우리는 다니엘 첸에서 디지털 영상 제작 팀의 벅 홀 고등학교 동영상 편집에 감사 합니다. Stomatal 가드 셀 proteomics, metabolomics 첸 실험실에서에이 연구는 미국 국립 과학 재단 (0818051, 1158000 및 1412547)에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다. Wenwen 홍콩 중국 장학금 위원회에 의해 지원 됩니다. 박사 Qiuying Pang 중국 장학금 위원회 국가 자연 과학 재단의 중국 (31570396)에 의해 지원 됩니다.

1. 성장 하는 식물
<ol><li>Potting 혼합물에 씨를 출 아 할. 식물 성장 성장 챔버에 140 µmol 광자 m−2의 − 1 의 광도와 22 ° C 및 16 h 8 h 조명의 photoperiod 어두운 18 ° C에서 2 주 동안.</li>
	<li>4"직경 남 비는 토양을 포함으로 개별적으로 비슷한 크기의 묘를 이식 하 고 성장 단계 1.1에서에서 설명 하는 추가 동일한 조건에서 3 주. 참고: 습 한 토양을 유지 하는 일주일에 두 번 수돗물 식물 물.</li>
</ol>2입니다. 풍부한 Stomata의 준비
<ol><li>메스와 개별 5 주 된 A. thaliana 식물의 잎을 제거 합니다.</li>
	<li>원피스 abaxial (아래) 쪽으로 준수와 준수는 잎의 adaxial (위) 쪽으로 다른 조각 각 잎 투명 스카치 테이프의 두 가지를 연결 합니다. 5 잎에 테이프를 두고 s.</li>
	<li>부드러운 껍질 떨어져 포장과 가드 세포 mesophyll 세포를 가진 adaxial 측 abaxial 측을 분리 각 손에 집게 손가락 및 엄지를 사용 하는 테이프의 두 가지.</li>
	<li>장소 여 stomata의 60 mL에 나뭇잎의 abaxial 측면에서 껍질 40 m m × 12 m m 크기 페 트리 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2 1 m 코 조정) 버퍼링은 수집 된 요리.<ol>
<li>모든 샘플 껍질 수집 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.1 단계에 명시 된 빛 조건에서 성장 챔버에 껍질을 포함 하는 배양 접시를 놓습니다. Stomata를 완전히 여 2 h에 대 한 빛 아래 껍질을 남겨 주세요.</li>
	<li>장소는 150 m m x 20 m m 소화 효소 혼합물 (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0.1% (w/v) polyvinylpyrrolidone-40, 및 0.25% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 55% 기본 솔루션 (0.55 M sorbitol, 0.5 m m에서에서 세포 벽의 50 mL를 포함 하는 배양 접시에 껍질 CaCl2, 0.5 m m MgCl2, 0.5 m m 의약품, 10 µ M KH2포4, 5 mM 4 morpholineethanesulfonic 산 (MES) pH 5.7에서 1 m 코 조정).</li>
	<li>20 분 50 rpm에서 배양 접시에 상호 통에 껍질을 흔들어.</li>
	<li>껍질에서에서 제거 효소 솔루션 핀셋으로 후 20 분 물 50 mL를 포함 하는 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 전송 합니다.</li>
	<li>15 대 한 껍질을 씻어 전송 피 펫을 사용 하 여, 모든 잔여 효소 솔루션을 제거 하는 물 10 mL로 두 번 s.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 단계 2.4에서에서 사용 되는 버퍼를 열고 신선한 stomata의 50 mL와 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 배치. 1 h 단계 복구 stomata 있도록 1.1에서에서 명시 된 조명 조건에 대 한 품 어.</li>
</ol>3. Abscisic 산 (ABA) 치료 및 Stomata 움직임 분석 결과
<ol><li>150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 15 분 stomatal 개통 버퍼의 50 mL 또는 stomatal 개통 버퍼의 적절 한 치료 시간이 10 µ M ABA의 최종 농도 50 mL 30 ° C에서 풍부한 stomata 껍질을 품 어.</li>
	<li>5, 15, 30 분 동안 50 rpm에서 통에 껍질을 놓습니다. 각 시간 간격 후 핀셋으로 껍질을 제거 하 고 단계 3.3 이미징 단계를 따릅니다.</li>
	<li>가벼운 현미경으로 ABA 치료 후 stomata ABA 치료 전과 다양 한 시간 점에서 이미지를 받아.<ol>
<li>껍질을가지고 고 유리 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.</li>
		<li>슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 무대를 조정 하는 껍질의 이미지를 시각화할 수 있습니다.</li>
		<li>벌금을 조정 하 고 가드 셀의 깨끗 한 이미지를 현미경에 집중 코스.</li>
		<li>40 X 확대에서 여러 stomata의 여러 이미지를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 stomatal apertures ImageJ8를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>표준 오류 및 p-값 < 0.05 60 stomatal 조리개 측정의 의미를 계산 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 추출 및 SDS 페이지 분리
<ol><li>15 대 한 껍질을 갈아 냉장된 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 껍질을 충당 하기 위해 충분 한 액체 질소에 s.</li>
	<li>50 껍질 당 포화 트리 스 페 놀 (pH 8.8)의 3 개 mL를 추가 및 3 mL 단백질 추출 버퍼 (자당 0.9 M, 0.1 M Tris HCl, 0.01 M EDTA, 0.4 %2-Mercaptoethanol, 1mm 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물의 10 µ L) 박격포를 피 펫을 다음 5 addi의 껍질을 갈아 증기 두건에서 tional 분입니다.</li>
	<li>추출은 피 펫을 사용 하 여 전송 하 고는 오크에 금속 핀셋을 사용 하 여 껍질 원심 관 50 rpm에서 1 h 4 ° c.에 대 한 통에 선동</li>
	<li>오크 릿지 원심 분리기 튜브에서 껍질을 제거 하 고 원심 10 분 동안 5000 x g에서 추출. 다음 전송 최고 페 놀 단계는 피 펫을 사용 하 여 새로운 깨끗 한 마이크로 원심 튜브.</li>
	<li>침전은 페 놀 100% 메탄올에 얼음 처럼 차가운 0.1 M 염화 아세테이트의 5 볼륨을 추가 하 여 단백질을 추출. 짧게 소용돌이 하룻밤-20 ° c.에 품 어</li>
	<li>20 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 centrifuge, 천천히는 튜브 붓는 여는 상쾌한 가만히 따르다 고 튜브에 단백질 펠 릿을 유지 합니다.</li>
	<li>메탄올에 0.1 M 염화 아세테이트로 두 번 단백질 펠 릿을 세척 그리고 두 번 80% 아세톤과 함께 한 번 100% 찬 아세톤. 참고: 세척 단백질의 튜브에 지정 된 시 약의 10 mL를 추가 하 여 수행 됩니다. 5 분, 10 분 동안 4 ° C에서 15000 x g에서 원심 분리 뒤 50 rpm에서 통에 교 반 하십시오. 그런 다음 튜브만 단백질 펠 릿을 유지 시 약을 붓는 다.</li>
	<li>펠 릿을 100% 찬 아세톤의 1 mL을 추가 하 고 다시 천천히 위아래로 pipetting으로 일시 중단.</li>
	<li>2 mL 마이크로 원심 관에 피 펫을 통해 단백질 정지를 전송 후 5 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 원심.</li>
	<li>튜브에서 decanting 하 여 아세톤을 제거 하 고 10 분 동안 증기 두건에서 펠 릿 건조.</li>
	<li>마이크로 원심 튜브 해산 버퍼 (8 M 요소, 0.5 %SDS, pH 8.5에서 30 mM Tris HCl)의 200 µ L에서에서 단백질 분해와 20000 x g 20 분 및 수집 새로운 튜브에 상쾌한 15 ° c에서 30 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이.</li>
	<li>다음 단백질 정량화 프로토콜9단백질 농도 계량.</li>
	<li>단백질 분리에 대 한 단백질 견본을 사용 하 여 젤 전기 이동 법 프로토콜10다음으로.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

가드 셀 모델 시스템 식물에서 신호 전달 메커니즘 연구 이며 연구에 사용 하는 샘플의 준비는 생물학 질문에 가장 적합 한 보장 하는 것이 중요 하다. 식물 연구 지역 사회 내에서 가드 셀에 증가 관심에도 불구 하 고 보편적인 메서드는 stomatal 운동 및 생리학 있도록 stomatal 가드 셀을 준비 하는 방법에 대 한 공부 분자 변화 뿐만 아니라 시스템입니다. 그들을 도전 많은 부분에서 그들의 작은 크기, 낮은 풍요와 그것을 더 많거나 적은 전체 잎에서 그들을 제거 어렵게 만들 수 있는 독특한 구조를 지정할 수 있습니다.
이 프로토콜 개발된 테이프-껍질 메서드를 사용 하 여 그들을 분리 하는 이러한 장애물을 극복 하는 방법에 대 한 방법의 제공 한다. 이 프로토콜에 표시 하는 방법 그대로 stomatal 가드 세포, 생리 적으로 자극에 응답 상태를 유지 하기 위한 방법을 제공 합니다. 이 샘플의 준비는 탠덤 질량 태그 (TMT) 또는 대 한 Isobaric 태그를 이용 하 여 양적 proteomic 연구 등 깊이 있는 proteomic 연구에 대 한 시작 물자로 역할을 수 있는 가드 세포 단백질의 추출 가능 하 게 상대 및 절대 정량 (iTRAQ)11,12. 또한,이 방법은 수 약간 수정 되며 작은 분자 대사 산물 가드 셀에서 발견 등의 연구를 가능 하 게 하도록 최적화. 여기 실험 활용 phytohormone ABA 애기, stomatal 운동 위한 elicitor 다른 치료를 적절 하 게 사용할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 다른 식물 종에.
실험 설계와이 프로토콜에 사용 되는 재료의 특성, 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 필 링 떨어져 잎 (단계 2.2)의 abaxial 및 adaxial 측면, 하는 동안 그것은 주저 없이 하 고는 abaxial 레이어 균일 제거 후 테이프의 두 조각에 동등한 부드러운 압력을 적용 하 여 이루어집니다 중요 하다. 그것은 다른 최적의 소화 시간을 있을 수 있습니다 그들은 연구에서 식물 종에 대 한 개별 필 링 기술과 소화 시간을 최적화 해야 합니다. 효소 소화 (단계 2.8-2.10), 하는 동안 껍질 밀접 하 게 감시와 있어야 3-5 분 마다 확인 합니다. 약간의 차이 껍질의 층에 더 빨리 또는 더 느리게 소화 시간 귀 착될 것 이다 때문에 이것이 중요 합니다. ABA 또는 다른 자극 (3.1 단계)와 껍질을 치료 하면 껍질 해야 될 동등 하 게 간격, 부동 하 고 그들은 결코 중복 되도록 부드럽게 흔들어. 껍질 함께 붙어 얻을 또는 중복 솔루션과 접촉의 부족으로 인해 다른 결과 얻을 수 있습니다.

Stomata 전반적인 생리학과 식물의 적합성에 중요 한 역할을 한다. 이 작은 식물 특정 구조 가드 셀으로 알려진 두 전문된 상피 세포에 의해 형성 되 고 잎의 abaxial 표면에 가장 풍부 하 게 발견 된다. Stomata가 식물 및 분위기,으로 물 증발을 통해 손실 컨트롤 사이 가스의 교환에 대 한 필요 합니다. 가드 셀 (예를 들어, 빛, 습도, 병원 체 접촉, 이산화탄소 수준) 다른 외부의 통합을 통해 stomata 조리개 조절 및 내부 (예., 내 생 호르몬) 자극1,2. 지난 20 년 동안에이 세포 유형은 식물에서 프로세스 신호 공부 셀 모델 시스템 되고있다. 이러한 셀 리프; 총 셀의 작은 분수를 만들 따라서, 그들의 독특한 휴대 조사, 생 화 학적 및 분자 속성 단일 셀 방식으로, 그것은 다른 리프 셀 종류에서 그들을 격리 하는 데 필요한. 과거, 가드 셀 연구는 자주 참여 하고있다 가드 셀 protoplasts (GCP)3,,45의 준비. 이 일반적으로 많은 양의 세포 벽 타락 효소 및 또는 혼합을 통해 기계적 장애를 사용 해야 합니다 그리고 작은 수익률 시간 일반적으로 자주 GCP 샘플을 준비 하는 데 많은 시간이 소요 비용과 시간이 많이 소요 될 입증. 더 중요 한 것은, 가드 셀 stomata 조리개를 조절 하는 완전 한 쌍으로, 행동 하기 때문에 GCP 사용 하 여 가드 셀 신호를 공부 하 고 인공 시스템으로 볼 수 있습니다.
여기, 우리는 그대로 가드 셀 풍성 하 게 하 고 자극에 생리 적인 응답을 유지 stomata를 준비 하는 방법을 개발 했습니다. 이 메서드는 mesophyll 셀 protoplasts6,7를 분리 하는 데 사용 된 방법에 의해 영감을 했다. 우리의 방법에 stomata 투명 스카치 테이프를 먼저 mesophyll 세포의 대부분을 분리 포장과 가드 셀을 포함 하는 abaxial 계층에서 잎의 adaxial 레이어에 연결을 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 이 잎의 각 측에 테이프의 조각을 추가 하 고 그들을 떨어져 필 링을 하면 됩니다. Abaxial 계층에서 셀 광원 stomata 오프닝 버퍼에서 복구할 수 있습니다. 후 나머지 포장도 세포의 세포 벽 타락 효소, 테이프에 가드 셀을 풍성 하 게 뒤에 남겨두고 소량을 사용 하 여 제거 됩니다.
이 간단한 방법에서는, stomatal 가드 셀 실용적이 고 반응 수 신속 하 게 그리고 효율적으로 준비, 농축된 stomatal 가드 세포를 최소의 비용으로 50 껍질에서 1 시간 이내에 복용. 여기에 메서드 protoplasts 준비는 이전 방법 보다는 식물 세포에 더 적은 손상을 부과 했다. 또한, 재료는이 방법은 수율 바람직한 단백질 금액에서 수집. 가장 중요 한 것은, 잎 혼합 대상이 되지 않습니다, 긴 소화 시간과 가드 셀 그대로 유지 하기 때문에 연구의 결과 더 밀접 하 게 가드 셀의 자연적인 생물학의 관련이 있을 것입니다. 이 방법으로 분자 수준에서 변경 stomatal 움직임 실시간에서 상관 수 있다. 따라서,이 준비 메서드를 사용 하 여 연구에서 얻은 지식을 가드 셀 신호에 대 한 보다 포괄적인 이해에 대 한 중요 한 것입니다.
우리 모델; 식물 애기 thaliana 사용 그러나이 프로토콜을 소화 시간에 작은 수정 stomatal 가드 셀 브라 시카 napus 등 다른 식물 종에의 농축에 적용할 수 있습니다. 개념의 증거로 서 우리는이 방법을 통해 농축 stomatal 가드 세포는 가능한 fluorescein diacetate (FDA) 분석 결과 각각 식물 호르몬 abscisic 산 (ABA)를 이용 하 여 연구에 의해 표시 된 것 처럼 자극에 반응 증명 하고있다. 또한, 우리는 높은-품질 단백질이 가드 셀에서 고립 될 수 있다 증명 하고있다. 여기, 우리는이 과정의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

가드 셀의 연구의 식물의 전반적인 기능에이 세포 유형은 특정 기부금의 지식에 근본적 이다. 그러나, 그것은 종종 어려운 분리 하 고 도전을 제공 따라서 종종 그들을 공부.
이 연구는 stomatal 가드 세포 농축 방법을 설정합니다. 프로토콜 가드 세포를 분리 하 고 세포에서 단백질을 추출에 스카치 테이프를 사용 합니다. 이 방법은 무결성과 가드 셀의 수익률 격리 중 향상과 세포 신호 프로세스와 어떻게 그들이 stomatal 운동 고기 연관의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공 합니다. 이 방법에서는, 식물 잎 테이프의 두 부분 사이 분할 되었고 abaxial 쪽 제거를 떨어져 벗 겨. 이 프로토콜은 가드 셀을 애기 잎 조직에 적용 되었다. Fluorescein diacetate 생존 능력을 결정 하는 (FDA)와 abscisic 산 (ABA) stomata 운동 ABA에 대 한 응답에서을 평가 하는 세포 치료 했다. 결론적으로,이 프로토콜 증명 농축된 stomatal 가드 셀을 준비 하 고 단백질을 분리 하는 데 유용 합니다. 세포와 단백질의 품질 얻을 여기 생리 및 다른 생물학 연구.

대표 이미지 전에 애기 가드 셀의 전후 mesophyll와 표 피 세포의 소화 그림 1에 표시 됩니다. 효소 활동 및 세포 막의 무결성 (그림 1B 및 1 D)를 측정 하는 FDA를 사용 하 여 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후 가드 세포 생존 능력을 관찰할 수 있습니다. 그림 2 는 stomatal 운동의 애기 ABA 치료에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Stomatal 조리개 ABA 치료의 30 분 후 50% 이상 감소합니다. 그림 2A stomata 운동의 시간 코스입니다. 다양 한 시간 점에서 사진 가벼운 현미경으로 찍은 사진. Stomatal 조리개 ImageJ로 측정 되었다 고 결과 80 조리개 측정 ± 표준 오류에 60에서 평균으로 제시 했다. 각 시간 점에서 stomata 조리개의 대표 이미지는 그림 2B에 표시 됩니다. 단백질 검출, 분리 및 관계 되는 풍부는 SDS 페이지 (그림 3)에 의해 관찰 된다. 4 생물 복제 단백질 추출이이 방법에서의 재현성을 강조 하기 위해 포함 되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57422/57422fig1.jpg"> 그림 1 . Fluorescein diacetate 생존 얼룩 가드 셀의 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후. 밝은 분야에서 (소화)는 (A) 껍질 (B) 껍질 (소화) FDA와 스테인드. (C) 껍질 (소화) 아래 밝은 필드 (D) 껍질 (소화)와 FDA와 스테인드. 모든 그림은 40 X 확대 촬영 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57422/57422fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57422/57422fig2.jpg"> 그림 2 . 응답으로 ABA stomatal 운동의 애기. 표 피 제거, 사전 2 h의 오프닝 버퍼 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2)와 빛 아래 incubated 하 고 다음 물과 5, 10 µ M ABA 치료를 incubated 상피 세포와 완전히 확장 된 잎에서 벗 겨 했다 10 및 30 분 (A) Stomatal 움직임의 시간 과정입니다. (B) 각 시간에서 stomata의 대표 이미지 포인트. 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 ± SE를 수단으로 표시 됩니다. 분산 분석 (ANOVA) 평균 차이 분석 preformed 했다. 다른 문자는 p에서 크게 다른 평균 값을 나타냅니다 < 0.05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57422/57422fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57422/57422fig3.jpg"> 그림 3 . 페 놀 기반 단백질 추출 방법을 사용 하 여 풍부한 가드 세포에서 단백질의 SDS 페이지 분리. 같은 양의 (40 µ g) 단백질 12.5 %polyacrylamide 젤을 사용 하 여 해결 되었고 CBB와 시각. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57422/57422fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K 조회수.  University of Florida. 이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

비디오: Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

품질 이노시톨 Pyrophosphates의 준비

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에<em&gt; 초파리</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...