우리 아 이들의 종양학 그룹 AAML1531 연구 및 환자 샘플의 형태로 그들의 공헌에 대 한 간호사 건강 연구에서 참가자를 감사합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회 (UM1 CA186107, RO1 CA49449 RO1 CA149445), 아 이들의 발견 연구소의 워싱턴 대학교 세인트 루이스 어린이 병원 (엠씨-II-2015-461)와 일 라이 세스 매튜 스 백혈병 재단에 의해 투자 되었다.

<ol>
	<li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations.">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li><li>Young, A. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia.">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li><li>Krimmel, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers.">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

다른 질병에 낮은 VAFs와 돌연변이 연구를 쉽게 구현할 수 있는 오류 수정 시퀀싱 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 그들은 원시 읽기 오류 보정을 가능 하 게 가장 중요 한 요소 시퀀싱 전에 각 분자 Umi의 법인입니다. 여기에 설명 된 방법을 상용 유전자 패널을 자체 설계 유전자 특정 oligos 사용자 지정된 Umi를 통합 하는 연구를 허용 합니다.
표준 NGS 프로토콜 precludes 시퀀싱 오류 비율 때문 2% 아래 VAF와 변이의 탐지 하 고이 희소 한 이체의 탐지는 중요 한 연구에서 NGS의 응용 프로그램을 제한 합니다. 우회 표준 NGS 오류율, ECS이 원시 이체의 민감한 감지 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 돌연변이 처음 (따라서 데 낮은 VAF) 발생 때 병원 성 변이의 탐지 병14,15의 조기 개입에 게 필수적입니다. 백혈병 연구, 최소한의 잔류의 검출에에서 질병 (잔여 leukemic 세포 후 처리) 위험 계층을 알립니다 및 이진 흐름 cytometric 평가 수 없습니다 하는 방식으로 치료 옵션을 통보 하는 데 사용할 수. 또한, ECS 순환 종양 핵 산을 검출 하 고 단단한 종양 환자에서 전이성 잠재력을 평가 하는 존재/부재로의 기본 특성은 특정 돌연변이의 변형 부담을 평가 하 여 적용 됩니다. 종양16.
표 1에서처럼 변종 전화 위치 특정 오류 이항 분포-기반 모델을 사용 하 여 전원 시퀀싱 오류 모델을 구축 하는 데 사용의 깊이 뿐만 아니라 시퀀스 라이브러리의 수에 따라 달라 집니다. 오류 모델의 견고성 샘플 및 시퀀싱 깊이 더 높은 수가 증가합니다. 각 샘플에 대 한 오류 프로필 범위의 오류 수정 읽기 샘플 당 3000 x의 평균 최소한 10 시퀀스 샘플을 사용 하는 것이 좋습니다. 위치-특정 방식은 비슷한 MAGERI, 하지만 모든 6 다른 대체 종류에 대 한 집계 오류 비율을 사용 하는 대신 (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, 우리 모든 위치에 독립적으로 각 대체 모델. 예를 들어, C의 오류 비율 > T는 genomic 위치는 다른 위치에서 다른. 우리의 접근 방법 또한 걸립니다 계정에 연속 배치 효과 관찰 한 시퀀싱 실행 기본 대체 속도에서 실행 하는 다른 다를 수 있습니다. 따라서 그것은 특히 다른 시퀀싱 실행에서 샘플 모델 구축 풀링되지 때 모든 대체 형식에 대 한 각 위치를 모델링 하는 것이 중요.
ECS 실험을 설계할 때 중요 한 고려 사항은 원하는 검출 임계값입니다. NGS 연구의 아름다움은 그 그들은 쉽게 확장할 수 유전자/대상 관심, 검출 임계값 (시퀀싱의 깊이 의해 결정), 및 쿼리 하는 개인의 수의 점에서. 예를 들어 연구원은 0.0001의 감지 임계값을 갖는 2 개의 amplicons에 드문 돌연변이 찾을 관심이 있다면, 그들은 최대 15 백만 읽기 출력 MiSeq V2 화학을 사용 하 여 실행 한 시퀀싱에 극대로 75 샘플 수영장 수 (2 amplicons * 10000 분자 * 10 오류 수정에 대 한 읽기 * 75 샘플 15 백만 시퀀싱 읽기 =). 연구원은 시퀀싱 또는 단일 시퀀스 검출 임계값 조정 실행에 풀링된 샘플 수로가 하는 분자의 수를 변화할 수 있다. 우리의 연구에서 우리 0.0001 VAF (1:10, 000)의 감지 임계값으로 돌연변이 찾을 목적 Illumina 유전자 패널을 사용 하 여. 우리가 일상적으로 250를 사용 하 여 상기 검출 임계값을 달성 하기 위해 충분 한 분자 캡처되는지 확인에 DNA 시작의 ng. 연구팀은 DNA의 낮은 금액으로 시작 하도록 선택할 수 있습니다 (50 ng는 것이 좋습니다) 원하는 검색 제한이 > 0.001 VAF.
Umi i5 인덱스에 추가 됩니다, 시퀀싱 설정을 적절 하 게 수정 되어야 할. 예를 들어 16 N Umi, 사용 하 고 시퀀싱 설정 된 2 x 144 짝된 끝 읽기, 인덱스 1의 8 주기 및 인덱스 2의 일반적인 8 사이클 반대로 인덱스 2의 16 주기. 인덱스 2 주기 증가 사이클 읽기에 할당 된의 총 수에 있는 감소에 의해 보상 된다. 연구원은 12N Umi10,17를 사용 하기로 선택한 경우 인덱스 2의 12 주기를 설정은 변경 되어야 합니다.
이 우미 기반 시퀀싱 방법은 시퀀싱 오류 수정 최적화 됩니다. 모든 확대 기반 방법에 대 한 문제는 차선의 PCR jackpotting 처리에 남아 있습니다. 라운드 후 시퀀싱 및 게시물-생물 정보학 유효성 검사 ddPCR를 사용 하 여 수행 하 고 거의 PCR jackpotting 때문에 어떤 잘못 된 반응 감지. 그럼에도 불구 하 고, 연구원은 낮은 증폭 오류를 고화질 중 합 효소를 사용 하 여 실험을 실시 하는 것이 좋습니다.

우리가 나이, mutagens, 게놈, 그리고이에 체세포 착오의 축적에서 세포 분열 결과 중 확률 오류 노출에 기초가 악성 변화의 근본적인 병 인 신경 발달 질환, 소아 질환과 정상적인 노화1,2. 질병-운전 잠재력 체세포 돌연변이 조기 발견 및 위험 관리3,,45에 대 한 중요 한 진단 및 예 후 바이오 마커. 더 나은 physiologic clonogenesis 이해, 어떤 임상 통보 되며 결정, 정확한 정량화 및이 돌연변이의 특성화 연구 기본 중요성 이다. 차세대 시퀀싱 (NGS)은 현재 이기종 DNA 샘플; 클론 변이 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, NGS 식별에서 돌연변이로 제한 됩니다 > 0.02 변형 대립 유전자 분수 (VAF)-0.5-2.0의 고유한 오류 비율 때문 시퀀싱 플랫폼6,7,8%. 그 결과, 추적 진단 및 prognostically 중요 한 체세포 변종 낮은 VAF에 얻을 수 없다 표준 NGS를 사용 하 여.
최근, 다양 한 방법은 NGS8,9,,1011의 오류율을 회피 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 방법을 활용 분자 태그, 시퀀싱 후 오류 수정 가능 하 게 합니다. 각 분자 또는 시퀀싱 라이브러리에서 게놈 단편으로는 임의의 독특한 분자 식별자 (우미) 그 분자에 관련 된 태그입니다. Umi는 무작위 뉴클레오티드 (8-16 N)의 문자열의 순열에 의해 구성 됩니다. 두 번째 샘플 전용 바코드 또한 동일한 NGS 시퀀싱 실행에 여러 샘플을 멀티플렉싱 있도록 워크플로에 통합 된다. PCR 증폭 분자로 태그 라이브러리에서 수행 되 고 그 후 라이브러리 시퀀싱에 대 한 전송 됩니다. 라이브러리 준비 동안 PCR 증폭 및 시퀀싱8동안 오류 게놈 단편을 무작위로 소개 것 이다는 예상 된다. 임의의 연속 오류를 제거 하려면 원시 시퀀싱 읽기 우미에 따라 그룹화 됩니다. 시퀀싱에서 아티팩트 하지 진정한 variant를 충실 하 게 증폭 하 고 같은 바다를 공유 하는 모든 읽기에 시퀀싱 것 소개의 확률적 특성으로 인해 동일한 게놈 위치에 동일한 우미와 모든 읽기에 있을 예정 이다. 아티팩트는 제거 하는 bioinformatically. 여기, 우리가 설명 하는 세 가지 방법의 오류 수정 시퀀싱 (ECS) 단일 뉴클레오티드 변종 (SNVs) 및 작은 삽입-삭제 (Indels), 식별 하기 위해 dna 그리고 RNA 유전자 발현 아래의 정량화를 촉진 하기 위해 실험실에 최적화 된 NGS 오류 임계값입니다.
첫 번째 방법은 연구자에 의해 설계 된 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 희귀 체세포 이벤트에 대 한 보고 하는 방법을 설명 합니다. 라이브러리 준비, 이전 연구자 관심의 파편을 대상으로 프라이 머를 설계 해야 합니다. 우리가 사용 하는 웹 애플 리 케이 션 Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 200-250 bp의 Amplicons 연쇄 반응 (PCR)에 대 한 이상적인 Umi 통합 되었습니다 일단이 것으로, 150 bp 쌍 간 읽기와 쌍 간 읽기 중복 생성. 사용 될 최적의 뇌관 디자인 조건: 최소 뇌관 크기 = 19; 최적의 뇌관 크기 = 25; 최대 뇌관 크기 = 30; 최소 Tm = 64 ° C; 최적의 Tm = 70 ° C; 최대 Tm = 74 ° C; 최대 Tm 차이 = 5 ° C; 최소 GC 내용 = 45; 최대 GC 내용 = 80; 반환 번호 = 20; 최대 3' 끝 안정성 = 100.
방법 2에서 우리가 ECS DNA 프로토콜 클론 SNVs 및 작은 Indels 희귀 0.0001 VAF amplicons의 수백을 포함 하는 상업적으로 이용 가능한 유전자 패널을 사용 하 여 조사를 Illumina 화학 결합 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 우리의 실험에 대 한 TruSight 골수성 시퀀싱 패널 (Illumina)를 사용 하 고 소아 골수성 질환에 대 한 관심의 추가 유전자를 포함 하는 확장 된 패널을 설계. 이러한 패널 팬 들은 그래서 우리 자신의 어댑터 전략이이 패널에 추가 했습니다 오류 정정을 촉진 것이 독특한 분자 식별자 (Umi)의 정보를 제공 하지는. ECS 작동 한다 다른 질병와 관련 된 유전자에 대 한 풍부 하 게 설계 된 다른 패널의 동등 하 게 잘. DNA 분리 및 조직 또는 관심의 샘플에서 후속 정량화, 다음 것이 좋습니다 적어도 500 재고 DNA 견본 당 ng. 우리는 정기적으로 250를 사용 하 여 단일 시퀀싱 라이브러리 확인 중복 및 VAF 계산으로 가능한 한 많은 독특한 게놈 단편으로 하류 캡처하기 위해 DNA의 ng 읽습니다. 선택적 복제 시퀀싱 라이브러리 나머지 250으로 만들어질 수 있다 DNA의 ng. 우리는 항상 표본, 당 2 개의 복제 라이브러리 만들고 참 긍정으로 둘 다 복제에 독립적으로 검색 하는 이벤트에만 생각. 우리는 또한4,13전화 이체의 정확도를 높이 genomic 위치 특정 이항 오류 모델 구현.
마지막으로,는 상용 QIAseq 대상 RNA 패널 (Qiagen)를 사용 하 여 사본 정량화에 대 한 RNA 시퀀싱에 ECS를 연결 하는 방법에 설명 합니다. 중복에는 Umi 필요한 오류 수정 키트에 통합 되었습니다 및 연구원은 제조 업체의 권장 사항에 따라 라이브러리를 만들 수 있습니다. Bioinformatically, 연구자는 ECS-DNA, 프로토콜 섹션에서 자세히 설명 될 것 이다를 위한 파이프라인을 따를 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI i5 adapter sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7442S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7595S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie 2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

기존의 차세대 시퀀싱 기술 (NGS) 10 년 이상에 대 한 거 대 한 게놈 특성에 대 한 수 있다. 특히, NGS 악성에 클론 돌연변이의 스펙트럼을 분석 하 사용 되었습니다. 비록 전통적인 Sanger 방법, 식별 하는 ~0.5–2.0 %의 그것의 높은 에러율으로 인해 드문 클론와 subclonal 돌연변이와 NGS 투쟁 보다 훨씬 더 효율적. 따라서, 표준 NGS는 돌연변이 대 한 검색의 제한이 > 0.02 변형 대립 유전자 분수 (VAF). 이 환자에서 희소 한 돌연변이 대 한 임상 중요성 동안 알려진된 질병 불분명, 남아 없이 백혈병 치료 하는 환자 크게 향상 결과 잔여 질병 때 < 0.0001 cytometry에 의해. NGS의이 artefactual 배경, 완화 하기 위해 수많은 방법이 개발 되었습니다. 여기 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱 (ECS), 개별 분자 임의의 인덱스 오류 수정에 대 한 혈압의 16와 다중화 8 혈압 환자 특정 인덱스를 태그를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 감지 하 고 변형 대립 유전자 분수 (VAFs) 두 배나 NGS의 검출 한계 보다 낮은 희귀 0.0001 VAF에 클론 변이 추적할 수 있습니다.

Targeted Error-Corrected dna 시퀀싱, 함께 우리는 돌연변이 환자 상업 genomic DNA에 DNA를 diluting 원리 실험의 증거를 수행 했습니다. 환자 GATA1 돌연변이 했다 (chrX:48650264, C > G) 0.19의 원래 VAF와. ECS 단일 뉴클레오티드 변종 1:10,000의 수준으로 양적은 그림 1 에서 설명 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> 그림 1: GATA1 SNV 보여주는 ECS 1:10,000의 수준으로 양적은 희석 시리즈. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
우리는 또한 ECS DNA 안정적으로 성인 급성 골수성 백혈병 (AML) 건강 한 노인 개인4에 recurrently 유전자에 드문 클론 변이 감지 하는지 보여준다. 우리는 간호사의 건강 연구 틀 약 떨어져 ~ 10 년에서에서 20 건강 한 개인에서 버 피 코트 샘플을 얻었다. 우리는이 샘플에 ECS-DNA 패널 프로토콜을 적용. 이 실험에 대 한 우리 Illumina TruSight 골수성 시퀀싱 패널 568 amplicons (자세한 내용은 https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html에 유전자 목록에) 구성 된 적응 및 시퀀싱 20 개인에서 80 라이브러리 (다른 시간 지점에서 2 컬렉션, 시간 당 개인 당 2 복제 지점) 47.7 백만 쌍 간 읽기의 평균 및 오류를 수정 하는 3.4 백만의 평균을 생성 Illumina NextSeq 플랫폼을 사용 하 여 도서관4당 합의 시퀀스입니다. 라이브러리 당 평균 뉴클레오티드 커버리지 (3.4 수백만 568로 나눈 값) x 6000 대략 이었다. 각 샘플에 대 한 우리는 동일한 샘플에서 되지 않은 시퀀스 된 라이브러리를 사용 하 여 위치 특정 오류 프로필을 건설 한다. 우리는 하나 이상의 컬렉션 시간 지점의 두 복제에 109 클론 체세포 돌연변이 발견. 이러한 돌연변이 VAF 0.0003-0.1451에서 배열 있다. 우리가 알려진된 우주 표현으로 21 돌연변이 선택 하 고 하나 또는 두 개의 컬렉션 시간 포인트 ddPCR를 사용 하 여 모든 21 돌연변이 확인 (n = 34, 그림 2, 젊은 외. 20164에서 적응).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> 그림 2: ECS로 식별 하는 돌연변이 매우 조화 된 VAFs와 ddPCR를 통해 확인 했다. (n = 34, 젊은 외. 20164수정). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
ECS RNA 프로토콜을 사용 하 여 오류 수정 식 수준에 관하여 우리 다양 한 암 (QIAseq 인간의 암 Transcriptome 패널에서 적응), 그리고 우리와 관련 된 것으로 알려진 416 유전자의 구성 된 QIAseq 화학을 사용 하 여 유전자 패널 사용자 정의 ( 보충 자료1에서 유전자 목록) 주어진된 유전자의 가장 일반적으로 표현한 exon 증폭. 우리 쌍 간 형식 라이브러리, 당 8.3 백만 읽기의 평균을 준 Illumina MiSeq 플랫폼을 사용 하 여 라이브러리를 시퀀싱 그리고 우리 0.417 백만 오류 수정 합의 시퀀스의 평균을 잡으려고 관리. 우리 식 수준 낮은 풍부한 사본 보여주었다 (< 50에서 1000 사본 수 총 RNA의 ng) 복제 사이 높은 재현성은 (데이터 요소 n = 300, 그림 3). DdPCR (식의 다양 한 정도의 6 선택 된 유전자)에 의해 유효성 검사 유전자의 식 수준 올바르게 정규화에 대 한 필요 없이 ECS 프로토콜에 의해 점령 되었습니다 했다 설명 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> 그림 3: 상단, 대 본의 상관 관계 계산 ECS RNA에 의해 동일한 샘플의 복제 사이 (n = 300). 하단, ECS로 식별 하는 건의 했다 ddPCR에 의해 확인 하는 사본 (n = 6). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K 조회수.  Washington University School of Medicine. 차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...