폭, 정화, 그리고 NGS 이전 도서관.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Triton x-100</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM ATP</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8110G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X dNTPs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8110G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14M Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3445I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nt ladder</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>M-232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mg/ml Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8894-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Titanium Taq</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>639208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9170-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424R</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>4054-4537Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppndorf Thermomixer</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>4053-8223Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Breaker Tube 0.5 ml</td>
			<td>IST Engineering Inc,</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jersey-Cote</td>
			<td>LabScientific, Inc</td>
			<td>1188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KcL 2M</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 1M</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minifuge dual rotor personal centrifuge</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>2641-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers</td>
			<td>Ciore Life Science</td>
			<td>21070010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Defined during order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme PmeI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Imager 2.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Imager 2.0 blue light transilluminator</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III reverse transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrGold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q</td>
			<td>NEB</td>
			<td>0351L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Themocycler with heated lid</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4359659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 1M pH8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-833</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrospective microrna sequencing: complementary dna library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded rna specimens

-보관, 임상 분류 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 암 개발의 회고전 분자 연구에 대 한 핵 산을 제공할 수 있습니다. 사용 하 여 나중에 침략 적인 질병을 개발 하는 환자에서 비 침 습 또는 미리 악성 병 변, 진 식 분석 암 위험을 predispose 초기 분자 변경 식별 도움이 됩니다. 그것은 음 핵 산 FFPE 직물에서 발견 한 심각한 물리적 손상과 그들의 분석을 어렵게 하 고 일반적으로 적응된 분석 실험을 요구 한다 화학 수정 받은 설명 하고있다. 그러나 MicroRNAs (miRNAs),, 소규모 클래스를 대표 하는 RNA 분자 ~ 18-24만 까지의 스패닝의 뉴클레오티드, 장기 저장을 견딜 하는 FFPE 샘플에서 성공적으로 분석 된 표시 되었습니다. 여기에서 우리는 3' 바코드 보완 DNA (cDNA) 라이브러리 준비 프로토콜 때 보관 사용 하 여 강력 하 고 매우 재현 될 최근 시연 했다 보관 된 조직에서 추출 하는 작은 RNAs의 분석을 위해 특별히 최적화 된 선물 임상 표본 최대 35 년 저장입니다. 이 라이브러리 준비는 소재의 손상/저하 (최대 18) RNA 샘플 개별 3' 바코드 어댑터와 출혈 하 고 후속 효소 및 생 화 확 적인 준비에 대 한 다음 함께 풀링된 다중 분석을 잘 적응 이전에 분석. 모든 담긴 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), 크기 관련 선택 및 바코드 작은 RNA 종의 풍부는에 의해 수행 됩니다. 이 cDNA 라이브러리 준비는 파일럿 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 자료의 최적의 금액을 생산 하는 특정 증폭 주기의 결정 수 분 RNA 입력에 잘 적응. 이 이렇게 최대 35 년 동안 보관 하는 표본에서 저하 FFPE RNA의 사용을 위해 최적화 되었다 고 매우 재현 NGS 데이터를 제공 합니다.

총 18 개별 FFPE RNA 샘플 메서드는 여기에 설명 된 대로 (100 ng 각) 3' adenylated 바코드 oligonucleotide T4 내 고 하룻밤을 별도 튜브에 설정 됩니다. 다음 날, 효소 반응 열 비활성화, 결합, 되며 단일 튜브에 침전. RNA 펠 릿 resuspended와 합자 RNA 분자 15 %polyacrylamide 젤 (페이지), 페이지 젤의 인접 한 우물에 하는 RNA oligonucleotide 크기 마커를 적절 하 게 크기의 3' 바코드를 선택 하는 데 사용 됩니다를 변성 시키기에 분리 된다 작은 RNAs (그림 2). 삭제 젤 조각 elute 합자 RNA 분자를 하룻밤 NaCl 용액에 알을 품는. 다음 날, eluted RNA 침전 하 고 5' 어댑터 결 찰 수행 됩니다. 5' 어댑터 출혈 작은 RNA 분자는 마이그레이션 그리고 12% 아크릴 아 미드 젤, 어디 다시 마이그레이션된 RNA 크기 마커 oligonucleotides 허용 작은 RNAs의 크기 절단 3' 바코드 oligonucleotides 및 5' 어댑터 ( 에 분리 그림 3). 삭제 젤 RNA의 차입을 허용 하는 NaCl 해결책에 하룻밤 incubated. 다음 날, 합자 작은 RNA 분자는 시 켰 던, 그리고 펠 릿 RNase 무료 물, 역-전사; 뒤에 resuspended cDNA 분자의 약 수는 파일럿 PCR 반응 (그림 4A)를 겪 습. CDNA 라이브러리의 동일한 입력을 사용 하 여 대규모 PCR 반응 설정 하 고 모든 반응 했다 PCR 증폭 (그림 4B), 풀링 이전 하 고 하룻밤 에탄올 강수량 적절 하 게 확인 하는 2.5 %agarose 젤에 평가 됩니다. 다음 날, 증폭 된 cDNA 라이브러리 18 독특한 FFPE RNA 표본에 대 한 모든 18 개별 라이브러리를 포함 하는 2.5 %agarose 젤에 최고 PCR 밴드, nt excised 이며 정화 100에서 실행 (그림 4C) 마이그레이션됩니다. CDNA 라이브러리 정화 순화 PCR 제품 뇌관 이합체의 초과 또는 PCR 반응의 다른 부산물을 포함 하지 않는 확인 하는 높은 감도 DNA 칩 (그림 5)에서 다음 계산 됩니다. PCR 제품 다음 높은 처리량 시퀀싱 시스템에 분석 된다. 어댑터 트리밍 및 각 18 표본 18 개별 파일의 생성 RNAworld 파이프라인을 사용 하 여 수행 됩니다 (액세스 제공 된 우리에 게 토마스 Tuschl 박사에 의해). Biostatistical 분석 다음 FFPE RNA 견본의 미르 내용을 평가 하기 위해 수행 됩니다.
이 확인 하기 위해 최적화 절차, 일치 하는 신선한 냉동 고 FFPE 유 방 종양 표본을 분석 (그림 6) 사용 되었다. 2 유사한 절차의 감도 평가 하 고 미르 식 차이 두 신선한 냉동된 조직 사이 식별 또한에 검출 될 수 있는 경우는 일치 보관 FFPE 결정에 침략 적인 ductal 유 방 암 (IDC) 종양 선정 됐다 RNA의 표본 이 실험에 대 한 총 RNA 2 신선한 냉동 및 일치 2 FFPE RNA 샘플 로부터 얻은 했다의 품질 평가 (그림 6A). 예상 대로, RNA 크기와 FFPE 표본의 품질 심각 하 게 감소 했다 (비교 레인 1, 3, 2, 4 차선) 일치 신선한 냉동된 RNAs에 비교 될 때. FFPE RNA 중 하나는 4 년 (침략 적인 유 방 암 1, (IBC1))에 대 한 실시간에 보관 했다 하 고 다른 했다 보관 RT에서 8 년 (IBC2), 신선한 냉동된 대응 했다-80 ° c.에 저장 된 4 명의 개별 RNA 표본 4 개별 바코드와 미르 플롯 그림 6B에 표시 되는 메일을 읽기를 사용 하 여 단일 라이브러리에 분석 되었다. 두 개의 상위 패널 표시 미르 식 상관 관계 2-신선한 냉동된 종양 RNAs와 특정 FFPE RNA 견본 들 사이. 음모 사이 일치 신선한 냉동 FFPE miRNAs 나타냅니다 그 cDNA 라이브러리 준비 제공 좋은 재현성 표본 다르게 처리 (냉동 대 FFPE)에서 발견 하는 miRNAs 사이 높은 상관 관계를 관찰 될 수 있다. 두 낮은 패널 두 개의 다른 FFPE 종양 및 두 개의 서로 다른 냉동된 종양에서 miRNA 식 데이터 사이의 상관 관계를 표시합니다. 그림 6 c에 표시 된 대로 두 신선한 냉동된 종양 사이 식별 미르 식 차이 차이 두 일치 FFPE 종양 표본 사이 감지와 상관 했다. 의미 미르 식 차이 감지 했다 모두 신선한 냉동 고 FFPE 종양.
이 방법의 감도 더 평가 하려면 12 보관된 FFPE 표본 및 4 신선한 냉동된 RNA 표본에서 miRNA 식 데이터 사용 되었다 (그림 6D). 16 다른 RNA 표본 개별적으로 3' 바코드와 모두 단일 cDNA 라이브러리의 준비를 위해 사용 했다. 이 라이브러리에 포함 된 두 개의 유 방 셀 라인는 MCF10A에 사용 RNA 샘플 (보통 같은 셀 라인)와 MCF7 (유방암 암 세포 선) 신선한 냉동 그들의 보관된 FFPE 대응23, 일치와 신선한 세포에서 RNA와 FFPE RNA 샘플 두 개의 유방암에서 샘플 (IBC1와 IBC2 그림 6A 에서 6B), 독립적으로 분석 하 고 일치 하는 신선한 냉동 및 FFPE RNA 정상적인 자 궁 경부 샘플 (Cx)에서 합니다. 또한, 보통 (일반 Br1, 정상적인 Br2, 및 정상적인 Br3), 및 그들의 신선한 냉동된 대응 없이 암 유 방 조직 (IBC 5, IBC 6, 및 7 IBC)에서 보관 된 FFPE 표본 분석 되었다. 신선한에 heatmap에 관찰 냉동 또는 FFPE RNA 기원, 미르 식 프로필 동일한 셀 (MCF10 또는 MCF7), 또는 같은 조직 (IBC1, IBC2, 또는 Cx) 함께 클러스터. 또한, 왼쪽에서 오른쪽, 자율된 클러스터에서 설명 했 듯이 정상적인 유 방 세포와 조직에 유 방 종양과 종양 세포 동안 함께 클러스터 클러스터 오른쪽에. 표시 다른 미르 식 프로필, 자 궁 경부 조직은 heatmap의 오른쪽에 클러스터링.
고려 하 고는 대부분의 임상 보관된 FFPE 표본 필요가 없습니다 신선한 냉동된 대응 하지만 그들은 다른 저장 기간 후 검색할 수 있습니다, 그것은 최적화 된 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 적용 했는지 확인 하고자 했다 고 점점 나이가 FFPE 견본으로 재현. 그림 7, 18, 20, 22, 27에 대 한 보관 하는 FFPE 직물에서 miRNA 식 프로필에에서 표시 된 대로 30, 및 35 년 얻은 했다. RNA는 최적화 된 동시 RNA/DNA 절차21를 사용 하 여 추출 된 그리고 각 개별 FFPE 견본에서 quadruplet RNA aliquots 같은 날에 준비 하 고 이전 라이브러리 준비-80 ° C에 저장 했다. 9 다른 FFPE 표본의 총 각 개별 RNA 약 수 같은 라이브러리 내 다른 바코드 oligonucleotides (총 18 바코드)와 출혈은 중복에서 분석 되었다. 이 실험은 2 주 연속 (1 주와 2 주) 동안 반복 되었다. 이 단일 라이브러리 내의 그리고 일주일 간격으로 두 개의 서로 다른 라이브러리 사이 2 개의 다른 바코드를 사용 하 여 동일한 RNA 견본으로 cDNA 라이브러리 준비 재현성 평가 허용. 그림 7에 관찰, 상관 계수는 견본 또는 라이브러리 준비 주;의 나이에 0.96 위에 남아 따라서, 최적화 된 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 FFPE 표본의 보관 시간에 재현할 수 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다, 그리고 예를 들어 35 세 보관된 FFPE RNA 높은 재현성 측정 표시 (유 방 #9 참조) 20-올해-옛 FFPE RNA 샘플 (유 방 #3 참조)와 함께 언급 하는 그 것과 같습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57471/57471fig1.jpg"> 그림 1: Oligonucleotides. 모든 oligonucleotide 시퀀스, 해당 화학 수정 및 농도이 프로토콜에 사용 되는 설명 되어 있습니다. 화학 수정 유형의 수정 상자와 oligonucleotide 시퀀스에 표시 하는 약식된 수정에 설명 되어 있습니다. 캘 리브레이 터 칵테일 10 개별 RNA oligonucleotide 교정기, 캐리어 oligonucleotide (0.5 µ M)를 포함 하는 솔루션에서 resuspended 했다의 목록을 표시 합니다. 18 3' 바코드 oligonucleotide 어댑터 회색 음영 바코드의 시퀀스 자세히 나와 있습니다. 5' 어댑터의 RNA 순서 그리고 3' PCR 및 5' PCR 뇌관의 DNA 시퀀스 자세히 나와 있습니다. 즉 19 nt-3 프로토콜에서 참조 된 두 개의 크기 마커 oligonucleotides의 RNA 시퀀스 ' 어댑터와 24 nt-3' 어댑터 크기 마커, 제공 됩니다. 모든 DNA와 RNA oligonucleotides 상업적으로 구매 되었다. <a href="/files/ftp_upload/57471/57471fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57471/57471fig2.jpg"> 그림 2: 3' 바코드 RNA 샘플의 페이지 정화. 후 풀링 및 계기 18 바코드 RNA 샘플, resuspended RNA 펠 릿 마이그레이션 및 15% 아크릴에 전기 이동 법으로 분리 젤 (잘 8 참조). 붉은 광장 3' 바코드 microRNAs, 메스 칼 날 excised 되었고 시 microcentrifuge nuclease 무료 튜브로 포함 된 영역을 강조 표시 합니다. 총 4 개의 우물, 19 nt-3를 포함 하는 두 ' 어댑터와 포함 된 24 nt-3 2 ' 어댑터 라이브러리의 각 측에 잘 떨어져 설정 (참조 우물 5, 6, 10, 11, 각각). 합자 크기의 정화 및 T4 RNA 리가 1에 대 한 테스트로 될 마커 완료 다음 날, 결 찰 반응 19 nt-3를 포함 하 ' 어댑터 크기 마커 5' 어댑터와 24 nt-3' 5' 어댑터와 어댑터 크기 마커 스 2에서에서 실행 한 d 3, 각각. 노란색 사각형 5' 어댑터와 합자 크기 마커 RNA oligonucleotides 대표 삭제 밴드를 표시 합니다. 이 밴드는 정화, 침전, 하 고 실행 중 12%에 페이지 정화 ( 그림 3 참조). 웰 스 1과 13 합자 제품의 예상된 크기를 확인 하는 것을 도운 20 nt 크기 사다리를 포함 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57471/57471fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57471/57471fig3.jpg"> 그림 3: 5' 어댑터의 결 찰 후 정화 라이브러리의 페이지 정화. 순화 된 RNA 도서관은 5' 어댑터와 함께 출혈 및 예상된 제품 크기 12%에서 excised 했다 (빨간색 사각형 참조) 합자 크기 마커를 사용 하 여 페이지. 19 nt-3 사이 T4 RNA ligations의 제품 ' 어댑터와 5' 어댑터 (웰 스 4, 9) 24 nt-3 사이 ' 어댑터와 5' 어댑터 (웰 스 5와 10) 필요는 잘 포함 하는 RNA 라이브러리의 각 측에 병렬로 실행 했다. 최고의 밴드 (흰색 별표 참조) 5' 어댑터 결 찰의 제품 이며 젤 밴드 절단 포함 5'에 대 한 가이드로 사용 어댑터 출혈 RNA 라이브러리. 이전 페이지에서 정화 하는 결 찰 크기 마커 결 찰 제품 잘 3에서 실행 됩니다. 웰 스 1과 12에서에서 관찰, 20 nt 크기 사다리 RNA 라이브러리의 예상된 크기를 확인 하기 위해 또한 실행 되었다. <a href="/files/ftp_upload/57471/57471fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57471/57471fig4.jpg"> 그림 4: 파일럿 PCR 및 cDNA 도서관의 대규모 증폭. 크기와 PCR 제품의 비율이 2.5 %agarose 젤 ethidium 평범한 사람 앞에 평가 되었다. (A) 후 바코드 RNA 라이브러리, cDNA 라이브러리의 약 수의 반전 녹음 방송 단 하나 조종사 PCR 반응에 5'과 3' PCR 뇌관을 사용 하 여 증폭 되었다. Aliquots 파일럿 PCR 반응의 10, 12, 14, 16, 18, 및 20 사이클에서 얻은 고 2.5 %agarose 젤에 마이그레이션. 웰 스 1과 7 사이 관찰, cDNA 라이브러리 및 어댑터 이합체의 존재 했다 기 하 급수적으로 관찰 (녹색 사각형 참조). 이 라이브러리에 대 한 PCR 주기 cDNA 도서관의 확대를 위한 선택 했다 15. (B)이이 회로도는 위치와 길이 다른 oligonucleotides 및 결과 RNA와 DNA, 제품 페이지 및 agarose 젤에 식별할 수 있는 표시 됩니다. 6 대규모 PCR 반응 ( A에서 식별)의 (C) Aliquots 2.5 %agarose 별도로 분석 했다 (스 3-8 참조) 젤. PCR 제품의 두 가지 유형, 즉 라이브러리 (위 밴드) 및 뇌관 이합체 (낮은 밴드)에 표시 됩니다이 젤 (참조 녹색 사각형). CDNA 없이 빈 PCR 반응 없음 PCR 확대 표시 (도 2 참조). 20 nt 크기 사다리 제품의 크기 (잘 1 참조)의 확인을 수 있습니다. (D) 젤 2.5 %agarose 블루 빛 transilluminator에 이미지 젤 풀링된 PCR 반응을 포함 하는 두 개의 인접 한 우물에 달렸다. 관찰, 두 웰 스에서 최고의 밴드 예상된 라이브러리 크기 이내 이며 어댑터 이합체 밴드 아래 위치 하 고 있습니다. 위 PCR 악대 excised 되었고 젤 추출 키트와 함께 정화. <a href="/files/ftp_upload/57471/57471fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57471/57471fig5.jpg"> 그림 5: 순화 된 PCR의 증폭 DNA 도서관. PCR 증폭된 cDNA 도서관의 작은 약 수 (1 µ L) 마이크로 기반 플랫폼에 높은 감도 DNA 칩을 사용 하 여 분석 된다. (A)이이 패널 표시 계측기의 교정에 대 한 크기 표식의 마이그레이션. (B)이이 패널에는 순화 된 PCR 증폭된 cDNA 라이브러리의 마이그레이션을 표시 됩니다. 가장 높은 100의 크기로 측정 혈압 (별표 참조) cDNA 라이브러리를 나타냅니다. 작은 피크 72에 평가 악기에 의해 혈압 뇌관 어댑터 이합체를 나타냅니다. 100 bp 피크 포함 18 개별 바코드 RNA 표본 후속 NGS 시퀀싱 높은 처리량 시스템에 대 한 증폭 된 cDNA 라이브러리에 대 한 예상된 크기 기반 마이크로 플랫폼 계시에 의해 감지. <a href="/files/ftp_upload/57471/57471fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57471/57471fig6.jpg"> 그림 6: cDNA 라이브러리 준비 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 일치 하는 포함 하는 신선 냉동 하 고 포 르 말린 고정 파라핀 표본. (A) 총 RNA 추출에서 일치 신선한 냉동 고 FFPE 침략 적인 ductal 암 (IDC) 종양 마이크로 기반 플랫폼에 총 RNA 칩에 분석 했다. (B) 총 RNA 일치 신선한에서 냉동 고 FFPE 표본 (IBC 1와 IBC2) 받았다 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 및 미르 시퀀싱 데이터 표시 했다. (C) DifferentialmiRNA 식 IBC1/IBC2 표본 및 상관 관계 사이 사이 언 FFPE 대응 샘플. miRNA 식 당 로그 수에 표시 됩니다 백만 (CPM), 높은 낮은 읽기 (블루 색상 빨강)에서. 미르, 당 두 조직 쌍 식 차이의 중요성 높고 낮은 식 miRNAs 신선한 및 FFPE 샘플에서 확인 된 회색 원으로 표시 됩니다. (D) 총 RNA 일치 신선 하 고 유 방 셀 라인 (MCF10A 및 MCF7), 인간의 침략 적인 유방암 (IBC 1와 IBC2), 자 궁 경부 조직 (Cx)의 FFPE RNA 표본에서 추출한 정상적인 유 방 직물 (일반 Br1, 정상적인 Br2, 및 정상적인 Br 3), 보관 및 보관 된 침 윤 성 유방암 (IBC 5, IBC 6, 및 IBC7) 같은 실행 내에서 cDNA 라이브러리 준비를 했습니다. 라이브러리에서 검색 하는 miRNAs의 NGS 데이터 열 맵 구성에 표시 됩니다. 이 그림 Loudig 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 20 <a href="/files/ftp_upload/57471/57471fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57471/57471fig7.jpg"> 그림 7: cDNA 라이브러리 준비와 미르 식 사이 상관 관계가 더 오래 사용 하 여 복제 FFPE 표본 보관. 18, 20, 22, 27, 30, 및 35-올해-옛 보관된 FFPE 유 방 조직 표본에서 총 RNA 우리의 최적화 된 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜을 받았다. 9 다른 FFPE 표본에서 복제 RNA 샘플 다른 3' 바코드 oligonucleotides와 출혈 되었고 주 1 (w1)에 동일한 라이브러리 내에서 분석. 동일한 실험 1 주 간격 (주 2 또는 w2) 내에서 반복 되었다. 0.93에서 0.99 사이 평가 상관 계수는 heatmaps에서와 같은 보관 된 RNA 표본 간에 중복된 미르 식 데이터의 재현성 측정 표시 됩니다. 이 그림 Loudig 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 20 <a href="/files/ftp_upload/57471/57471fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

retrospective-microrna-sequencing-complementary-dna-library

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.3K 조회수.  Hackensack University Medical Center. 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...