We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. 마우스 <ol><li> 마우스와 관련된 모든 연구는 스토니 브룩 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 마우스는 12시 12분 시간의 명암주기를 유지 하였다. <ol><li> 상업적으로 C57BL / 6 마​​우스를 얻을 수 있습니다. 에 loxP 사이트에 의해 형벌 Klf5 대립 유전자 (Klf5 f를 L / F 리터)을 들고 C57BL / 6 마우스를 얻습니다. 이 마우스는 이전에 (21)을 설명하고 우아 박사 료조 나가이에 의해 제공되었다. </li></ol></li><li> Lgr5 프로모터 (Lgr5-EGFP / CreERT2 마우스)의 규정에서 유도 Cre 호텔의 재조합 효소 유전자를 운반하는 C57BL / 6 마​​우스를 구입하십시오. </li><li> Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 f를 L / f를 리터 마우스를 설정하려면, 교차 Klf5 FL / F Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스와 다음 Klf5 FL / F 리터의 자손을 역 교배 리터 마우스 </SUP&gt; 마우스. </li><li> 프로토콜에 따라 타목시펜으로 치료 마우스는 이전 22 설명했다. 연속 5 일 동안 멸균 옥수수 기름에 용해 타목시펜 1 밀리그램 (10 ㎎ / ㎖) 8 주령의 실험 및 대조군 마우스의 복강 (IP)을 주입한다. </li><li> 첫 번째 타목시펜 주사 후 14 일에서 2 가스 소스를 CO에 연결 챔버에 배치하여 CO 2 질식을 사용하여 마우스를 희생. 마우스 의식하고 모든 움직임이 중단 될 때까지 가스가 챔버로 유입 할 수 있습니다. 안락사는 자궁 경부 전위를 수행 할 수 있도록합니다. </li></ol> 2. 조직 준비 및 스위스 롤링 <ol><li> 해부 집게와 가위를 사용하여 복부 쪽의 피부에 절개를 잘라. 포셉 한 쌍으로, 절개 부위의 피부를 잡고 부드럽게 떨어져 복부 근육 조직에서 빼냅니다. 복부 근육을 복부 피부를 잘라 노출 가위를 사용합니다. </li><li> 잡고 흥을 끌어포셉으로 ritoneum. 잡고 창자에서 당겨 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 복막 조직의 절개를하고 복부 근육을 노출 피부를 멀리 절단을 계속합니다. 조심스럽게 복부 근육의 절개를하고 장을 노출을 멀리 절단을 계속합니다. </li><li> 콜론를 확인하고는 직장 / 항문을 조인 말단부에 추적. 가위로, 가능한 한 항문에 가깝게 잘라. </li><li> 위를 확인하고는 소장과 결합 위치를 추적. 가위로 약 1cm 떨어진 위장에서 소장 무료 잘라. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 깨끗한 페트리 접시에 해제 소장과 대장의 전체 길이를 전송합니다. </li><li> 한 손 또는 집게 쌍으로 결장의 말단부를 잡고있는 장간막 부드럽게 결합 및 / 또는 지방 조직에서 콜론의 전체 길이를 해명 한편을 사용한다. </li><li> 맹장을 식별(작은 크고 작은 창자 사이 파우치)과 맹장과 결장은 대장을 무료로 (콜론의 기단부)에 가입 위치를 잘라. </li><li> 한 손이나 집게 한 쌍으로, 소장을 잡고 조심스럽게 모든 장간막 결합 및 / 또는 지방 조직에서 소장의 전체 길이를 해명하기 위해 다른 손을 사용합니다. 맹장을 절취하고 필요가없는 경우 버린다. 밤새 처리가 DH (2 O 50 % 에탄올 / 5 % 아세트산)의 변형 Bouin 정착액의 밖으로 해부 창자 배양하여 여기에 정지 될 수 있고, 다음 날의 절차를 계속 참고. </li><li> 소장 (소장 또는 대장)의 하나의 세그먼트를 처리, 수정 Bouin의 정착과 함께 10 ML의 주사기를 작성하고 그것에 위관 바늘을 연결합니다. 장 세그먼트 (segment)의 전방 구멍에 반 센티미터에 대해 바늘을 삽입합니다. </li><li> 악기에 확실히 압력을인가함으로써 장 구간 안에 위관 니들을 잡아장 세그먼트. 한편 주사기 채 수정 Bouin의 정착액을 이용하여 장 구간의 내용을 플러시 완만하지만 일관된 압력을 적용한다. 이 단계는 장 세그먼트 즉시 고정 동시에 청소를 할 수 있습니다. 플로우를 통해 폐기물을 수집하는 페트리 접시를 사용합니다. 고정 불투명 선회 결장 색으로 관찰 할 수있다. 참고 : 세척하거나 장 세그먼트가 오픈 버스트 수있는 동안 너무 많은 압력을 가하지 않도록해야합니다. </li><li> 가위를 사용하여 장간막 라인을 따라 길이 방향으로 장 세그먼트를 열 잘라. 한 쌍의 겸자로 잡아하고 PBS를 함유하는 페트리 접시에 간단히 린스. <ol><li> 근위부, 중간 및 원위부 : 3과 동일 세그먼트로 소장을 잘라. 근위 세그먼트는 위 다음 바로 하나이며, 말단 부분은 콜론 전에 즉시 하나입니다. 근위 세그먼트에 십이지장, 소장의 중간 및 말단에 해당회장. </li><li> 각 세그먼트의 근위 및 원위 단부를 표시한다. 선단부는 원래 위를 향해 가리키는 된 하나는 콜론으로 지적 말단이다. </li></ol></li><li> 세정 및 열 장 세그먼트를 배치하는 페트리 접시의 상단을 사용합니다. 내강면이 위를 향하도록 장 세그먼트를 배치합니다. <ol><li> 콜론의 경우, 그것의 폭을 가로 질러 실행 variegations / 능선에 의해 내강면을 식별하고 기단부에 존재한다. 중간 및 말단 영역은 길이 방향으로 실행 일부 variegations 있습니다. 소장의 경우, 융모를 표시하는 거친 나타나는 표면에 의해 내강 측을 식별합니다. 참고 : 작은 창자를 들어, 근위부, 중간 및 말단 영역의 외부 육안 해부학 적 경계가 없습니다. 그러나이 지역은 현미경 섹션에서 확인 할 수있다. 그들이 곳 융모는 말단 점차 짧아 인접 지역에서 가장 오래되고이 될길이가 짧은. 미시적으로는 결장 음와은 리지의 존재에 의해 식별 될 수있는 인접 영역의 최단이다. 대장 지하실 아직 인접 지역에 비해 여전히 키가 말초 지역의 중앙부에서 가장 높은 짧은이다. </li></ol></li><li> 스위스 결장 롤링 진행합니다 : <ol><li> 평면 오픈 콜론을 유지하고 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다. </li><li> 이 위를 향하도록 내강면을 유지하고 한 손으로 집게로 근위 끝을 잡고 다른 손으로 이쑤시개를 개최합니다. </li><li> 집게를 사용하여 이쑤시개 주위의 기단부의 가장자리를 감싸 약간 제자리에 고정하기 위해 이쑤시개에 랩 가장자리를 끼. </li><li> 부드럽게 천천히 스위스 롤을 형성하기 위해 이쑤시개 주위에 결장 롤 손가락으로 이쑤시개를 압연 시작합니다. </li><li> 전체 대장의 길이가 겹쳐서되면, 조심스럽게 C를 슬라이드 집게 한 쌍을 사용하여이쑤시개 오프 및 조직 처리 / -embedding 카세트에 olon 스위스 롤. 실온에서 하룻밤 동안 10 % 포르말린에 카세트를 놓습니다. </li></ol></li><li> 스위스 소장 롤링 진행합니다 : <ol><li> 한 번에 하나의 세그먼트를 처리, 내강면이 평면 오픈 세그먼트를 주기적으로 업데이트하여 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다. </li><li> 대장에 기재 한 바와 같이 스위스 압연을 진행합니다. </li></ol></li><li> 파라핀 삽입에 대한 포르말린 고정 조직을 처리를 진행합니다. 다음과 같이 진행하십시오 : 참고 : (자세한 내용은 자재 및 장비의 참조) 자동화 된 프로세서를 사용합니다. <ol><li> 조직 카세트 중일 고착성이 완전히 제거 될 때까지, PBS로 조직을 헹군다. </li><li> 다음 순서에 따라 에탄올을 이용하여 조직을 탈수 : 50 %의 에탄올을 10 분, 70 % 에탄올에서 10 분, 80 % 에탄올에서 10 분, 10 분, 95 % 에탄올, 10 분 동안 100 % 에탄올, 100 % 에탄올 10 분간 , 110 분 00 % 에탄올. </li><li> 다음 순서 자일 렌과의 교류 에탄올 : 2 : 1의 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 1 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 2 에탄올 : 10 자일 렌 - 10 15 분, 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분. 주의 : 크실렌 따라서 직장이 적절한 후드와 직원이 착용해야 적절한 보호 장비와 국소 배기 장치가 장착되어 있어야 건강에 유해하다. </li><li> 파라핀과의 교류 크실렌. 2 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 100 % 파라핀 58 °의 C - 오븐 (54)에 설정된 진공에서 다음 단계를 수행 1 - 2 시간, 1 100 % 파라핀 - 2 시간 또는 하룻​​밤. 참고 :이 파라핀 중합체를 분해하고 단단하고 부서지기 쉬운 것 때문에 파라핀 시간의 연장 기간 동안 60 ° C를 넘지 않도록하십시오. </li><li> 드 신선한 새로운 파라핀과 동양 조직에 포함파라핀이 경화되기 전에 희망하는. 스위스 롤의 경우, 조직 paraffinization 다음, 파라핀 삽입하는 동안 옆에 각 롤의 위치를​​ 변경하는 것이 중요합니다. 이 절단시 각 롤의 전체 길이의 부분이 생성 될 것임을 보장한다. </li></ol></li><li> 염색의 경우, 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 부분을 잘라. ; 충전 슬라이드에 섹션을 수집하고 오븐에서 밤새 65 ° C에서 그 (빵)을 건조 실온에 시원하고 연속적으로 염색을 위해 그들을 사용 할 수 있습니다. 주 : 소성 시간은 1로 단축 할 수있다 - 슬라이드 얼마나 갓 절단에 따라 2 시간. 절편 이후 한 달 미만의 경우는 하룻밤 구워하는 것이 좋습니다. 한 달 이상 되었다면, 1 - 2 시간의 소성 시간을 저장하기에 충분하다. 시간이 부족하면, 밤새 백업은 항상 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 조직 학적 분석 및 면역 형광 염색법 조직 학적 분석 및 immunoflu를 수행orescence 염색은 이전의 수정, 23, 24을 설명했다. 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 면역의 경우 : <ol><li> 1 시간 동안 65 ° C 오븐에서 슬라이드 구워 내생 알칼리 포스 파타 아제 활성을 비활성화하고 이후 자일 렌에 deparaffinize. </li><li> 내인성 퍼 옥시다아제 조직을 차단 메탄올 중 3 % 과산화수소 욕 섹션을 인큐베이션; 다음 10 분 동안 125 ° C에서 구연산 완충액 항원 회수 하였다 감소 알코올 욕 시리즈 (100 %, 95 %, 70 %)에서 배양 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0) 재수 decloaking 챔버를 사용하여. </li><li> 소수성 장벽을 제공 펜을 표시하여 조직 섹션 주위에 원을 그리고 (EGFP에 대한 일차 항체로 다음 희석 한을 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS-트윈 2.5 % 소 혈청 알부민 [BSA]) 버퍼를 차단과 함께 섹션을 품어 : 밤새 가습 실에서 4 ° C에서 500) 부드럽게 흔들어 섞으면.</li><li> 부분을​​ 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 적절한 농도로 형광 표지 된 이차 항체와 함께 품어. </li><li> 훽스트 2 차 항체 처리 및 얼룩 핵 후 슬라이드를 세척하고 설치 미디어를 탑재합니다. <ol><li> Klf5 / EGFP / 기-67 공동 염색의 경우, 프로세스 슬라이드 단계 3.1에 ​​설명 된대로 - 3.3 Klf5 항체 (희석 1 : 150)을 배양하여 Klf5 염색을 수행 하룻밤. </li><li> 프로토콜에 따라 슬라이드에 토끼 AP 폴리머 검출을 적용합니다. </li><li> Klf4는 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 면역 조직 화학 염색을 이용하여 염색 알 수있다. </li><li> 이전에 기술 된 프로토콜 25을 사용하여 항체 용출을 수행합니다. 글리신 - SDS에서 50 ° C (산도 2.0) 1 시간 동안 교반 솔루션에서 슬라이드를 품어. </li><li> 세척하고 증류수로 충분히 슬라이드 및 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS 트윈 - 2.5 %의 BSA) 블로킹 완충액으로 배양한다. </li><li> 기-67 추가 (희석 1 : 500)와 EGFP (희석 1시 50분0) 동시에 항체 및 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> (데이터는 도시하지 않음) 훽스트 염색하기 전에 적절한 보조 항체와 형광 검출을 수행하고 매체를 장착 마운트. </li></ol></li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 26 5 μm의 섹션을 염색에 조직의 조직 학적 형태를 관찰한다. 형광 이미지의 각각 EGFP, Klf5 및 기-67 염색을 시각화 535, 646, 700의 방출 파장을 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li><li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine.">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells.">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li><li>van der Flier, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+achaete+scute-like+2+controls+intestinal+stem+cell+fate.">Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate.</a> Cell. 136 (5), 903-912 (2009).</li><li>Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+is+expressed+in+vivo+in+intestinal+stem+cells.">Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells.</a> Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).</li><li>Montgomery, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+telomerase+reverse+transcriptase+(mTert)+expression+marks+slowly+cycling+intestinal+stem+cells.">Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconversion+between+intestinal+stem+cell+populations+in+distinct+niches.">Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches.</a> Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).</li><li>May, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+putative+gastrointestinal+stem+cell+and+adenoma+stem+cell+marker,+doublecortin+and+CaM+kinase-like-1,+following+radiation+injury+and+in+adenomatous+polyposis+coli/multiple+intestinal+neoplasia+mice.">Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice.</a> Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).</li><li>Powell, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pan-ErbB+negative+regulator+Lrig1+is+an+intestinal+stem+cell+marker+that+functions+as+a+tumor+suppressor.">The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor.</a> Cell. 149 (1), 146-158 (2012).</li><li>Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+transcription+factors:+a+functional+family.">Kruppel-like transcription factors: a functional family.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).</li><li>McConnell, B. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Kruppel-like+factors+in+health+and+diseases.">Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases.</a> Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).</li><li>McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+Kruppel-like+factors+4+and+5+in+epithelial+biology+and+pathobiology.">The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology.</a> Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).</li><li>Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+essential+for+proliferation+and+survival+of+mouse+intestinal+epithelial+stem+cells.">Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).</li><li>Gelberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy,+physiology,+and+mechanisms+of+disease+production+of+the+esophagus,+stomach,+and+small+intestine.">Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine.</a> Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).</li><li>De Robertis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AOM/DSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis:+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies.">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J Carcinog. 10 (9), (2011).</li><li>Magnus, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+presence+of+intestinal+epithelium+in+the+gastric+mucosa.">Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).</li><li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"Swiss+roll":+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine.">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li><li>Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+practical+'swiss+roll'+method+of+preparing+tissues+for+paraffin+or+methacrylate+embedding.">A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding.</a> J Microsc. 145, 115-120 (1987).</li><li>Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+and+chromogenic+in+situ+hybridization+to+detect+genetic+aberrations+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+material,+including+tissue+microarrays.">Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays.</a> Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).</li><li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+are+essential+for+the+adaptive+response+of+the+murine+heart+to+pressure+overload.">Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload.</a> J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).</li><li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium.">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li><li>McConnell, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+important+for+maintenance+of+crypt+architecture+and+barrier+function+in+mouse+intestine.">Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).</li><li>Nandan, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+5+is+a+crucial+mediator+of+intestinal+tumorigenesis+in+mice+harboring+combined+ApcMin+and+KRASV12+mutations.">Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations.</a> Mol Cancer. 9 (63), (2010).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

스위스의 압연 기술은 대규모 조직 학적 및 형태 학적 평가 소장 조직을 제조하기위한 강력한 방법이다. 원래 동결 절편 (18, 19)의 제조를 위해 개발 된 전술 스위스 압연 기술과는 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직에 대한 신속한 장 준비 및 고정 할 수있다. 냉동 된 조직과 비교 FFPE 조직 훨씬 긴 수명을 갖고 있기 때문에 더 조직 무결성 조직 학적 분석을 위해 조직의 바람직한 형태이다. 스위스 압연 프로토콜의 중요한 부분은 압연 및 염색 postfixation의 스위스 롤 무결성 및 조직의 품질을 유지하기위한 조직의 유연성을 포함한다. 장 조직 FFPE 표준 스위스 롤 기법은 일반적 힘들고 시간 소모적 (2 일) (18, 19)이다. 또한,이 표준 방법은 일반적으로 R은 소장 조직을 수득elatively 뻣뻣하고 쉽게되지는 스위스 롤에 형성한다. 10 % 포르말린에서 장 해부 조직 밤새 인큐베이션 조직 압연 전의 요구되기 때문이다. FFPE 목적 기술의 다른 변형도 개발되었지만, 이들은 장 조직의 경향이 큰 문제가 겹쳐서 및 / 또는 롤의 중심이 왜곡 될 때까지한다. 이 기술에 사용 된 조직은 소장에 의해 생성 된 점액으로부터 미끄러 미 정착 신선한 조직이기 때문이다. 여기에 도시 된 수정 된 새로운 기술 Bouin의 정착액의 변형 형태를 사용하여 이러한 문제점을 극복한다. 원래의 Bouin 고정액 아세트산, 에탄올, 피크르산 및 파라 포름 알데히드 (또는 포르말린)의 혼합물로 구성된다. 두 개의 가장 유해 성분 피크르산 및 파라 포름 알데히드 (또는 포르말린), 아세트산 / 에탄올 믹스 정착액 훨씬 안전한 사용을 허용하기 위해 제거되었다. 피크르산은 폭발 위험 및 parafor를 제공합니다maldehyde (또는 포르말린)는 암의 위험이 있습니다. 개질 Bouin의 정착액을 사용하는 의의는 (1) 원래의 식에 비해 덜 위험하다는 것이다, (2) 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 비교적 nonexpensive 시약 제조 용이하고, (3) 신속 허용, 거의 즉시, 조직의 고정은 세척을 위해 사용될 때. 지식이 수정 된 기술을 사용하여 알려진 제한이 없습니다. 또한,이 혼합물과 빠른 정착은 대단히 훨씬 빠르고 쉽게 조직 압연을 허용, 장 조직의 미끄러짐을 줄일 수 있습니다. 이 정착은 조직 학적 및 면역 염색 분석을위한 조직과 세포 무결성의 우수한 보존 할 수 있습니다. 따라서, 장내 티슈 제조하는 다른 방법에 비해이 개선 된 기술은 크게 속도 및 사용 용이성을 향상 여러 가지 기술적 인 문제와 보조금을 극복한다. 또한,이 수정 정착 다른 두께로 사용하는 것이 유용하다빠른 고정을 필요로 조직. 때문에하면서 동시에 진행 정착시 두꺼운 조직의 빠른 침투 능력을 갖고, 아세트산 및 에탄올의 특성 중. 우리는 신속하게 간, 비장, 신장으로 두꺼운 조직을 해결하기 위해 성공적으로 사용하고 있습니다. 20 분 - 예를 들어, 변성 Bouin의 정착액을 이용하여 성인 마우스 전체 간 고정술은 보통 15에서 이루어진다. 이것은 쉽게 간으로 단면을 절단 간 깊은 영역은 회색으로 혈액 - 붉은 색으로 변화했는지 관찰하여 판단 할 수있다. 색의 변화는 정착 나타낸다. 조직이 이미이 시점에서 고정 된 바와 같이, 변형 된 세포 / 조직 구성의 두려움과 48 시간 -이 고정 후 (24)에 대한 완충 포르말린을 사용하여 가교옵니다. 깊은 조직 fixati을 달성하기 위해 48 시간 - 비교함으로써, 전체 성인 마우스 간에서 단독으로 사용하는 기존 완충 포르말린 고정 방법 24을 필요에 깊은 조직의 변형 된 세포 조성물의 위험. 두꺼운 조직의 빠른 정착 방법은 신체로부터 장기 / 조직의 제거에 이어 저산소증과 같은 조건, 스트레스에 응답하여 최소한으로 세포 성분의 변화를 감소시키는 우수한 장점을 갖는다. 우리는 수정 정착이 요구되는 두께의 조직 / 기관의 고정 더 빠른 방법으로 동물의 혈류에서 사용할 수 있음을 예상하고있다. 따라서, 결론에서,이 방법을 수정 정착 신속하게 다른 두께의 조직 / 장기를 해결하는 데 사용할 수있는 장 조직 수확 및 고정 및 수정 정착에 사용되는 기존의 방법에 비해 여러 장점을 제공한다.

포유류 장 상피 원주 세포의 단일 층을 포함한다. 분화 된 세포가 융모의 영역을 차지하면서 소장에서 증식 세포 지하실에 국한된다. 대장에는 융모 없기 때문에 그러나 증식 세포 지하실의 바닥에 지역화 및 분화 세포 소낭의 상부 영역을 차지한다. 지하실 내 증식 성 세포의 연속 분할에 의해 구동된다 - (5 일 3) 장 상피 신속한 보급을 겪는다. 지하실의 증식 성 세포는 균질 집단 아니며 상기 줄기 세포와 교통 증폭 (TA) 셀 (1)로 세분화된다. 이 바로 아래에서 5 세포 - 줄기 세포는 제 4 내 토굴 하단에 상주. 굴베이스 기둥 (CBC) 줄기 세포 및 예비 정지 줄기 세포 : 현재의 모델은 두 가지 줄기 세포 유형의 존재를 지원한다. CBC의템 세포는 활발하게 증식하고 류신이 풍부한 반복 포함하는 G 단백질 결합 수용체 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 Achaete의 방패 꼴의 뼈 조각 같은 2 (Ascl2) (5)로 표시됩니다. 한편, 예비 정지 줄기 세포는 B 세포 특이 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 통합 위치 1 (BMI1) 6 마우스 텔로 머라 제 역전사 (mTert) (7)에 의해 표시되어, HOP 호 메오 박스 (Hopx) 8 Doublecortin 형 캠 키나제 -like 1 (Dclk1) (9), 및 류신이 풍부한 반복 및 면역 글로불린 같은 도메인 1 (Lrig1) 10. 능동적 증식 줄기 세포를 흡수 셀 (장 세포) 및 분비 세포 (장 내분비, 잔, Paneth 및 다발 세포)로 분화를 더 받아야 TA 세포 일으킨다. 그들은 세포 사멸을 받아야하고있는 융모의 상단에 도달 할 때까지 증식 영역에서 지속적인 세포 분열은 토굴-융모 축을 따라 상피 세포의 상향 이동 결과상피의 표면으로부터 벗겨진. 장 상피 세포의 종류 (예를 들어, 장 배 세포가 리소자임에 대한 항체 및 MUC2 Paneth 세포에 대한 항체로 염색하여 인식 할 수있다) 별개의 단백질의 발현에 의해 표시된다. 우리는 장 상피 11-13의 항상성 및 병리 생물학에서 크 룹펠 같은 요인 (KLFs)의 역할을 연구한다. 변형 스위스 - 롤링 방법의 타당성을 지원 여기에 제시된 결과는 활발히 증식 장내 상피 줄기 세포 (14)의 유지 보수 크 룹펠 형상 인자의 역할 5 (KLF5)의 이전 연구에 기초한다. KLF5는 매우 활성 장 줄기와 TA 세포 (12)로 표현된다 아연 손가락 전사 인자이다. 이전 연구는 KLF5이 기-67, 장 지하실에서 알려진 증식 마커와 공동으로 표현되는 것을 보여 주었다. 위장 TR<html> 행위는 구조적으로 또는 기능적으로 균일 한 조직이 아니다. 소장은 근위부, 중간, 말단 부분으로 나누어 후자의 추가와 함께, 십이지장, 공장 및 회장과 맹장과 결장으로 대장으로 구분된다. 이 섹션은 각각 고유의 조직 학적 특징을 가지고 있으며, 서로 다른 역할 (15)을한다. 이와 같이, 욕설 효과 및 장 상피 세포의 반응의 정도를 연구 조직 (16)의 영역에 의존 할 수있다. 또한, 다양한 마우스 균주는 시험 16에 사용 모독의 유형에 기초하여 조직 학적 수준의 응답의 다양성을 증명한다. 따라서, 티슈 제조 어울리는하여 적절한 조직 학적 및 장 조직의 분자량 분석을 허용 할 필요가있다. 이와 같이, 스위스 롤 기술을 부여 한 번에 장 상피 세포의 전체 길이의 분석 따라서 포괄적 인 정보를 기반으로 박식 한 결론을 확인한다. e_content &quot;&gt; 스위스 롤 기법 제 매그너스 (17)에 의해 언급 한 Moolenbeck 및 Ruitenberg 및 공원 등에 의해 상세하게 설명 하였다. 조직을 준비하고 조직학을 수행하는 방법은 쥐 소장 18,19 각각. 프로토콜 분석으로 진단 목적을위한 적절하고 신뢰성있는 티슈 제조 허용 일본어 방법의 개선 된 버전이 공보에 제시 묘사. 이러한 변형 기술은 효율적인 수집 및 면역 조직 화학, 면역뿐만 아니라 세계적으로 사용되는 기술에 대한 장 상피 세포의 제조를 허용 추가 평가를 위해 (형광 및 발색 20) 현장 하이브리드에있다. 또한, 제조 방법 표본 수정 된 조직은 신속한 조직 고정하는 방법을 제공하는 동안 쉽게 사용 가능하고 상대적으로 저렴한 시약을 이용하여 단백질, DNA의 복구를 위해 수 있으며, RNA. 카메라 함께 생의 기술은 장 상피 세포의 조직 병리학 병리학, 분자 기능의 종합 평가 우수하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Stainless Steel Dissecting Kits</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25640-002</td>
			<td style="width:403px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Decloaking Chamber</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Syringe 10ml</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td>
			<td style="width:179px;">Simport</td>
			<td>M515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Manual Slide Staining Set</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish Green</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish White</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Oven</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td>6243</td>
			<td>for baking slides at 65 degree</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Methanol</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>281000ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Xylene</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Hydrogen peroxide 25% solution in water</td>
			<td style="width:179px;">ACROS</td>
			<td>202465000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10% bufered formalin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Bovine serum fraction V, heat shock</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Tween 20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gavage needle</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20068-624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Klf5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-22797</td>
			<td>Dilution 1: 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Chicken anti EGFP antibody</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB16901</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">CRM325B</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">M3R533L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Warp red chromogen kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">WR806 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Lgr5-EGFP/CreERT2 mice&#160;</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>008875&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Automated processor</td>
			<td style="width:179px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

면역 조직 화학 염색과 함께 스위스 압연 기술은 작거나 큰 장 조직의 포괄적 인 분석이 가능합니다. C57BL / 6 마우스 (그림 1)의 대장의 H &amp; E 염색의 예는 타당성의 그림과이 기술의 효과이다. 근위, 중간 및 말단도 1에 도시 된 바와 같이, 화상이 대장 모든 부분을 캡쳐 할 수있다. 따라서, 광범위한 조직 학적 평가를 허용한다. 스위스 롤과 크고 작은 창자 조직의 전체 길이를 캡처하는 능력은 이종 유전자 발현 마커 염색 또는 모욕 장 조직의 가변 응답 매우 유용하다. 예 Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스에서 EGFP 염색 패턴이다. 이 마우스 모델에서, EGFP의 발현에 의해 구동되고만 활발하게 증식 장 지하실에서 활성 Lgr5 프로모터,. 유전자의 발현 - (10 % 대략 5) 침투 또한이 마우스 모델은 낮은 것을 특징으로한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 장 조직의 EGFP 발현 패턴은 가변적이다. 따라서, 조직의 큰 뷰를 캡처하는 능력은 관심 영역을 식별하는 것을 돕는다. 여기에 설명 된 기술은 특히 multifluorophore 염색의 응용 프로그램과 함께 강력하다. 여기서는 스위스 롤 기술을 사용하여 제조 된 장 조직 trifluorophore 얼룩의 예를 보여준다. 본 연구의 주된 목적은 Lgr5 마커를 발현하는 장 줄기 세포의 유지에 Klf5의 역할을 조사 하였다. 따라서, 우리는 Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 Lgr5 양성 장 줄기 세포에서 Klf5을 삭제 날에 장 조직을 수집첫 번째 타목시펜 주사 후 14. 면역 조직 학적 분석을 위해, 조직은 수행 된 EGFP (Lgr5 마커) Klf5 및 기-67에 대해,이 논문에서 제시된 프로토콜 및 염색에 따라 제조 하였다. Lgr5-EGFP / CreER T2로 표시 제어 마우스, 두 조사 시점에서 Klf5 및 기-67 EGFP 양성 (파란색 화살표로 표시) 및 EGFP 음성 지하실 (흰색 화살표로 표시) 전시 공동 염색 모두에서 도 3D에 도시 된 바와 같이. 반면, Lgr5-EGFP / CreER T2에서 / Klf5는 FL / FL 소장 조직, Klf5는 / 기는-67 공동 염색에서 EGFP 양성 CBC 줄기 세포에서 누락 (파란색 화살표로 표시) 만 존재 한 EGFP 음성 도 3H에 도시 된 바와 같이, (흰색 화살표로 표시됨) 녹색 지하실 인접 지하실. 이것은 여기에 제시된 티슈 제조 기술을 염색 품질에 부정적인 영향을주지 않는 우수한 예이다. C57B의 L / 6 마우스. 표시됨에서 대장 그림 1. H &amp; E 염색은 대장의 전체 길이의 복합 이미지입니다. 검은 색과 오렌지색 선이 중간을 표시하고, 오렌지 라인과 오렌지 화살표 사이에 대장의 말단 부분을 표시 사이의 검은 색 화살표와 검은 선 사이의 부분은 근위 부분을 표시합니다. 스케일 바 = 1000 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54161/54161fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54161/54161fig2.jpg" /> Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 소장 그림 2. 면역 형광 염색. E의 합성 이미지Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 소장 섹션의 GFP (라벨 Lgr5 양성 상피 세포) 염색. Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스의 지하실에 Lgr5-에 postive 상피 세포 레이블 단백질 마커 (EGFP)의 이종 면역 형광 염색의 예. 핵 훽스트와 시각입니다. 흰색 화살표는 EGFP 발현에 대한 긍정적 인 지하실을 표시합니다. 스케일 바 = 500 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54161/54161fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54161/54161fig3.jpg" /> Lgr5-EGFP / CreER T2 그림 3. Klf5 삭제는 / Klf5는 FL / 플라이 마우스는 Lgr5-EGFP 양성 납골당에서 장기 지속. </st룽&gt; 이미지의 상하 세트는 Lgr5-EGFP / CreER T2 제어 및 Lgr5-EGFP / CreER T2 날에 / Klf5는 FL / FL 마우스를 각각 첫 번째 타목시펜 주사 후 십사일, 대표 소장 조직이다. 패널 AD는 동안은 Lgr5-EGFP / CreER T2의 패널 EH 쇼 염색 담당자 / Klf5는 FL / FL 마우스 Lgr5-EGFP / CreER T2 제어 마우스에서 수집 한 조직에서 염색의 대표입니다. 빨간색 패널 A와 E 표시 Klf5의 면역 염색; 패널 B와 F는 녹색 EGFP 염색을 보여; 노란색 패널 C와 G 쇼 기-67 염색; 및 패널 D와 H 쇼 Klf5, EGFP 및 기-67 얼룩의 이미지를 합병했다. 파란색 화살표가 녹색으로 지하실을 가리; 흰색 화살표는 병합 된 이미지에서 nongreen 지하실을 가리 킵니다. Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 FL / FL 마우스 만 EGFP 표지 CBC 셀 14 Klf5 장기 손실을 보였다. 스케일 바 = 50 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54161/54161fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses at JoVE.com

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

68.0K 조회수.  Stony Brook University School of Medicine.  정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다. 

비디오: Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

연구

생물학

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

보행자 공간 시간 활동 학습을위한 궤적 데이터 분석

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...