이 간행물에 의해 되었습니다 (C. Fritsch) 그랜트 T32ES019851에서에서 자금, R01AG054641, 그리고 멀리 젊은 조사자 부여 (M. Vermulst).

<ol>
	<li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation.">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li><li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II.">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li><li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fidelity+of+transcription:+RPB1+(RPO21)+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae.">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li><li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity.">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).</li><li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells.">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484 (2017).</li><li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors.">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li><li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells.">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li><li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli.">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li><li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage:+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis.">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li><li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells.">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li><li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan.">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065 (2015).</li><li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RNA:+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer's+disease.">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li><li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer's+and+Down+patients.">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li><li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance.">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li><li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants.">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li><li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses.">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li><li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA:DNA+Hybrid+Complementarity.">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+Removes+Adapter+Sequences+From+High-Throughput+Sequencing+Reads.">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Kent, W. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli.">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li><li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations.">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 꼬마 선 충, 초파리 melanogaster에 Saccharomyces cerevisiae전송 오류 검출을 위한 C-seq 라이브러리의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 대체 기술 뿐만 아니라 기존 프로토콜을 통해 수많은 장점이 있습니다.
지난 15 년 동안 수많은 기자 시스템 개발 되었습니다 luciferase7,8 또는 Cre Lox 재결합3,4,15,21 전사 검색에 의존 하는 오류입니다. 이러한 기자 시스템 연구팀은 그들은 유전자, 대립, 그리고 직접 녹음의 품질을 조절 하는 식별 분자 메커니즘을 허용 하기 때문에 transcriptional 충실도의 이해에 귀중 한 되었습니다. 그러나, 그들은 보고 오류 인위적으로 손상 된 서식 파일, 또는 매우 구체적인 유전 컨텍스트 내에 그들이 대답할 수 있는 과학적인 질문을 제한 합니다. C-seq 프로토콜의 중요 한 장점은 전체 transcriptome5, 크게는 유전 정보를 표현 하는 정확도의 과학적 지식을 확대를 통해 전사의 품질 모니터링입니다. 둘째, C-seq 분석 결과 소스 자료로 RNA를 이용, 하기 때문에 그것은 가능성이이 분석 결과의 선택, 각 유전자 변형 모델에 대 한 복잡 한 기자 구문을 생성 하는 필요를 만듦으로써 모든 조직에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 기존 대규모 병렬 시퀀싱 방법17,22에 비해 장점이 있다. 가장 주목할만 하 게,이 접근의 대부분을 중 금속 조각 RNA 라이브러리의 사용. 그러나, 이러한 조각화 메서드 진정한 전사 오류5구별 되지 않는 RNA로 유물을 소개 합니다. 이 문제를 해결 하려면이 프로토콜 RNase III, 추가 이점이 그것 각자 결 찰에 대 한 호환 끝 잎이 크게 RNA circularization를 단순화 하 고 분석 결과의 감도 증가와 효소 RNA 조각 ~ 10.
같은 시간에 C-seq 분석 결과 제한의 그것의 자신의 몫이 있다. 첫째, 분석 결과 전체 게놈에 걸쳐 녹음 오류 측정, 비록 데이터의 큰 구성 요소는 녹취 록이이 유전자에서 RNA 라이브러리 대부분을 지배 하는 경향이 높게 표현 되는 유전자에서 파생 될 경향이 있다. 또 다른 요인은 매우 표현된 유전자 쪽으로 분석을 왜곡 하는 유전 돌연변이 및 최종 측정을 혼동에서 이벤트를 편집 하는 RNA 방지 바이오 informatic 파이프라인에 내장 된 임계값입니다. 이 임계값 지시만 기지를 20 번 이상 시퀀싱 된 최종 분석에 사용할 수 있습니다. 두 번째 제한 라이브러리 다양성을 염려 한다. RNA 추출에 사용 된 대부분의 키트 처럼 여기 사용 키트 않습니다 하지 효율적으로 정화 작은 RNA 분자, RNAP III에 의해 합성 분자에서 파생 된 읽기 수를 제한 하. 최종 시퀀싱 라이브러리의 다양성 여기 고용 mRNA 정화 단계에 의해 더 제한 됩니다. RNAP 효율적으로 수에 의해 생성 된 분자 시퀀스, 나머지 미토 콘 드 리아 RNAs의 대부분 비록 tRNAs, 및 비 코딩 RNAs 동안 손실 됩니다이 단계. 이러한 분자 더 잡으려고 자주, 특히 작은 RNA 분자를 정화 다른 키트를 사용 해야 합니다, 또는 셀이이 분자에 대 한 풍성 하 게 하는 대상 한다. 하지만, 둘 다 이러한 솔루션의 조사에 의해 더 큰 금융 투자 필요 합니다 있지만 이러한 문제는 대부분의 시퀀싱, 평소 보다 더 깊이 또는 동시에 동일한 세포에서 DNA 시퀀싱에 의해 해결 될 수 있습니다 note 하십시오.
또한, 미래 기술 개발은 근본적인 수준에서 C-seq 분석 결과 향상 시킬 태세 이다. 예를 들어 기존 시퀀싱 기술의 읽기 길이 확장 하 여 그것은 가능 합니다 시퀀스 더 긴 분자, 즉 더 많은 반복 전사의 충실도 확인을 사용할 수 있습니다. 이러한 개선 큰 시퀀싱 깊이 다운스트림 분석에 사용할 수 있는 읽기의 비율에서 증가 자동으로 발생 합니다. 병렬에서 시퀀스를 더 많은 분자에 대 한 있도록 모든 시퀀싱 기술에 대 한 비슷한 논쟁을 만들 수 있습니다. 또한, C-seq 분석 결과의 많은 구성 요소, 최적화 크기 선택의 엄중 circularization RNA, 자체 분석 결과의 시간이 자연의 효율성 등 남아 있습니다. 마지막으로, 모든 사용자가 핵 산 분석 및 잠재적인 문제 해결 ( 재료의 표참조)에 대 한 높은 감도 전용된 도구에 대 한 액세스를 얻을 하는 것이 좋습니다. 이 도구 없이 어떤 시점에서 잠재적인 문제가 발생, 그로 인하여 그들 해결 하기 위해 불가능 한 만드는 결정 하기 매우 어려운 수 있습니다.
전체 프로토콜은 상당히 용 서 (작은 실수는 중요 한 결과가지고 하는 경향이), C-seq 분석 결과의 성공에 절대적으로 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 가장 중요 한 요구 사항 중 하나는 격리 된 RNA 최대한 부드럽게 처리 됩니다. 대부분 RNA 추출 방법 및 다운스트림 처리 키트는 가장 분자 분석에 대 한 충분 한 산업 표준 넘어 RNA의 화학 성분에 대 한 작은 신경. 그러나, C-seq 분석 결과 크게 증가 하는 분자 스트레스를 줄이기 위해 필요 WT 기지의 수천의 수백 중 단일 전송 오류 식별 임무가 주어입니다. 스트레스만 1에서 10000 기지에 영향을 주는 아티팩트를 완전히 무효화 결과 발생할 수 있습니다. 예를 들어 사용자가 해야 합니다 결코 방지/제한 폭로 RNA 어떤 온도 이상 65 ° c. 둘째, 각 사용자는 RNase III와 RNA 조각에 필요한 시간을 최적화 신중 하 게 해야 합니다. 그것은 마지막 분자는 길이 약 60-80 기초 분석 결과의 성공에 대 한 절대적으로 중요 합니다. 더 짧은 분자는 게놈 지도 하기 어려울 수 있습니다 그리고 더 긴 분자 250 bp 읽기 내 시퀀싱을 3 독립적인 반복에 대 한 허용 하지 않습니다. 마지막으로, 되지 동결 하 고 한 번 이상 전체 프로토콜 동안 RNA를 녹여는 것이 좋습니다. 대신, RNA를 분리 하 고 하루에는 cDNA를 합성. 시간과 노력이이 약속, 자체 프로토콜의 복잡성과 자주 한 번에 처리 되는 샘플 수와 관련된, 두 수 사관 이러한 라이브러리를 생성 하기 위해 함께 일할 것이 좋습니다.
성공 하면 이러한 실험 가능한 정확 하 게 어떤 실험 조건 하에서 모든 유기 체에 있는 전사 오류를 검색 하 게 됩니다. 예를 들어 제어 및 다른 병에 걸린 개인 비교, 그것은 특정 질병 관련 된 수많은 인간의 병 리의 병의 새로운 구성 요소를 드러낼 수 있는 전사 오류 인지 확인 하기 위해 가능 할지도 모른다. 탐색할 수 있는 다른 매개 변수는 organismal 노화, 영양, 유전자, 및 독성 화학 물질 노출 등 환경 요인. 또한,이 분석 결과 transcriptome 통해 전송 오류 감지, 때문에 그것은 연구원 I, II, 및 III,으로 미토 콘 드 리아 RNA 중 합 효소 RNA 중 합 효소의 품질에 기여 하는 다른 메커니즘을 해 부를 허용할 것 이다. 따라서, 우리는이 프로토콜 mutagenesis 광범위 한 실험, 돌연변이 DNA 보다는 RNA의 연구에 의해 특징의 새로운 분야를 열 것입니다 기대 합니다.

게놈 생명의 정확한 생물학 청사진을 제공합니다. 이 청사진을 제대로 구현 하기 좋은 정밀도로 변하게 하는 게놈에 대 한 중요 하다. 그러나, 전사 무료 오류일 가능성이 크다. 예를 들어 RNA polymerases 오류가 시험관에1,2, 하 긴 알려져 있다 그리고 최근에 그들은 오류에서 vivo에서 뿐만 아니라3,,56, 커밋 보였다 DNA에 직면 하는 경우에 특히7,8,,910손상. 함께 찍은, 이러한 관측은 필 사 오류가 발생 지속적으로 모든 살아있는 세포에서 그들은 돌연변이 단백질의 강력한 원천이 될 수 있는 제안 나타냅니다.
Transcriptional mutagenesis 되 나,이 과정에서 두 가지 방법으로 고전 mutagenesis 다릅니다. 첫째, 유전자 변이, 달리 전사 오류 영향을 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포로 DNA 복제에 의존 하지 않는. 전사의 품질에 영향을 주는 메커니즘을 공부 mitotic 그리고 포스트 mitotic 세포의 돌연변이 부하에 대 한 값진 통찰력 제공 따라서. 흥미롭게도, 전사 오류 최근 단백질 집계11,,1213 의 승진에 연루 되어 고 모두 발암10 에 기여할 가설과 항생제 저항 박테리아14의 개발.
둘째, 유전자 변이, 달리 필 사 오류는 자연에 과도. 그들의 임시 존재 하기 때문에 전송 오류 검출 하기 상당히 어려운 특히 도전 이다. 예를 들어 여러 실험실 transcriptional mutagenesis 연구에 대 한 귀중 한 기자가 분석 실험을 고안 했다, 하는 동안 이러한 분석 전사 오류 컨텍스트 및 모델 생물4,15의 한정된 된 수에서 측정 수만 있습니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 많은 연구 자들은 RNA 시퀀싱 기술 (RNA-seq), 이론적으로 모든 종의 transcriptome 걸쳐 기록 전사 오류를 수 있는 게 아닙니다. 그러나, 이러한 연구는 반전 녹음 방송 오류, PCR 증폭 오류 등 자체 시퀀싱의 오류가 자연 도서관 건축 유물에 의해 쉽게 혼동 된다. 예를 들어 역 transcriptases 커밋 약 한 오류 모든 ~ 20000 기지 동안 RNA polymerases (RNAPs) 하나의 실수 모든 300000 기지5,6것으로 예상 된다. 반전 녹음 방송 혼자의 오류율 난쟁이 셀 안에 RNA polymerases의 오류율, 때문에 그것은 전통적인 RNA-Seq 데이터 ( 라이브러리 준비로 인 한 유물에서 진정한 전사 오류를 구별 하는 것이 사실상 불가능 그림 1a).
이 문제를 해결 하려면 우리는 최적화 된 버전 원-시퀀싱 (Cirseq, 또는 C-seq 이제)의 분석 결과5,16을 개발 했다. 이 분석 결과 사용자를 transcriptome5전체 RNA에 전사 오류 및 다른 희소 한 이체를 감지 수 있습니다. 원형-시퀀싱 분석 결과이 분석 결과에 중요 한 단계 주위에 회귀 한다 RNA circularization 때문에이 이름을 수행 합니다. 일단 RNA 대상 circularized는, 그들은 역 같은 RNA 서식 파일의 여러 복사본을 포함 하는 선형 cDNA 분자를 생산 하는 롤링 원 패션에 복사할. 이러한 서식 파일 중 하나에 오류가 있었다면,이 오류 cDNA 분자 내에 포함 된 모든 단일 반복에 것도. 대조적으로, 반전 녹음 방송, PCR 확대, 또는 시퀀싱 오류 무작위로 발생 하는 경향이 하 고 따라서 단 하나 또는 두 개의 반복에 있을 것입니다. 따라서, 각 cDNA 분자에 대 한 합의 시퀀스를 생성 하 여 모든 반복에서 발생 하는 오류에서 임의의 오류를 구별 도서관 건축 유물 효과적으로 진정한 전사 오류 (그림 1b)에서 분리 수 있습니다.
C-seq 분석 결과 정확 하 게 어떤 종의 transcriptome 통해 RNA의 기본 대체, 삽입 및 삭제의 속도 감지를 사용할 수 있는 적절 하 게 사용 하는 경우 (예를 들어 트래버스 및 Ochman17참조). 예, 우리는 C-seq 분석 결과를 사용 단일 기본 해상도5 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 그리고 꼬마 선 충 에서 전사의 오류율의 게놈 넓은 측정을 제공 (관찰 되지 않은). 원래 정확 하 게 RNA 바이러스 인구의 시퀀싱 하는 데 사용, C-seq 분석 결과의 최적화 된 버전이 도서관 건축 유물을 라이브러리 준비 하는 동안 가혹한 조건을 최소화 하기 위해 간소화 되었습니다. 또한, 다양 한 상용 키트를 사용 하 여 분석 결과의 처리량은 크게 개선, 자사의 사용자 뿐만 아니라. 적절 하 게 사용 하는 경우이 분석 결과 정확 하 게 수천 복제, 이전 연구6에 그로 인하여 크게 개선 전송 오류를 검색할 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 transcriptional mutagenesis 연구 하는 강력한 도구 이며 사용자 생물의 넓은 범위에서 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RiboPure RNA purification kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1926</td>
			<td>Total RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genelute mRNA purification kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MRN70-1KT</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Elution and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNase III</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2290</td>
			<td>RNA fragmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204S</td>
			<td>RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Rolling circle reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18427013</td>
			<td>Rolling circle reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamers (50 ng/&#181;l)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N8080127</td>
			<td>Rolling circle reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Second Strand Synthesis Module</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6111S</td>
			<td>Second Strand Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7370S</td>
			<td>cDNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next index primers</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7335S</td>
			<td>Multiplex PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>Clean up of RNA and DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic bead purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic bead purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 Microcentrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCU-Shaker 10L</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H1010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Medium to High temperature cycling conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-200 Thermal Cycler</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8252-30-0001&#160;</td>
			<td>Low temperature cycling conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular Bioproducts</td>
			<td>700S-11</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td>Nuclease-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td>Nuclease-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Nuclease-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 Tapestation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA Screen Tape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td>Quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ScreenTape Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5577</td>
			<td>Quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ScreenTape Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5578</td>
			<td>Quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Double stranded DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Quality control for double stranded cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0244</td>
			<td>Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>Determination of RNA concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide surveillance of transcription errors in eukaryotic organisms

정확한 전사는 유전 정보의 충실 한 식에 대 한 필요 합니다. 놀랍게도 하지만, 약간 녹음의 품질을 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 과학적 지식에이 격차를 채우기 위해 우리는 최근 Saccharomyces cerevisiae, 초파리 melanogaster, 및 꼬마 transcriptome 걸쳐 전사 오류를 감지 하 원-시퀀싱 분석 결과 최적화 선 충. 이 프로토콜은 전사 오류 진 핵 세포에서의 전사의 품질을 제어 하는 메커니즘 전례 없는 자세히 해명 될 수 있도록 지도 하는 강력한 새로운 도구와 연구를 제공할 것입니다.

모든 대규모 병렬 시퀀싱 방법 처럼 각 C-seq 실험 다루기, 큰 데이터 집합을 생성합니다. 처음 사용자를 위해 어려울 수 있습니다; 이러한 데이터 세트를 처리 하기 위해 따라서, 모든 사용자는 실험 전에 경험된 바이오-informatician 문의 하는 것이 좋습니다. 평균, 기대는 사용자 대부분 대규모 병렬 시퀀싱 플랫폼에서 실행 당의 55-70 기가 기지 (Gbases) 약을 생성 합니다. 이 프로토콜에 대 한 일반적으로 12-30 샘플 했다 다중화 실행 당 각 샘플에 대 한 약 2-6 Gbases 인수 했다 그래야. 어댑터 시퀀스와이 데이터 집합에서 낮은 품질 기본 호출 (< 20) 트리밍, 후 ~ 70% 초기 데이터 크기의 남아 있었다.
이 기지는 다음 생성 된 반복의 크기를 결정 하 여 RNA 조각화 및 circularization의 효율성 조사 추가 분석 했다. 대부분 반복 길이 (그림 4A) 45-80 기지 경향이 있고 시퀀싱 했다 기지의 약 50% (그림 4B) 이러한 반복의 일부입니다. 이 기지의 대부분은 포함 하는 읽기에 3 반복 또는 더, 시퀀싱 되 독특한 기지 수 이므로 시퀀싱 기지의 총 수의 약 1 / 3. 평균, > 이러한 합의 시퀀스의 75% 참조 게놈에 다시 매핑할 수 있습니다. 마지막으로,이 기지의 약 25%는 적용 20 읽기 또는 더, 궁극적으로 오류 검출 데이터의 약 10%를 사용할 수 있음을 의미. 이 분석의 예는 그림 4, 비교적 얕게 시퀀싱은 낮은 나타냅니다는 단일 C-seq 라이브러리의 1 복제에 대 한이 프로토콜의 설정 기간 동안 취득 된 시퀀싱 정보를 나타내는에 주어 집니다. 사용자 확보를 기대할 수 있는 데이터의 제한입니다.
이 숫자 자체 오류 비율에 따라 크게 다를 수 있지만 실행 당 약 5000-25000 오류 확인 될 하는 경향이 (높은 오류율 더 많은 오류가 검색 될 것입니다)는 transcriptome의 크기 (큰에 transcriptome, 적은 기지 20 읽기, 시퀀싱 데이터 오류 검출을 위해 사용 될 수 있는 제한에 의해 보호 됩니다), 그리고 깊이는 시퀀스 (깊은 시퀀싱 만들 것입니다 그것은 더 가능성이 주어진된 자료 20 읽기 이상 적용 됩니다). 되도록 평균 오류 ~ 47 %mRNA 분자 RNA 중 합 효소 II (RNAP II) ~ 49%에 의해 생성 된 rRNA 분자, 그리고 나머지 3%는 RNAs에 있습니다 RNAP에 의해 생성 된에 있는에 전체 게놈, 분산 하는 경향이 있다 이러한 오류 RNAP III와 미토 콘 드리 아 RNA 중 합 효소에 의해 생성. 그러나,이 비율 셀 형식 또는 조사 (그림 4C) 유기 체에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 예를 들어 cardiomyocytes, 같은 미토 콘 드리 아 기능에 크게 의존 하는 세포 종류에는 크게 증가 하는 시퀀스는 미토 콘 드 리아 RNA 분자의 수 그리고 이렇게 수 다른 세포 유형 보다 훨씬 더 미토 콘 드 리아 RNA 오류 감지.
오류 목록을 컴파일 되었습니다 일단 게놈에서 그들의 위치 알려져 있다 이러한 오류는 각 유기 체에 전사의 오류 속도 제어 하는 매개 변수를 식별 하 사용할 수 있습니다. 예를 들어 이러한 전사 오류의 위치 수와 상관 될는 게놈의 수많은 기능 같은 DNA의 반복, 특정 유전 문맥, 또는 식 속도 이러한 기능의 충실도 변경 하는 방법을 이해 하 전사5. 기대는 미래에, 하지만, 사용자 수 있을 것입니다 어떻게 수많은 추가 기능에 영향을 미칠 transcriptional 충실도, epigenetic 마커, 게놈, 양분 가용성, 나이, 또는 독성에 노출의 3 차원 조직을 포함 하 여 결정 하는 전사의 충실도에 유전과 환경 요인의 기여를 명료 하 게 하는 화합물
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig1.jpg"> 그림 1: RNA-seq 대 C 시퀀스의 도식 표현 (A) 전통적인 RNA-seq 실험 격리 RNA의 관심, 샘플에서 RNA, 그리고 역 최종 라이브러리 준비 및 시퀀싱 전에 그것을 녹음. 그러나, 이러한 준비 절차 반전 녹음 방송 오류, PCR 증폭 오류 및 시퀀싱 오류 형태로 라이브러리에 수많은 기술 유물을 소개합니다. (B)이 최적화 된 C-seq 분석 결과 이러한 기술 유물의 교정 반전 녹음 방송, 그들을 역방향 선형 생산 롤링 원 패션에 복사할 수 있는 전에 조각난된 RNA 분자를 circularizing으로 허용 cDNA 분자에에서 원래 RNA 서식 파일의 여러 복사본을 포함 하는 반복 합니다. 이러한 탠덤 반복 사용할 수 있습니다 유물, 진정한 전사 오류를 구별 유물 같은 역 전송 오류 (사각형) 및 PCR 반면 진정한 전사 오류 (스타) 동일한 위치에서 모든 반복에 있을 것입니다. 증폭 오류 (원) 어떤 주어진된 cDNA 분자의 하나 또는 두 개의 반복에만 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig2.jpg"> 그림 2: 대표 도서관 준비에 대 한 결과. (A) 높은 감도 RNA 화면 테이프 electrophoretogram 사다리 ( 재료의 표참조), (B) 총 RNA Saccharomyces cerevisiae에서 정화, (C) RNase III 조각화 RNA, 및 (이러한 패널 표시 D) 롤링 리버스 복사할 cDNA 일주. (E) 최종 크기 선택 cDNA 라이브러리 실행에 높은 감도 이중 가닥 DNA 분석 칩 ( 재료의 표참조). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig3.jpg"> 그림 3: 원 시퀀싱 데이터를 분석 하는 데 사용 하는 바이오 informatic 파이프라인의 도식. 후 연속 읽기 트리밍, 반복 확인 하 고 합의 시퀀스 가능성이 가장 높은 기본 호출을 사용 하 여 지정된 된 위치에 생성 됩니다. 다음, 초기 RNA 서식 파일의 결 찰 지점 식별 되 고 필 사 오류를 식별할 수 있도록 일치 시퀀스 참조 게놈에 정렬 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig4.jpg"> 그림 4: C-Seq 파이프라인에 대 한 결과의 예. (A)이이 패널 표시 합의 시퀀스의 크기 분포는 전형적인 C-Seq 실험에서 얻은 합니다. (B)이이 패널 기지, 읽기 및 읽기 C-Seq 생물 정보학 파이프라인의 각 단계에서 시퀀싱의 백분율의 수를 나타냅니다. (C)이이 패널 검색 전송 오류 수를 표시 하 고 오류 비율, RNA 중 합 효소 II, RNA 중 합 효소 3 세, 그리고 미토 콘 드리 아 RNA 중 합 효소 RNA 중 합 효소에 기인. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

genome-wide-surveillance-transcription-errors-eukaryotic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K 조회수.  Children's Hospital of Philadelphia. 이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

비디오: Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

연구

유전학

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative transcriptomics. It also serves as a primer for biologists to develop data scientist computational skills, e.g. executing bash commands, visualization and management of large data sets. All command line code and further explanations of each command or step can be found on the wiki (<a href="https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ">https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ</a>). The Discovery Environment and Atmosphere platforms are connected together through the CyVerse Data Store. As such, once the initial raw sequencing data has been uploaded there is no more need to transfer large data files over an Internet connection, minimizing the amount of time needed to conduct analyses. This protocol is designed to analyze only two experimental treatments or conditions. Differential gene expression analysis is conducted through pairwise comparisons, and will not be suitable to test multiple factors. This workflow is also designed to be manual rather than automated. Each step must be executed and investigated by the user, yielding a better understanding of data and analytical outputs, and therefore better results for the user. Once complete, this protocol will yield de novo assembled transcriptome(s) for underserved (non-model) organisms without the need to map to previously assembled reference genomes (which are usually not available in underserved organism). These de novo transcriptomes are further used in pairwise differential gene expression analysis to investigate genes differing between two experimental conditions. Differentially expressed genes are then functionally annotated to understand the genetic response organisms have to experimental conditions. In total, the data derived from this protocol is used to test hypotheses about biological responses of underserved organisms.

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

This protocol outlines a comparative de novo transcriptome assembly and annotation workflow for novice bioinformaticians. The workflow is available for free entirely through CyVerse and connected by the Data Store. Command line and graphical user interfaces are used, but all code needed is available to copy and paste.

CyVerse 리소스 활용<em&gt; 드 노보</em&gt; 비포장 (비 모델) 생물의 비교 전이학

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here is a powerful experimental approach for analyzing the transcription termination defect under physiological conditions. Like the traditional TRO assay, it relies on the presence of a transcriptionally active polymerase beyond the 3&#8242; end of the gene as an indicator of a transcription termination defect1. It overcomes two major problems encountered with the traditional TRO assay. First, it can detect if the polymerase reading through the termination signal is the one that initiated transcription from the promoter-proximal region, or if it is simply representing a pervasively transcribing polymerase that initiated non-specifically from somewhere in the body or the 3&#8242; end of the gene. Secondly, it can distinguish if the transcriptionally active polymerase signal beyond the terminator region is truly the readthrough sense mRNA transcribing polymerase or a terminator-initiated non-coding anti-sense RNA signal. Briefly, the protocol involves permeabilizing the exponentially growing yeast cells, allowing the transcripts that initiated in vivo to elongate in the presence of the BrUTP nucleotide, purifying BrUTP-labelled RNA by the affinity approach, reverse transcribing the purified nascent RNA and amplifying the cDNA using strand-specific primers flanking the promoter and the terminator regions of the gene2.

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

BrUTP 가닥 특정 전사 런타임에 (TRO) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...