B.S.S.는 NIH 그랜트 (R01 AI076457)와 스토 니 브 룩 대학에서 제공 하는 자금에 의해 지원 됩니다. Z.Q.는 NIH에 의해 지원 됩니다 (K12 GM102778) 부여.

모든 동물 실험 국립 건강 연구소의 지침에 따라 실시 하 고 스토 니 브 룩 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
주: 절차를 수행 하기 전에 모든 승인을 부여 됩니다 확인 하십시오.
1. 솔루션 준비
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-글루타민, 페니실린/스, 그리고 gentamycin), 100 ×
	<ol>
<li>혼합 59.6 g HEPES (최종 500 mM) 14.6 g L-글루타민 (200 m m 최종), 1 × 106 U 페니실린 (2000 U/mL 최종), 1 g 스 (2 mg/mL 최종), 그리고 2.5 mg gentamicin (5 µ g/mL 최종). 추가 RPMI 1640 ~ 500 mL. 7.5 NaOH를 사용 하 여 pH를 조정 (조정, 전에 버퍼가 노란색/주황색 약 6.0 ph). 필터는 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 약 수 그리고 저장소 또는 1 달까지 4 ° C에서 최대 1 년 동안-20 ° C에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEPES-중 탄산염 버퍼, 10 배
	<ol>
<li>
혼합 23.8 g HEPES (최종 100 mM) 21 g NaHCO3 (최종 250 m m) 및 1000 mL에 물을 추가. HCl. 여과기와 pH 7.2 조정 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 실내 온도에 상점. 산도 시간이 지남에 변경 됩니다. 다시 정기적으로 pH를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미디어를 수확 (~ 1 병/2 마우스)
	<ol>
<li>500 ml RPMI 1640, 25 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (5% 최종), 그리고 5 mL 100 × HGPG 추가 합니다. 4 ° c.에서 최대 6 개월까지 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dithioerythritol (DTE) 솔루션 (40 mL/작은 내장)
	<ol>
<li>믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca2+-Mg2+-무료, 50 mL 10 × HEPES-중 탄산염 버퍼, 그리고 50 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (최종 10%). 350ml H2O와 15.4 mg dithioerythritol/100 mL (최종 1 m m)를 추가 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (50 mL/작은 내장)
	<ol>
<li>믹스 50 mL 10 × 행 크 스 균형된 소금 솔루션, Ca2+-Mg2+-5 mL 100 × HGPG 무료. 445 mL H2o. 추가 260 µ L 0.5 M EDTA를 추가/100 mL (최종 1.3 m m). 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
콜라 솔루션 (30 mL/LP)
	<ol>
<li>500 mL RPMI, 50 mL FBS 추가 (10 %FBS 최종) 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0.5 M MgCl2 (최종 1 mM) 및 1 mL 0.5 M CaCl2 (최종 1 m m). 콜라를 추가 내가 (최종 100 U/mL)을 입력 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
밀도 그라데이션 (DG) 솔루션
	<ol>
<li>90 mL DG 재고 솔루션을 혼합 하 여 1 × DG 재고 솔루션을 준비 ( 테이블의 자료를 참조) 10 × PBS의 10 mL와 함께. 4 ° c.에 살 균 유지</li>
		<li>1 × DG 재고 솔루션 및 56 mL RPMI 1640 44 mL를 혼합 하 여 44 %DG 솔루션 (8 mL/IEL, 8 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
		<li>1 × DG 재고 솔루션 및 33 mL RPMI 1640 67 mL를 혼합 하 여 67 %DG 솔루션 (5 mL/IEL, 5 mL/LP)를 준비 합니다. 사용 하기 전에이 신선한 준비.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mesenteric 림프절, 내장, 절연 및 파이어의 패치
<ol><li>마 취 법 이산화 탄소와 2 차 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 마우스를 안락사 그것의 뒤에 마우스를 놓고 70% 에탄올 스프레이 합니다. 중간 절 개를가 위를 사용 하 여 하 고 복 벽 복 막 구멍을 노출 하 고 피부를 엽니다.</li>
	<li>caecum 찾아서를 부드럽게는 caecum 집게를 사용 하 여. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 소장 결 맞춰집니다 전체 MLN 체인 노출 오른쪽으로 이동. 참고: 내장의 체인 및 임 파 액 배수 장치는 이전 mesenteric 림프절의 지도13을그려져 있습니다.</li>
	<li>체인, 맹에 가까운 있는 하단 노드를 식별 합니다. 집게의 한 세트를 사용 하 여 mesentery/지방 주위를 파악 하 고 부드럽게 제거 MLN 체인 하단에서 상단에 tweezing 집게의 또 다른 세트로 림프절 주위에서 지방으로.</li>
	<li>베스트 미디어를 적신 종이 타월에 MLN 체인을 하다. 종이 타워에 체인을 압 연 하 고 집게의 두 세트와 지방을 미루어 여 mesentery/지방을 제거 합니다. 장소 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어 MLN. 참고: 노드 (i) 직접 처리 실망입니다. 대신, 그들의 주위 mesentery/지방 파악. (ii) 세포 생존 능력을 개선 하기 위해 가능한 많은 mesentery/지방 제거에 중요 하다.</li>
	<li>소장 pyloric 괄약근 아래와 위를 사용 하 여 맹 위를 잘라. 당겨 내장 천천히는 회장에서 십이지 집게의 1 세트를 사용 하 여 연결 된 mesentery/집게의 또 다른 세트를 사용 하 여 지방을 제거 하는 동안에.</li>
	<li>베스트 미디어를 적신 종이 타월에 소장을 놓고 집게의 두 세트와 함께 모든 나머지 mesentery/지방에서 애타게 합니다. 참고: (i) 가능한 최적의 셀 생산량 및 생존 능력에 대 한 많은 mesentery/지방 질을 제거 해야 합니다. (ii) 소장이 다음 단계에 걸쳐 주기적으로 수확 미디어를 적용 하 여 습 유지.</li>
	<li>Peyer의 패치 곡선가 위 소장에서 그들을 제거 하 여 수집 합니다. 해 범위 또는 (초보자); 필요한 경우 돋보기를 사용 하 여 대부분 Peyer의 패치는 훈련 된 눈에 표시 되어야 합니다. 작은 창 자에서 5-11 (일반) Peyer의 패치를 수집 합니다. 나중 격리 단계에 대 한 차가운 수확 미디어에 장소 파이어 패치. 참고: 파이어의 패치는 작은, 주로 mesentery 첨부 파일의 라인 반대 장 외벽에 bulges 라운드.</li>
	<li>회장으로 십이지에서 집게와 부드럽게 슬라이드의 편평한 측을 사용 하 여 지저분한 콘텐츠 및 점액을 추방. 대부분 점액의 제거를 한 번 반복 합니다. 참고: 점액의 불완전 한 제거 세포 생존 능력을 감소 하 고 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부드럽게 villi 스트립 또는 지하실 멤브레인의 손상을 방지 하려면 소장 슬라이드를 해야 합니다.</li>
	<li>좋은 위를 사용 하 여 한 지점에 무딘 엔드와, 소장에 무뚝뚝한 끝을 삽입 하 고 자르면 소장 십이지에서 경도 회장에. 옆으로 ~ 2 cm 조각으로 열린된 소장을 잘라. 25 mL 찬 수확 미디어 나중 격리 단계 50 mL 원뿔 튜브에 장 조각을 놓으십시오. 참고: 미디어를 적신가 위 유지 소장을 통해 여유롭게 슬라이드 그들 도움이 됩니다.</li>
</ol>3. 절연 유도 사이트에서 세포의
<ol><li>부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 여 MLN에서 세포를 분리. 셀 스 트레이너 찬 수확 미디어의 5 mL로 씻는 다.</li>
	<li>펠 릿 MLN-4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 참고: 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 제거 중에 발생 한 출혈 하는 경우 적혈구를 제거 하려면 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>37 ° C와 30 분 동안 220 rpm에서 5 mL prewarmed 콜라 솔루션을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 Peyer의 패치를 배양 하 여 Peyer의 헝겊 조각에서 세포를 분리.</li>
	<li>15 대 한 소용돌이에서 최대 설정 및 필터 s 소화 조직과 상쾌한 50 mL 원뿔 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해. 부드럽게 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각을 해리 하 고 차가운 수확 미디어의 5 mL와 함께 셀 여과기를 세척.</li>
	<li>Peyer의 패치 셀 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 여 작은 고 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 참고: 파이어 패치 절연의 일부 오염 lamina propria 세포, intraepithelial 세포를 할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 소장에서 Intraepithelial 세포의 고립
<ol><li>반전 튜브 10 배, 정착, 장 조각 하 고는 상쾌한을 붓는 하 여 조각을 소장의 세 번 찬 수확 미디어의 25 mL 씻으십시오. 참고: 조직 조각 쉽게 튜브의 바닥에 침전 해야 한다. 그들이 경우에, 그것은 너무 많은 mesentery/지방 계속 연결 되어 또는 그들은 공기 방울이와 관련 된 표시.</li>
	<li>포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 볶음 bar가 포함 된 50 mL 시 삼각 flask에 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송.</li>
	<li>최대 설정 10 미 전송는 상쾌한 새로운 50 mL 원뿔 관으로 원래 관에서 조직 조각을 계속 주의 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 튜브 소용돌이. 상쾌한; 버리지 마십시오 상쾌한 intraepithelial 세포를 포함 되어 있습니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 10 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>포함 된 내장 조각 50 mL 원뿔 튜브에 prewarmed DTE 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 다시 50 mL 시 삼각 플라스 크 볶음 bar가 포함 된 전송. 37 ° C에서 약동 하 고 20 분에 대 한 자력에 220 rpm를 사용 하 여 큰 자석 플라스 크의 외부에 저 어 바 보유 조직과 솔루션 50 mL 원뿔 튜브 다시 전송. 참고: DTE는 풍요롭게 하는 intraepithelial 세포는 감소 시키는 대리인.</li>
	<li>소용돌이에 최대 설정 10 미 전송은 상쾌한 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 포함 하는 셀 (4.3 단계)에서 첫 번째 DTE 치료의 상쾌한에서 이전 관으로 관. 참고: 나머지 장 조각은 lamina propria에서 세포를 분리 하는 데 사용 됩니다. 품질 관리: 조직의 조각은 제거 고 확인 조직학 상피 세포 존재 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 상쾌한 centrifuging 펠 릿 셀 실 온 (RT)에서 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. RT 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 브레이크를 사용 하지 않고 20 분 RT에서 1600 × g에서 원심. 참고: 튜브 튜브 벽에 튀어나와에서 세포를 방지 하기 위해 소 혈 청으로 pretreated 될 수 있습니다.</li>
	<li>Note는 44% ~ 67% 인터페이스에서 밴드 (버 피 코트)를 형성 하는 실행 가능한 세포, 죽은 세포와 상피 세포 일부에 그라데이션, 상단의 mucoid 영화 있고 붉은 혈액 세포 펠 릿에. 진공 포부에 의해 인터페이스의 ~ 2 cm 내에서 그라데이션 상위 레이어를 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에 버 피 코트를 수확 하 고 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.</li>
</ol>5. 소장에서 Lamina Propria 세포의 고립
<ol><li>남은 장 조각을 포함 하는 플라스 크에 prewarmed EDTA 솔루션의 25 mL를 추가 하 여 장 조직 조각에서 상피 세포를 제거 합니다. 37 ° C와 30 분 대 한 자력에 220 rpm에서 플라스 크 저 어 저 어 바 그리고 신중 하 게 플라스 크 내의 장 조각을 유지 하면서는 상쾌한 삭제 플라스 크의 외부에 큰 자석을 사용 합니다. 참고: (i) EDTA 칼슘 chelator 칼슘 종속 연결 대상 장 상피 세포의 분리를 촉진 하는. (ii) 상쾌한 흐린 이어야 하며 그들의 컬렉션을 원하는 경우 IEC를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5.1 단계를 반복 합니다. 참고:는 상쾌한 덜 흐린이 부 화에 따라 이어야 한다. 품질 관리: 조직의 조각 제거 고 확인 조직학 장 상피 세포를 제거 하 고 지하실 막이 손상 될 수 있습니다. Cytometry 확인 하는 상쾌한에서 샘플 평가할 수도 있습니다 그 백혈구 (CD45+ 세포) 결 석.</li>
	<li>플라스 크를 RT 수확 미디어의 50 mL를 추가 합니다. 자석으로 간단히 저 어 줍니다. 장 조각 정착 하 고 신중 하 게는 상쾌한을 삭제 하자. 참고:이 단계는 EDTA은 콜라 콜라 함수에 대 한 중요 한 칼슘 킬레이트 화 여 서 콜라 소화 전에 EDTA의 제거를 보장 합니다.</li>
	<li>Prewarmed 콜라 솔루션의 30 mL 플라스 크에 추가 하 고 45 분 자력에 37 ° C 그리고 220 rpm에서 장 조각 저 어.</li>
	<li>전송 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 하 여 조직 및 50 mL 원뿔 튜브에 상쾌한 소화. 부드럽게 필터를 통해 매 시에 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 나머지 조직 조각 해리. 찬 수확 미디어의 10 mL와 함께 필터를 세척.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 주위 온도 44 %DG 솔루션의 8 ml에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>17 mm ø x 100으로 전송 8 mL 44 %DG 솔루션/세포 현 탁 액은 mm 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브 스타일. 주위 온도 67 %DG 솔루션의 5 mL와 언더레이. 실내 온도 아무 브레이크 20 분 동안 1600 × g에서 그라디언트 원심</li>
	<li>진공 포부에 의해 위에 지방 층을 제거 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스와 40 mL 찬 수확 미디어를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 버 피 코트를 수확.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g에서 centrifuging 펠 릿 셀 1 mL 찬 수확 미디어에 셀 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루 제외를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

자세한 프로토콜 유도 (MLN와 PP) 점 막 세포는 창 자에서 격리에 대 한 제시와 이펙터 (LP 및 IEL 구획) 사이트. 프로토콜 균형 입력 (시간) 및 출력 (생존 및 수율) 결과 및 생산성을 극대화 하기 위해 개발 되었습니다. 프로토콜은 또한 LP와 IEL 구획 사이 최소 상호 compartmental 오염을 보장합니다.
마우스 소장에서 면역 세포의 고립에 대 한 여러 가지 프로토콜 되었습니다 게시3,,45,,67. 이러한 프로토콜의 대부분 LP에서 면역 세포를 고립 시키기에 초점. 장 상피 LP 외부 환경에 직접 노출 되 고 세포의 독특한 구성의 구성에서 뚜렷한 구획 이다. 이러한 구획 및 관계에서 일어나는 면역 반응의 독특한 측면을 이해 하는 동시에 독특한 장 구획을 검사 하 여 장내 면역 기능에 대 한 더 많은 글로벌 분석 최근 접근 모색 사이 그들을. 따라서, 이러한 모든 구획에서 면역 세포의 고립에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜은 원한다. 두 DTE 치료는을 충분 한 > IEL 및 일부 IEC의 95%. EDTA 칼슘 종속 연결 대상 고 IEC 분리 효율적입니다. 따라서, 이후 EDTA 치료에서 상쾌한 주로 IEC 구성 됩니다. 세포의 아주 작은 수는 EDTA 치료; 후에 상쾌한에서 찾을 수 있습니다. 그러나, 약 20-fold 더 많은 세포는 DTE 분수에서 얻을 수 있습니다. 또한, EDTA 치료에서 세포 villi와 토 굴에서 LP 오염 제안 IEL와 LP 세포 (그림 4)의 혼합된 인구를 닮은 손상. 따라서,이 프로토콜에 IEL 수집 됩니다 EDTA 치료 전에 DTE 치료에서 간 구획 오염 최소화 하 여 순도 극대화. 다른 프로토콜 사용 하 여 순차 dithiothreitol (DTT)-EDTA 치료 또는 IEL5,,67의 격리에 대 한 결합 된 DTT EDTA 치료. DTT DTE의 epimer 이며 둘 다 감소 시키는 대리인으로 행동. 이러한 프로토콜에 DTT만 점액을 제거 하 보고 되 하 고 EDTA IEL를 격리 하는 데 사용 됩니다. DTT와 DTE의 효과 직접 비교 하지, 하지만 IEL DTE 치료 또는 결합 된 DTE EDTA 치료 후 평가 했다. 아니나 다를까, 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 준비 (그림 5)에서 IEC 오염 증가 하 고 IEC의 많은 수의 존재는 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후 IEL 수확량 감소. 일부 villi 및 지하실 EDTA를 손상 시킬 수, 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 준비에 lp로 세포의 오염 또는 LP 격리에서 lp로 세포의 손실에도 발생할 수 있습니다. 또한,로 > IEL의 95%는 DTE 분수에서 고립 되었다, 별도 DTE와 EDTA 치료 선호 됩니다. 일부 프로토콜은 면역 세포6풍부 하 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하지 않고 세포를 격리 합니다. 밀도 그라데이션 원심 추가 시간이 걸립니다 그리고 일부 셀의 손실이 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 죽은 세포, 상피 세포와 점액, 매우 풍부한 림프 구 인구 (그림 6), 세포의 작은 인구의 탐지를 강화 하는 데 도움이 하 고 실질적으로 획득 시간 흐름을 감소 선도 제거 cytometry입니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 되 식 하위 집합7;의 변경된 비율을 보고 했다 그러나, 림프 톨 부분 집합 구성 정상 나타납니다. 특히 IEL의 고립을 위한 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 수행 도움이 됩니다. 전반적으로, LP 및 IEL를 포함 하 여 최소한의 크로스 compartmental 오염 장 조직 모두에서 높은 농축 하 고 최적의 가능한 세포를 분리 하는 완전 한 프로토콜 제공 됩니다.
상당한 시간과 정성 준비 사이 오염 제한 조직 격리 단계 동안 이동 해야. PP의 불완전 한 제거 크게 LP 세포를 왜곡 수 있습니다. ILF LP 준비 오염 또한 수 있습니다. 그러나, ILF 맨 눈으로 볼 수 없습니다 및 따라서 제거할 수 없습니다 수술 소화 전에. 다른 마우스 긴장 다른 수가 ILF14마우스 긴장 사이 LP 세포의 가변 구성에 크게 기여할 수 있다. 점액을 제거, 지하실 멤브레인와 LP, IEL의 LP 오염 발생할 수 있는 손상을 방지 하려면 소장을 부드럽게 밀어 해야 합니다. 오염에의 한 표시 IEL 준비에서 B 세포의 큰 숫자의 존재입니다. IEL 포함 몇 B 세포 (~ 1% 이하의), LPL 마우스 스트레인에 따라 최대 60 %B 셀을 가질 수 있습니다. CD19 하지만 하지 B220 장의 T 세포 수 또한 B22015표현으로 LP 및 IEL 구획, B 셀을 식별 하기 위해 사용 되어야 한다. 또한, 많은 장 T 세포 전통적인 대 식 세포와 CD11b 등 CD11c, 각각16DC 마커 표현 수 있습니다. 따라서, 적절 한 덤프 전략 게이팅 적절 한 분석을 위해 활용 합니다.
단계는 연구자의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 기계적 소화는 정상 상태에서 PP 림프 구 분리에 대 한 충분 한 수 있습니다 또는 콜라 소화 림프절의 염증 동안 백혈구의 일부 하위 집합의 절연을 촉진 수 있습니다. 콜라 사용 유형의 세포 표면 마커 식 생존 및 LP 림프 톨5,17의 순도에 상당한 영향을 있을 수 있습니다. 소장 콜라 소화, 셀 생산량을 증가 시킬 수 있습니다에 대 한 작은 조각으로 잘라 수 있습니다. 그러나, 그것은 또한 생존 능력을 감소 시킨다. 콜라와 함께 부 화 시간 라이브 셀의 최대 복구로 이어지는 세포 죽음을 최소화 하면서 수익률을 극대화 하기 위해 최적화 될 수 있습니다. 다른 실험실 약간 다른 밀도 그라디언트를 사용 하 여 세포를 분리. 잘 설립 44% / 67% 밀도 그라데이션 프로토콜 여기 표시 됩니다. 연구원은 가장 그들의 개인적인 필요에 맞게 서로 다른 밀도 기울기를 테스트할 수 있습니다. 세포의 큰 번호를 원하는 경우 두 개의 소장 DTE 치료, EDTA 및 콜라 소화에 대 한 결합할 수 있습니다. 두 개 이상의 창 자를 극히 드문 이벤트를 검토를 위해 필요한 경우 다음이 좋습니다 단일 셀 정지 격리 후 풀링됩니다.
분리 된 림프 톨 추가 phenotypic, 기능, 및 게놈 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 흐름 cytometric 분석을 수행할 때 그것은 매우 권장 항상 사용 하는 생존 염료 안티 CD45 항 체 분석 향상 시킬 크게 것입니다 비 조 혈 세포, 죽은 세포를 제외. 순수한 림프 구 인구는 필요한 경우, CD45 정렬 셀+ 셀 선택의 다른 표시가 함께 수행할 수 있습니다. 안티 CD8α 코팅 접시에 패닝도 대부분이이 T의 세포가 특급 CD8α로 IEL 준비에서 순수 T 세포를 분리 사용할 수 있습니다. IEL 성장을 억제할 수 있는 상피 세포를 오염 하는으로 이동 또는 세포 분류는 IEL의 문화에 대 한 일반적으로 필요 합니다. 순진한 splenocytes 같은 피더 세포 IEL 생존 문화에서 홍보에 추가할 수 있습니다. 지류 사용 하는 경우 그것은 구별 인구 congenically 일치 하지 않는 셀을 활용 하는 것이 중요입니다. 페니실린, 스 및 gentamicin 수확 미디어 포함으로 세균성 오염 거의 이러한 단기 기능 연구에서 문제입니다. 더하여, 수많은 세척 단계 및 밀도 그라데이션 원심 대부분의 박테리아를 제거합니다.
격리 프로세스 시간이 소요 하 고 최적의 결과 대 한 배려, 정밀도 속도의 균형을 요구. 마우스 희생 사이 시간을 최소화 하 고 세포 생존 능력 및 수율을 최대화 하기 위해 단일 세포 현 탁 액을 취득 하면서 각 단계의 적절 한 조작 되도록 충분 한 시간을 보냈다 해야 합니다. 이것은 또한 높은 생존 능력 및 수율 세포 격리에 일관성을 얻기 위해 노력 하는 초보자를 위한 병목은 섬세 한 균형 이다. 계산된 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 마우스 안락사에서 시작 하는 전체 격리 프로세스는 경험 있는 연구원 약 8 h를 8 쥐에 대 한 걸립니다. 그것은 고품질 및 재현성 결과 생성 하는 이상 8 쥐에 대 한 지원을 받을 것이 좋습니다. 그것은 격리 절차17와 관련 된 인공 변경으로 이어질 수 있습니다 이러한 조직에서 비장, 혈액, 또는 광범위 한 외피로 다른 림프 조직에서 세포와 세포를 비교 하는 때 주의 사용 해야 합니다. 마찬가지로 치료 림프 조직에 LP 및 IEL 인구의 일상적인 비교 장 조직에서 림프 구 분리 동안 관심의 마커는 변조 여부 평가 것입니다. 림프 조직에서 RNA 프로 파일 창에서 비교할 때 비슷한 문제가 주요 관심사도 있습니다.

위장 (GI)는 많은 주름 돌출 외부 환경과 내부 신체 분리 큰 인터페이스를 나타내는 있다. 장의 면역 시스템 기 관의 장벽 기능 유지에 필수적인 역할을 한다. 그것은 끊임없이 식이 항, 공생 박테리아 및 병원 성 미생물에 노출 됩니다. 이와 같이, 음식 항 원 및 공생 박테리아 관용 있어야 합니다 빠르게 enteropathogenic 미생물1에 대 한 효과적인 면역 응답을 생성 하는 능력을 유지 하면서. 장의 면역 시스템 해부학 어디 순진한 림프 톨 항 원 장 점 막에서 항 원을 운반 하는 세포에 의해 활성화 됩니다, 유도 사이트 및 이펙터 사이트, 활성화 된 림프 톨 특정 발휘로 분할 될 수 있다 이펙터 기능2. 유도 사이트 구성 조직된 림프 구조에 Peyer의 패치 (PP)의 전문된 M 세포와 지역 배수 mesenteric 림프절 (MLN)의 행동을 통해 직접 창 자 루멘을 조사. 이펙터 사이트 lamina propria (LP), 지하실 멤브레인와 장 상피 세포, intraepithelial 세포 (IEL)를 포함 하는 지하실 멤브레인 위에 있는 단일 셀 레이어 아래 결합 조직으로 구성 됩니다. 세포는 적응 면역의 주요 플레이어는 감염 및 암에 대 한 보호를 중재 하 고 염증 성 질병에 immunopathology에도 기여할 수 있습니다. 그것은 중요 한 고이 고유에 세포를 공부 하는 관련성이 높은 해 부 점 막 구획을 더 나은 이해 그들의 유도 및 이펙터 기능.
소장에 발생 하는 면역 이벤트를 탐험 하는 수 사관의 수는 가속으로 비교적 간단 하 고 통합 프로토콜 이러한 구획에서 세포의 고립에 대 한 필요 합니다. 여러 연구 그룹 출판 마우스 작은 창 자 구획3,,45,6,7에서에서 면역 세포를 분리 하는 데 몇 가지 유사한 프로세스를 공유 하는 프로토콜 . 그러나, 개별 프로토콜의 초점에 따라 그들 가운데 몇 가지 기술적 차이가 있습니다. 예를 들어 LP에서 면역 세포를 분리 하는에 초점을 맞추고, 한 프로토콜 세포 생존 능력, 세포 표면 마커 식, 그리고 고립 된 면역 세포5의 구성에 다양 한 효소 소화에 미치는 영향을 검사 합니다. 다른 프로토콜 밀도 원심 분리6없이 세포의 고립에 대 한 신속 하 고 재현성 방법을 강조 한다. 마지막으로, 특정 프로토콜 또한 작은 창7의 다른 조직 층에서 단 식 세포를 고립 시키기 위해 존재 한다. 여기, 소장의 MLN, PP, LP, 및 IEL 구획에서 림프 구 인구의 순차적 격리를 허용 하는 높은 재현 프로토콜 제공 됩니다.
우리는 크게 다른 장의 구획에서 오염 물질의 무료 LP 및 IEL 구획에서 높게 순화 된 인구를 고립 시키기에 초점. 이 널리 사용 프로토콜 생산 허용 시간 제약4,8,9,10,,1112에서 극대로 순수 하 고 실행 가능한 세포의 높은 수확량. 이 프로토콜 또한 타고 난 기회가 뚜렷한 구획에 세포 공부를 수 있도록 최소한의 크로스 compartmental 오염 LP 및 IEL 구획에서 림프 톨의 격리를 보장 합니다. 고립 된 세포 흐름 cytometric 분석 또는 기능 분석 같은 추가 조작 대상이 될 수 있습니다. 이 프로토콜 성공적으로 적용 된 세포의 고립에 마우스 작은 창 자와 콜론에서 Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 페스트 pseudotuberculosis 등 세균 감염 시 감염 그리고 화학 및 병원 체 유발 장 염 등 염증 성 조건. 이 프로토콜은 수지상 세포, 대 식 세포, 호 중구, 및 monocytes 마우스 작은 창 자와 콜론에서 같은 타고 난 면역 세포를 분리 하도 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

장의 면역 시스템 enteropathogenic에 대 한 효과적인 면역 응답을 설치 하는 동안 식이 항 및 공생 박테리아 허용 응답을 생성 하 여 위장의 장벽 기능 유지에 중요 한 역 미생물입니다. 또한, 그것은 분명 지역 장 면역 먼 및 조직의 면역에 깊은 영향을가지고 되었다. 따라서, 그것은 장 면역 반응을 유도 하는 어떻게 무엇 이며 응답의 면역학 결과 공부 하는 것이 중요입니다. 여기, 상세한 프로토콜 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절 같은 소장 유도 사이트와 lamina propria 같은 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 설명 및 장 상피입니다. 이 기술은 최적의 순도 및 생존 능력 허용 시간 범위 내에서 최소한의 상호 compartmental 오염 작은 창 자 조직에서 세포의 많은 수의 격리를 보장합니다. 세포 및 장 조직에서 다른 면역 세포 분리 기술 기능 위장 감염, 암, 염증 성 질환에 면역 반응의 이해를 수 있습니다.

프로토콜의 도식 표현 묘사 된다 (그림 1). 림프 톨 유도 장 점 막 및 이펙터 사이트 내에서 명백 하 게 구성 됩니다. 파이어의 패치 (PP) 및 mesenteric 림프절 (MLN) 포함에 잘 조직 된 T 세포 및 B 세포 모 낭, 림프 톨 장 상피 세포 더 만들어진다 배포 되는 포함. Lamina propria (LP)에 브러시가 분산된 세포와 세포 고립된 림프 낭 (ILF)과 cryptopatches 같은 조직된 림프 구조 내에 포함 된 포함 되어 있습니다. 각 장의 면역 구획은 또한 림프 톨 부분 집합 (그림 2)의 독특한 구성으로 대표. MLN 주로 PP 세포는 주로 B 세포 (~ 80%) αβ T 세포 (~ 70%)의 구성입니다. Lp로 림프 구 구성은 크게 긴장 의존 하지만 주로 αβ T 세포와 B 세포의 구성 이다. 다른 장의 구획 구분, 림프 톨 상피에 거주 하는 주로 γ T 세포 (~ 60%)와 αβ 본질적으로 아무 B 세포와 T 세포. Αβ T 세포 부분 집합의 고유한 비율 또한 내장의 독특한 해 부 위치에서 존재 한다. LP에 αβ T 세포는 주로 CD4+ T 세포 (~ 70%), CD8α 동안+ T 세포 (~ 85%) intraepithelial 세포 (IEL) 구획에 predominate. CD8α+ LP 및 IEL 구획 내 αβ T 세포 표현 CD8αα homodimer 또는 CD8αβ heterodimer 반면 유도 사이트 CD8α+ αβ T 세포 주로 표현 CD8αβ heterodimer (그림 3). IEL 구획에서 γ T 세포의 대다수는 또한 CD8α, 익스프레스 γ T 세포 MLN 부족 CD8α에서에서 발견 하는 동안 (그림 3). 일반에 림프 톨 부분 집합의 구성 마우스 긴장 사이 다를 수 있으며 연령이 나 질병으로 변경 될 수 있습니다. 따라서, 정상 상태에서 장 점 막에서 림프 구 인구의 주의 깊은 분석 실험 조작에 대 한 활용 배경 스트레인에서 수행 되어야 합니다.
셀 수율은 긴장과 쥐, 및 실험 조건 사용의 나이 따라 크게 달라질 수 있습니다. 단일, 살아있는 세포는 hemocytometer 또는 trypan 블루 제외를 사용 하 여 자동된 셀 카운팅 기계에 계산 될 수 있습니다. 림프 톨의 수로 계산 됩니다: 세포 수 × CD45+ 세포 (%) × 게이트 3 게이트 4 (그림 2)에서 세포 (%). 약 15 × 106 MLN 림프 톨, 5-10 × 106 PP 세포, 2-5 × 106 LP 림프 톨, 및 3-6 × 106 IEL 8-에 12 주 된 순진한 C57Bl/6 또는 Balb/c 마우스에서 얻어질 수 있다. 또는 세 구슬 흐름 기반 셀 손실 착 과정에서 발생 하는 경고와 세포 인구를 척도를 사용할 수 있습니다. 궁극적으로, 일관성 기법 계산에 실험에서 적절 한 비교를 만들 수 있도록 실험실 내에서 유지 되어야 합니다.
이 프로토콜에 DTE 치료는 매우 풍부한 림프 톨의 최적의 절연에 대 한 IEC 제거를 EDTA 치료 뒤 IEL를 풍부 하 게 사용 됩니다. 두 DTE 치료는을 충분 한 > IEL의 95%. 세포의 아주 작은 수는 또한 EDTA 치료에서 찾을 수 있습니다. 이러한 lymphocytes 닮은 IEL와 LP 림프 톨 (그림 4)의 혼합물. DTE 치료와 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 격리를 비교도 수행 되었습니다. 결합 된 DTE EDTA 치료 IEL 준비 (그림 5)에서 IEC 오염 증가 하 고 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후 라이브 면역 세포의 최종 수확량을 감소 시킨다. 밀도 그라데이션 원심 장의 구획에서 세포를 분리 하는 것이 좋습니다. 그것은 죽은 세포, 많은 상피 세포와 점액, 매우 풍부한 림프 톨의 홍보를 제거 하 고 대폭 감소 하는 cytometry 수집 시간 (그림 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig1.jpg"> 그림 1 . 격리 프로토콜의 흐름 차트. DTE, dithioerythritol EDTA, ethylenediaminetetraacetic 산 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig2.jpg"> 그림 2 . 장 조직에서 림프 구 인구에 대 한 전략을 게이팅 cytometry. 단일 셀 정지 mesenteric 림프절 (MLN), lamina propria (LP), Peyer의 패치 (PP) 및 intraepithelial 세포 (IEL) 구획에서 준비 했다 고칠 수 생존 염료와 스테인드 (예: 라이브/죽은) 다음 항 체 형광 표시: 조 혈 모 세포, B 세포에 대 한 CD19, T에 대 한 CD3ε의 식별을 위해 CD45 세포, T 세포 수용 체 (TCR) β αβ T 세포, γ T 셀, CD8α에 대 한 CD8α TCRδ+ αβ T 세포와 CD4에 대 한 CD4+ αβ T 세포. 문 0 앞으로 보여준 분산형 (FSC) A/사이드 분산형 (SSC)-A 속성. 게이트 1 단일 셀을 식별합니다. 게이트 2 라이브 셀을 식별합니다. 게이트 3 조 혈 모 세포를 식별합니다. 게이트 4 확인-A-A/SSC FSC 속성에 따라 림프 톨. 문 5 T 세포와 B 세포를 식별합니다. 6 확인 된 αβ T 세포와 총 T 세포 중 γ T 세포 게이트. 문 7 확인 CD8α+ 와 CD4+ T αβ T 세포 인구에서 세포. 모조 색상 플롯 내에서 (빨간 글꼴)에 비율 이전 부모의 인구 가운데 표시 된 게이트 내의 셀의 주파수에 대응. 0 게이트와 게이트 1 총 이벤트를 표시합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig3.jpg"> 그림 3 . 표현 형 ofCD8α+ αβ T 세포, γ T 장 조직에서 세포. CD8β CD8α에 의해의 표현+ αβ T 세포와 CD8α γ T 세포에 의해 표현 묘사 된다. 히스토그램에서 백분율 (빨간 글꼴)에 표시 된 부모의 인구 사이 표시 된 마커를 표현 하는 셀의 주파수에 대응. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig4.jpg"> 그림 4 . DTE, EDTA, 그리고 콜라 치료에서 세포의 구성. 보호자 제어 전략은 그림 2에서 같이. 문 5 T 세포와 B 세포를 식별합니다. 6 확인 된 αβ T 세포와 총 T 세포 중 γ T 세포 게이트. 문 7 확인 CD8α+ 와 CD4+ T αβ T 세포 인구에서 세포. 모조 색상 플롯 내에서 (빨간 글꼴)에 비율 이전 부모의 인구 가운데 표시 된 게이트 내의 셀의 주파수에 대응. EDTA 격리에서 림프 톨 DTE와 콜라 치료에서 각각 격리 IEL와 LP 림프 톨의 혼합물을 닮은 곰. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig5.jpg"> 그림 5 . DTE 취급과 IEL의 격리에 대 한 결합 된 DTE EDTA 치료의 비교. DTE 치료는이 프로토콜에 따라 수행 되었다. IEL 후 DTE 치료 및 EDTA 치료 전에 수집 했다. 이 프로토콜에 사용 되는 동일한 농도에서 하지만 동시에 결합 된 DTE EDTA 치료 수행 되었다. FSC-A/SSC-A 속성, 생존 능력 및 CD45 비율+ 조 혈 모 세포가 표시 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig6.jpg"> 그림 6 . IEL LP 림프 구 준비의 순수성에 밀도 그라데이션 원심의 영향. 이 프로토콜에 따라 고립 된 단일 셀 정지 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 복종 또는 직접 cytometry에 의해 분석. FSC-A/SSC-A 속성, 생존 능력 및 CD45 비율+ 조 혈 모 세포가 표시 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

isolating-lymphocytes-from-the-mouse-small-intestinal-immune-system

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.3K 조회수.  Stony Brook University. 여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

비디오: Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;