Agradecemos a Daniel Chen na Digital vídeo produção equipe de Buchholz High School para assistência na edição do vídeo. Esta pesquisa sobre estomáticas células de guarda, proteómica e metabolómica no laboratório de Chen foi apoiada por concessões nos National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong é suportado pelo Conselho da bolsa de China. Dr. Qiuying Pang é suportado pela China Scholarship Council e Fundação Nacional de ciências naturais da China (31570396).

1. cultivo de plantas
<ol><li>Germinar as sementes na mistura de potting. Cultivar plantas em uma câmara de crescimento com uma intensidade luminosa de 140 µmol fótons m− 2 s − 1 e um fotoperíodo de luz h 8 a 22 ° C e 16 h escuro a 18 ° C durante 2 semanas.</li>
	<li>Transplante de mudas de tamanhos similares individualmente em 4" potenciômetros de diâmetro contendo o solo e crescer para um adicional 3 semanas nas mesmas condições descritas no passo 1.1. Nota: Regar plantas com água da torneira duas vezes por semana para manter o solo úmido.</li>
</ol>2. preparação dos estomas enriquecidas
<ol><li>Retire as folhas de plantas da . thaliana 5 - semana de idade individuais com um bisturi.</li>
	<li>Anexe cada folha a dois pedaços de fita adesiva clara, com uma peça aderindo ao lado abaxial (inferior) e o outro pedaço, aderindo ao lado (superior) adaxial da folha. Deixe a fita da folha para 5 s.</li>
	<li>Suave peel separado os dois pedaços de fitas usando o dedo indicador e o polegar em cada mão para separar o lado abaxial com pavimento e guarda as células e o lado adaxial com células do mesofilo.</li>
	<li>Lugar as cascas do lado abaxial das folhas em 60 mL de estomas abertura de buffer (50 mM KCl, 10mm MES-KOH, ajustado ao pH 6.2 com 1m KOH) no tamanho de 40 mm × 12 mm Petri pratos como eles são coletados.<ol>
<li>Repita os passos acima até que todas as cascas de amostra são coletadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os pratos de Petri contendo as cascas para a câmara de crescimento sob condições de luz indicado no passo 1.1. Deixe as cascas sob a luz para 2h abrir completamente os estomas.</li>
	<li>Lugar de cascas em uma 150 x 20 mm placa de Petri contendo 50 mL de parede celular, digerindo a mistura de enzimas (celulase 0,7% R-10, macerozyme de 0.025% R-10, 0,1% (p/v) polivinilpirrolidona-40 e albumina de soro bovino 0.25% (p/v) em solução básica de 55% (0,55 M sorbitol, 0.5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, ácido ascórbico de 0,5 mM, 10 µM KH2PO4, 5mm 4-morpholineethanesulfonic ácido (MES) em pH 5,7 ajustado com 1m KOH).</li>
	<li>Agite as cascas num agitador recíproco em uma placa de Petri a 50 rpm por 20 min.</li>
	<li>Retire as cascas solução enzimática com pinça depois de 20 min. Transfira as cascas para um prato de Petri 150 x 20 mm tamanho contendo 50 mL de água.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de transferência, lave as cascas por 15 s duas vezes com 10 mL de água para remover qualquer solução de enzima residual.</li>
	<li>Use uma pinça para colocar as cascas em um prato de Petri tamanho 150 x 20 mm com 50 mL de estomas frescas abrindo reserva como usado na etapa 2.4. Incube durante 1 h em condições de luz indicado no passo 1.1 para permitir que os estomas recuperar.</li>
</ol>3. ácido abscísico (ABA) tratamento e ensaio de movimento de estomas
<ol><li>Em um prato de Petri tamanho 150 x 20 mm. Incube as cascas de estomas enriquecido a 30° C por 15 min em 50 mL de tampão de abertura estomática ou em 50 mL de tampão de abertura estomática, com uma concentração final de 10 µM ABA para o tempo de tratamento adequado.</li>
	<li>Coloque as cascas num agitador a 50 rpm para 5, 15 e 30 min. Depois de cada intervalo de tempo remover a casca com uma pinça e siga os passos da imagem latente na etapa 3.3.</li>
	<li>Com imagens dos estomas antes do tratamento ABA e nos vários pontos de tempo após o tratamento ABA com um microscópio de luz.<ol>
<li>Pegue uma casca e coloque-a sobre uma lâmina de vidro de microscópio.</li>
		<li>Coloque o slide no palco microscópio e ajustar o estágio para que a imagem da casca pode ser visualizada.</li>
		<li>Ajustar a multa e curso foco no microscópio para obter uma imagem clara das células guarda.</li>
		<li>Com várias imagens dos estomas múltiplos ampliação de 40 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir 60 aberturas estomáticas usando o ImageJ8.</li>
	<li>Calcule o erro padrão e o significado em um p-valor < 0,05 das 60 medições abertura estomática.</li>
</ol>4. proteína extração e separação de SDS-Page
<ol><li>Triture as cascas por 15 s em suficiente nitrogênio líquido para cobrir as cascas usando um pilão refrigerados.</li>
	<li>Por 50 cascas, adicionar 3 mL de fenol saturado de Tris (pH 8,8) e 3 mL de tampão de extração da proteína (0,9 M de sacarose, 0.1 M Tris-HCl, EDTA 0,01 M, 0,4% 2-Mercaptoetanol, 10 µ l de inibidor de protease e fosfatase de 1mm) com uma pipeta para o almofariz e depois triturar as cascas para 5 addi cional de minutos em uma coifa.</li>
	<li>O extrato usando uma pipeta de transferência e as cascas usando uma pinça de metal para um Oakridge centrifugar o tubo e agitar um agitador a 50 rpm durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Retire as cascas do tubo de centrífuga Oakridge e centrifugar o extrato em 5.000 x g durante 10 minutos. Em seguida, a fase superior fenólica de transferência para um novo tubo limpo microcentrífuga usando uma pipeta.</li>
	<li>Precipitado o fenol extraído de proteínas adicionando 5 volumes de acetato de amônio 0,1 M gelado em metanol 100%. Vórtice brevemente e incubar durante uma noite a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 20.000 x g a 4 ° C por 20 min, decante o sobrenadante derramando lentamente fora do tubo e reter a pelota de proteína no tubo.</li>
	<li>Lavar o sedimento de proteína, duas vezes com acetato de amônio 0,1 M em metanol e então duas vezes com acetona 80% e uma vez com 100% de acetona gelada. Nota: Lavagens são feitas pela adição de 10 mL do reagente especificado para o tubo de proteína. Agite em uma coqueteleira a 50 rpm por 5 min, seguido por centrifugação a 15.000 x g a 4 ° C por 10 min. Em seguida, despeje o reagente fora do tubo, mantendo apenas a pelota de proteína.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de acetona gelada de 100% para a pelota e ressuspender pipetando lentamente subindo e descendo.</li>
	<li>Transferência de suspensão de proteínas via pipeta para um tubo de microcentrífuga de 2 mL, em seguida, centrifugar a 20.000 x g a 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Remover a acetona por decantação é de tubo e secar a pelota em coifa por 10 min.</li>
	<li>Dissolver a proteína em um tubo de centrífuga de micro com 200 µ l de tampão de dissolução (8 M de ureia, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl pH 8,5) e vórtice de 30 min. centrifugar a 20.000 x g a 15 ° C por 20 min e recolher o sobrenadante em um novo tubo.</li>
	<li>Quantificar a concentração de proteína, seguindo o protocolo de quantificação de proteína9.</li>
	<li>Use amostras da proteína para separação de proteínas por eletroforese em gel seguindo o protocolo de10.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Guarda as células são um sistema de modelo para estudar os mecanismos de transdução de sinal nas plantas e é importante garantir que a preparação de amostras utilizadas no estudo é o mais adequado para responder às perguntas biológicas. Apesar do crescente interesse em células de guarda dentro da comunidade de pesquisa de planta, não existe nenhum método universal sobre como preparar estomáticas células guarda que permita o movimento estomático e fisiologia bem como as alterações moleculares para ser estudado em um sistema. O desafio para isolá-los pode ser atribuído em grande parte ao seu tamanho pequeno, baixa abundância e estrutura original, que pode tornar mais ou menos difícil removê-los do toda folhas.
Este protocolo fornece um método sobre como superar esses obstáculos, isolando-as usando um método desenvolvido fita-casca. O método apresentado neste protocolo fornece uma maneira para isolar intactas estomáticas guarda as células, que permanecem fisiologicamente sensíveis a estímulos. A preparação destas amostras torna possível para a extração de proteínas de célula guarda que poderia servir como matéria-prima para estudos em profundidade proteomic, tais como estudos de proteômica quantitativa utilizando Tags de massa em Tandem (TMT) e/ou isobárica tag para 11,de quantificação relativa e absoluta (iTRAQ)12. Além disso, este método pode ser ligeiramente modificado e otimizado para tornar possível o estudo de pequenas moléculas, tais como metabólitos encontrados nas células de guarda. O experimento aqui utilizou o phytohormone ABA como um elicitor para o movimento estomático em Arabidopsis, no entanto, outros tratamentos podem ser utilizados em conformidade. Esse método também é adaptável para outras espécies de plantas.
Devido o delineamento experimental e a natureza dos materiais utilizados neste protocolo, existem algumas etapas críticas. Enquanto descascando desmoronar as faces abaxial e adaxial da folha (passo 2.2), é importante que seja feito sem hesitação e aplicando uma pressão suave igual para ambas as partes da fita para que a camada abaxial é uniforme após ele é removido. É importante otimizar o tempo de técnica e digestão de peeling individuais para as espécies de plantas no estudo como eles podem ter tempos diferentes de digestão óptima. Durante a digestão enzimática (etapas 2.8-2.10), as cascas devem ser vigiadas de perto e verificadas a cada 3-5 minutos. Isto é importante porque pequenas diferenças nas camadas das cascas resultará em tempos de digestão mais rápido ou mais lento. Ao tratar as cascas com ABA ou outros estímulos (passo 3.1), as cascas devem ser igualmente espaçadas, flutuante e agitando suavemente para que eles nunca se sobreponham. As cascas que se juntam ou se sobrepõem podem produzir resultados diferentes devido à falta de contato com a solução.

Estomas desempenham um papel importante na fisiologia geral e adequação das plantas. Estas estruturas específicas de pequena planta são formadas por duas células epidérmicas especializadas conhecidas como células de guarda e são encontradas mais abundantemente na superfície abaxial das folhas. Estomas são necessárias para a troca de gases entre a planta e a atmosfera, bem como o controle da perda de água através da transpiração. Guarda as células regulam a abertura de estômatos, através da integração de diferente externa (por exemplo, luz, umidade, contato do patógeno, os níveis de dióxido de carbono) e interna (ex., hormônios endógenos) estímulos1,2. Nos últimos 20 anos, este tipo de célula tornou-se um modelo de sistema para sinalização de processos em plantas de celular estudando. Essas células compõem uma pequena fração das células totais em uma folha; assim, para investigar seu celular exclusivo, propriedades bioquímicas e moleculares de uma célula única forma, é necessário isolá-los de outros tipos de células da folha. No passado, estudos de célula guarda muitas vezes envolveram a preparação da célula guarda protoplastas (GCP)3,4,5. Isto normalmente requer o uso de grandes quantidades de enzimas degradantes de parede celular e/ou ruptura mecânica através de mistura e tem provado ser dispendioso e demorado, que geralmente leva muitas horas para preparar uma amostra GCP, muitas vezes vezes com pouco rendimento. Mais importante, porque as células guarda atuar como pares completas para regular a abertura de estômatos, o uso do GCP pode ser visto como um sistema artificial para estudar a sinalização da pilha de guarda.
Aqui, nós desenvolvemos um método para preparar estomas na qual células intactas de guarda são enriquecidas e manter respostas fisiológicas aos estímulos. Este método foi inspirado por um método que foi usado para isolar o mesofilo célula protoplastas6,7. Em nosso método, estomas são preparadas com clara de fita adesiva para separar primeiro a maioria das células do mesofilo anexado à camada adaxial da folha da camada abaxial contendo o pavimento e as células de guarda. Isso é feito pela aposição de um pedaço de fita para cada lado da folha e descascá-las separadas. As células da camada abaxial podem recuperar sob a luz em um buffer de estomas-abertura. Mais tarde, as células restantes do pavimento são removidas usando uma pequena quantidade de parede celular degradante enzimas, deixando para trás células guarda que são enriquecidos na fita.
Neste método simples, estomáticas células guarda que sejam viáveis e responsivo pode rapidamente e eficientemente ser preparado, tendo menos de uma hora para obter células de guarda estomáticas enriquecidas de 50 cascas com um custo mínimo. O método aqui impõe menos danos às células da planta do que métodos anteriores, onde os protoplastas são preparados. Além disso, materiais colhidos este quantidades de proteína desejável de rendimento de método. O mais importante, porque a folha não está sujeita a mistura ou tempos de digestão demorada e guarda as células permanecem intactas, os resultados dos estudos mais estreita será relevantes para que um guarda do natural da biologia das células. Com este método, estomáticas movimentos possam ser correlacionados em tempo real com as mudanças a nível molecular. Assim, o conhecimento adquirido com estudos usando esse método de preparação seria importante para uma compreensão mais abrangente da sinalização celular de guarda.
Usamos a planta Arabidopsis thaliana como modelo; no entanto, este protocolo pode ser aplicado para o enriquecimento das células de guarda estomáticas em outras espécies de plantas tais como Brassica napus com pequenas modificações no tempo de digestão. Como uma prova de conceito, temos demonstrado que células de guarda estomáticas enriquecidas através deste método são viáveis e responsivo a estímulos como mostrado pelo ensaio de fluoresceína diacetato (FDA) e estudos utilizando hormônio vegetal ácido abscísico (ABA), respectivamente. Além disso, Nós demonstramos que proteínas de alta qualidade podem ser isoladas destas células guarda. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado desse processo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

O estudo das células guarda é essencial para o conhecimento das contribuições específicas deste tipo de célula para a função global de plantas. No entanto, muitas vezes é difícil isolar e, portanto, estudá-los muitas vezes fornece um desafio.
Este estudo estabelece um método de enriquecimento de célula estomática de guarda. O protocolo utiliza fita adesiva para isolar as células guarda e extrair as proteínas das células. Esse método melhora a integridade e o rendimento da célula guarda durante o isolamento e fornece uma amostra confiável para o estudo dos processos de sinalização celular e como eles se correlacionam com fenótipos movimento estomático. Neste método, as folhas da planta foram particionadas entre duas partes da fita e pedaços descascadas para remover o lado abaxial. Este protocolo foi aplicado ao tecido de folha de Arabidopsis para isolar as células guarda. As células foram tratadas com diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a viabilidade e com ácido abscísico (ABA) para avaliar o movimento de estômatos em resposta a ABA. Em conclusão, este protocolo prova útil para preparar células de guarda estomáticas enriquecidas e isolar proteínas. A qualidade das células e proteínas obtidas aqui enable fisiológico e outros estudos biológicos.

Uma imagem representativa de Arabidopsis guarda células antes e após a digestão do mesofilo e as células epidérmicas é mostrado na Figura 1. Viabilidade celular de guarda antes e após a remoção do mesofilo e as células epidérmicas pode ser observada usando o FDA para medir a atividade enzimática e a integridade da membrana celular (figura 1B e 1D). A Figura 2 ilustra o movimento estomático de Arabidopsis em resposta ao tratamento de ABA. Abertura estomática diminui mais de 50% após 30 minutos de tratamento com ABA. Figura 2A é um curso de tempo do movimento de estomas. Em vários pontos do tempo, as fotos foram tiradas com um microscópio de luz. Abertura estomática foi medida com ImageJ e os resultados foram apresentados como a média de 60 a 80 abertura medições ± erros-padrão. Uma imagem representativa da abertura estômatos em cada momento do tempo é mostrada na Figura 2B. Deteção de proteínas, a separação e a abundância relativa são observados por SDS-PAGE (Figura 3). Quatro repetições biológicas são incluídas para enfatizar a reprodutibilidade de extração da proteína deste método.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57422/57422fig1.jpg"> Figura 1 . Fluoresceína diacetato viabilidade coloração das células guarda antes e após a remoção do mesofilo e as células epidérmicas. (A) peelings (não digeridas) sob campo brilhante. (B) as cascas (não digeridas) e corados com FDA. (C) as cascas (digeridas) sob brilhante campo (D) as cascas (digeridas) e corados com FDA. Todas as fotos foram tiradas em ampliação de 40 X. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57422/57422fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57422/57422fig2.jpg"> Figura 2 . Movimento estomático de Arabidopsis em resposta à ABA. Epiderme foram descascados de folhas totalmente expandidas, com células epidérmicas removido e pré-incubados sob a luz com o buffer de abertura (50 mM KCl, 10mm MES-KOH, pH 6.2) por 2 h e em seguida incubadas com água ou com tratamento de ABA 10 µM para 5, 10 e 30 min. (A) Curso de tempo do movimento estomático. (B) imagem representativa dos estomas em cada ponto. Os dados são mostrados como média ± SE de três experimentos independentes. Análise de variância (ANOVA) foi realizado para analisar as diferenças. Letras diferentes indicam valores médios significativamente diferentes em p < 0,05. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57422/57422fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57422/57422fig3.jpg"> Figura 3 . Separação de SDS-PAGE das proteínas do enriquecido guarda células usando o método da extração da proteína baseada em fenol. Quantidades iguais (40 µ g) de proteínas foram resolvidas usando o gel de poliacrilamida de 12,5% e visualizado com a CBB. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57422/57422fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Este protocolo descreve um método de preparação estomáticas enriquecidas guarda células que é útil para estudos biológicos fisiológicos e outros.

Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K visualizações.  University of Florida. Este protocolo descreve um método de preparação estomáticas enriquecidas guarda células que é útil para estudos biológicos fisiológicos e outros.

Vídeo: Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Um Método Seccionamento melhorado para amostras de tecidos de plantas recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...