B.S.S. es apoyado por subvenciones de NIH (R01 AI076457) y fondos aportados por la Universidad de Stony Brook. Z.Q. es apoyado por los NIH grant (K12 GM102778).

Todos los experimentos en animales eran realizados de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de salud y aprobados por el pedregoso del arroyo Universidad institucional Animal cuidado y uso.
Nota: Asegúrese de que todas las aprobaciones se conceden antes de realizar procedimientos.
1. preparación de la solución
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y gentamicina), 100 ×
	<ol>
<li>Mezclar 59,6 g HEPES (500 mM final), 14,6 g de L-glutamina 200 mM (final), 1 × 106 U penicilina (2.000 U/mL final), la estreptomicina 1 g (2 mg/mL final) y gentamicina 2.5 mg (5 μg/mL final). Añadir RPMI 1640 a 500 mL. Ajustar el pH a 7.5 con NaOH (antes del ajuste, el búfer es amarillo y naranja con un pH alrededor de 6.0). Filtro de esterilización usando un filtro de 0.45 μm. Alícuota y conservar a-20 ° C hasta por 1 año o a 4 ° C durante 1 mes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De tampón HEPES-bicarbonato, 10 x
	<ol>
<li>
23,8 g HEPES (100 mM final), de la mezcla 21 g NaHCO3 (250 mM final) y añadir agua a 1000 mL. Ajustar pH a 7.2 con HCl. filtro esterilice usando un filtro de 0.45 μm. Almacenar a temperatura ambiente. El pH cambia con el tiempo. Volver a ajustar periódicamente el pH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cosecha media (~ ratones botella 1/2)
	<ol>
<li>A 500 mL de RPMI 1640, añadir 25 mL inactivadas por calor suero bovino fetal (5% final) y 5 mL 100 × HGPG. Almacenar hasta 6 meses a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución de Dithioerythritol (DTE) (40 mL/pequeña del intestino)
	<ol>
<li>Mezcle 50 mL 10 × solución salina equilibrada de Hanks, Ca2+- y Mg2+-gratis, 50 mL 10 × bicarbonato de HEPES buffer y 50 mL inactivadas por calor suero fetal bovino (10% final). Añadir 350 mL H2O y 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM final). Preparar esta fresca antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución de ácido (EDTA) etilendiaminotetraacético (50 mL/pequeña del intestino)
	<ol>
<li>Mezcle 50 mL 10 × solución salina equilibrada de Hanks, Ca2+- y Mg2+-libre con 5 mL 100 × HGPG. Añadir 445 mL H2O. Añadir 260 μl EDTA de 0,5 M/100 mL (1,3 mM final). Preparar esta fresca antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solución de colagenasa (30 mL/LP)
	<ol>
<li>A 500 mL RPMI, añadir 50 mL de SFB (10% FBS final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M de MgCl2 (final de 1 mM) y 1 mL 0.5 M CaCl2 (final de 1 mM). Añadir colagenasa, tipo I (100 U/mL final). Preparar esta fresca antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluciones de (DG) gradiente de densidad
	<ol>
<li>Prepare 1 × DG solución mezclando solución 90 mL DG (consulte la Tabla de materiales) con 10 mL de PBS de 10 x. Mantener estéril a 4 º C.</li>
		<li>Preparar solución DG 44% (8 mL/IEL, 8 mL/LP) mediante la mezcla de 44 mL de solución madre 1 × DG y 56 mL de RPMI 1640. Preparar esta fresca antes de su uso.</li>
		<li>Preparar solución DG de 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP) mezclando 67 mL de solución stock de 1 × DG y 33 mL de RPMI 1640. Preparar esta fresca antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aislamiento de los ganglios linfáticos mesentéricos, los intestinos y placas de Peyer parches
<ol><li>Eutanasia el ratón con narcosis por dióxido de carbono y la dislocación cervical secundaria. Coloque el ratón en su parte posterior y rociar con etanol al 70%. Utilice tijeras para hacer una incisión del midline y abrir la piel y pared abdominal para exponer la cavidad peritoneal.</li>
	<li>Ubicar el ciego y utilizar pinzas para bajar suavemente el intestino ciego. Utilice pinzas para mover cuidadosamente el intestino delgado hacia la derecha, exponiendo toda la cadena MLN, que está alineada con los dos puntos. Nota: Un mapa de los nodos de linfa mesentéricos cadena y linfático drenaje intestinal era anteriormente representó13.</li>
	<li>Identificar el nodo de la parte inferior de la cadena, situado más cercano al ciego. Utilizar un sistema de pinzas para sujetar el mesenterio o grasa alrededor y sacar suavemente la cadena MLN del fondo a la cima por la grasa de alrededor del nodo de linfa con otro juego de pinzas de tweezing.</li>
	<li>Coloque la cadena MLN sobre una toalla de papel humedecida con media cosecha. Quitar grasa mesenterio la cadena en la torre de papel y sacar la grasa con dos juegos de pinzas. Lugar el MLN en los medios de cosecha fría para pasos posteriores de aislamiento. Nota: se desaconseja la manipulación (i) directa de los nodos. Sujete el mesenterio o grasa alrededor de ellos. (ii) es fundamental para eliminar tanta grasa mesenterio como sea posible para mejorar la viabilidad de las células.</li>
	<li>Corte de intestino delgado por debajo de la esfinge pilórica y arriba el ciego con unas tijeras. Sacar el intestino poco a poco del íleon al duodeno mediante un sistema de pinzas mientras se retira el mesenterio o grasa adjuntado con otro conjunto de pinzas.</li>
	<li>Colocar el intestino en una toalla de papel humedecida con media cosecha y burlan cualquier restante mesentery o grasa apagado con dos juegos de pinzas. Nota: () Asegúrese de quitar tanta grasa mesenterio como sea posible para el rendimiento óptimo de la célula y viabilidad. (ii) mantener el intestino humedecido a lo largo de este y los siguientes pasos aplicando medios de cosecha periódicamente.</li>
	<li>Recoger de Peyer quitándolos del intestino con tijeras curvas. Use una disección alcance o lupa si es necesario (principiantes); mayoría de Peyer debe ser visibles para el ojo entrenado. Recoger 5-11 (típico) placas de Peyer del intestino. Parches lugar placas de Peyer en los medios de cosecha fría para pasos posteriores de aislamiento. Nota: Placas de Peyer están pequeñas, principalmente redondas protuberancias en la pared intestinal externa frente a la línea de fijación del mesenterio.</li>
	<li>Utilice el lado plano de la pinza y suavemente Deslice desde el duodeno hacia el íleon para expulsar moco y contenido fecal. Repetición una vez para eliminar la mayor parte del moco. Nota: Retiro incompleto del moco puede disminuir la viabilidad celular y rendimiento. Sin embargo, asegúrese de deslizar el intestino suavemente para evitar la extracción de vellosidades o dañar la membrana del sótano.</li>
	<li>Utilice tijeras finas con un extremo romo de un punto, introduzca el extremo embotado en el intestino y el intestino abierto longitudinalmente desde el duodeno al ileon. Corte lateralmente el intestino abierto en trozos de 2 cm. Colocar los intestinales en un tubo cónico de 50 mL con medios de cosecha fría de 25 mL para pasos posteriores de aislamiento. Nota: Mantener las tijeras humedecidas con los medios de comunicación les ayudará deslice sin esfuerzo a través del intestino.</li>
</ol>3. aislamiento de linfocitos a los sitios inductivos
<ol><li>Aislar los linfocitos del MLN saldándose suavemente a través de un tamiz de celular 70 μm utilizando el émbolo de una jeringa de 3 mL. Lave el filtro celular con 5 mL de medio de cosecha fría.</li>
	<li>Pelotilla MLN-células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán. Nota: tampón de lisis de glóbulos rojos puede utilizarse para extraer células de sangre rojas si el sangrado se produjo durante la extracción.</li>
	<li>Aislar los linfocitos de las placas de Peyer por incubación de placas de Peyer en un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL precalentado colagenasa solución a 37 ° C y 220 rpm por 30 min.</li>
	<li>Vortex por 15 s en posición de máxima potencia y filtro digiere tejido y sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL a través de un tamiz celular de 70 μm. Suavemente se disocian las restantes piezas de tejido con el émbolo de una jeringa de 3 mL y lavar el filtro celular con 5 mL de medio de cosecha fría.</li>
	<li>Las células de parches de Peyer de pellets por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán. Nota: Aislamiento de parches de Peyer pueden tener algunos contaminantes los linfocitos de la lámina propia y linfocitos intraepiteliales.</li>
</ol>4. aislamiento de los linfocitos intraepiteliales del intestino
<ol><li>Lave los trozos de intestino tres veces con 25 mL de medio de cosecha fría por inversión del tubo 10 veces, dejando las piezas intestinales resolver y verter fuera el sobrenadante. Nota: Piezas de tejido deben instalarse fácilmente a la parte inferior del tubo. Si no lo hace, es un indicio de que demasiada grasa mesenterio queda sujeta o se asocian con una burbuja de aire.</li>
	<li>Añadir 20 mL de solución DTE precalentada para el tubo cónico de 50 mL que contiene piezas del intestino y transferir a un matraz de Erlenmeyer siliconado 50 mL, que contiene una barra de agitación. Remover a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 20 min Use un imán grande en el exterior del frasco para mantener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución hacia el tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Vórtice el tubo en el máximo ajuste de transferencia s. 10 el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL nuevo a través de un tamiz de celular 70 μm teniendo cuidado de mantener las piezas de tejido en el tubo original. Desechar el sobrenadante; el sobrenadante contiene linfocitos intraepiteliales. Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 10 mL y almacenar en hielo.</li>
	<li>Añadir 20 mL de solución DTE precalentada para el tubo cónico de 50 mL que contiene piezas del intestino y la transferencia hacia el matraz de Erlenmeyer siliconado 50 mL, que contiene una barra de agitación. Remover a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 20 min Use un imán grande en el exterior del frasco para mantener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución hacia el tubo cónico de 50 mL. Nota: DTE es un agente reductor que enriquece los linfocitos intraepiteliales.</li>
	<li>Vórtice el tubo en el máximo ajuste de transferencia s. 10 el sobrenadante a través de un tamiz celular de 70 μm al tubo anterior que contiene células partir del sobrenadante del primer tratamiento del DTE (desde el paso 4.3). Nota: Las restantes piezas intestinales se utilizan para aislar los linfocitos de la lámina propia. Control de calidad: Un trozo de tejido se puede quitar y comprobado histológicamente para asegurar que las células epiteliales están presentes y la membrana basal está intacta.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación el sobrenadante a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 8 mL de solución DG 44% a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Transferencia de la suspensión de la solución/célula de 8 mL de 44% DG en un 17 mm ø x 100 mm estilo tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Arpillera con 5 mL de solución de DG RT 67%. Centrifugar a 1600 × g por 20 min a temperatura ambiente sin utilizar el freno. Nota: Los tubos pueden ser pretratados con suero bovino para evitar que las células se adhieran a las paredes del tubo.</li>
	<li>Tenga en cuenta que células viables forman una banda (buffy coat) en la interfaz de 44% a 67%, las células muertas y algunas células epiteliales están en una película mucoide en la parte superior del gradiente, y son los glóbulos rojos en el sedimento. Quitar la capa superior del degradado dentro de ~ 2 cm de la interfaz por aspiración al vacío. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa buffy en la interfaz y transferirlos a un tubo cónico de 50 mL que contiene medios de cosecha fría 40 mL.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.</li>
</ol>5. aislamiento de linfocitos de la lámina propia del intestino
<ol><li>Quitar las células epiteliales de piezas de tejido intestinal añadiendo 25 mL de solución EDTA precalentado al matraz que contiene las restantes piezas intestinales. Frasco de agitación a 37 º C y 220 rpm en un agitador magnético durante 30 minutos utilizar un imán grande en el exterior del matraz de sostener la barra de agitación y descartar cuidadosamente el sobrenadante manteniendo piezas intestinales dentro de la cubeta. Nota: (i) el EDTA es un quelante del calcio que apunta a las ensambladuras dependiente de calcio y promueve el desprendimiento de células epiteliales intestinales. (ii) el sobrenadante debe ser nublado y puede utilizarse para aislar IEC desearlo su colección.</li>
	<li>Repita el paso 5.1. Nota: El sobrenadante debe ser menos nublado después de la incubación. Control de calidad: Un trozo de tejido se puede quitar y comprobado histológicamente para asegurar que se han eliminado las células epiteliales intestinales y la membrana basal está intacta. Una muestra del sobrenadante también puede evaluarse mediante citometría de flujo para confirmar que los leucocitos (CD45+ células) están ausentes.</li>
	<li>Añadir 50 mL de medio de cosecha RT en el matraz. Mezclar brevemente con un imán. Que piezas intestinales resolver y eliminar cuidadosamente el sobrenadante. Nota: Este paso garantiza la eliminación de EDTA antes de la digestión de la colagenasa como EDTA desactiva colagenasa por quelantes del calcio que es esencial para la función de la colagenasa.</li>
	<li>Añadir 30 mL de solución de colagenasa precalentado al matraz y agite intestinales piezas a 37 ° C y 220 rpm en un agitador magnético durante 45 minutos.</li>
	<li>Transferencia de tejido digerido y el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL por filtración a través de un tamiz celular de 70 μm. Suavemente disociar restantes piezas de tejido mediante el émbolo de una jeringa de 3 mL el puré a través del filtro. Lavar el filtro con 10 mL de medio de cosecha fría.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 8 mL de solución DG de 44% de temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferencia de la suspensión de la solución/célula de 8 mL de 44% DG en un 17 mm ø x 100 mm estilo tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Arpillera con 5 mL de solución de temperatura ambiente 67% DG. Centrifugue los gradientes en temperatura y 1600 × g por 20 min sin freno.</li>
	<li>Retire la capa de grasa en la parte superior por aspiración al vacío. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa buffy en el interfaz y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mL que contiene medios de cosecha fría 40 mL.</li>
	<li>Pellet de células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en medios de cosecha fría de 1 mL. Contar las células viables mediante exclusión del azul tripán.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se presenta un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos desde el intestinal mucosa inductivo (MLN y PP) y efectores (compartimiento de LP y IEL). El protocolo ha sido desarrollado para equilibrar la entrada (tiempo) y salida (viabilidad y rendimiento) para maximizar la productividad y resultados. El protocolo también asegura la mínima contaminación compartimentación entre LP y IEL compartimientos.
Varios protocolos para el aislamiento de las células inmunes del intestino ...

El tracto gastrointestinal (GI) tiene muchos pliegues y protuberancias que representa la interfaz más grande separando el cuerpo interno y el ambiente externo. El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal. Está constantemente expuesto a antígenos dietéticos, las bacterias comensales y microbios patógenos. Como tal, debe seguir siendo tolerante a antígenos alimentarios y bacterias comensales conservando la capacidad de generar rápidamente una respuesta inmune efectiva a microbios enteropatógeno1. El sistema inmune intestinal puede dividirse anatómicamente en inductivo, donde los linfocitos se activan por el antígeno que presenta las células con antígenos de la mucosa intestinal, y efectoras, donde ejercen determinados linfocitos activados de las funciones efectoras2. Los sitios inductivos constituyen la estructura linfoide organizada de placas de Peyer (PP) que examina la luz intestinal directamente a través de la acción de las células M especializadas y nodos de linfa mesentéricos drenantes regionales (MLN). Los sitios efectores consisten en la lámina propia (LP), que es el tejido conectivo debajo de la membrana basal y el epitelio intestinal, una capa de célula situado por encima de la membrana del sótano que contiene linfocitos intraepiteliales (IEL). Los linfocitos son los principales actores de la inmunidad adaptativa que median protección contra infecciones y cánceres y pueden también contribuir a la Inmunopatología de las enfermedades inflamatorias. Es importante y muy relevante para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos anatómicos mucosa para mejor entienden sus funciones inducción y efectoras.
Un protocolo relativamente simple y unificado para el aislamiento de los linfocitos de estos compartimentos se necesita que el número de investigadores explorar eventos inmunes que ocurren en el intestino está acelerando. Varios grupos de investigación han publicado protocolos que comparten varios procesos similares para aislar las células inmunes del ratón pequeños compartimentos intestinal3,4,5,6,7 . Sin embargo, hay varias diferencias técnicas entre ellos según el enfoque del protocolo individual. Por ejemplo, con el foco en el aislamiento de las células inmunes del LP, un protocolo analiza el impacto de varias digestiones enzimáticas en la viabilidad celular, expresión de marcadores de superficie celular y la composición de las células inmunes aislados5. Otro protocolo destaca un método rápido y reproducible para el aislamiento de linfocitos sin densidad centrifugación6. Por último, también existen protocolos específicos con el fin de aislar a los fagocitos mononucleares de capas diferentes de tejido del intestino delgado7. Aquí, se presenta un protocolo altamente reproducible que permite aislamiento secuencial de poblaciones linfocitarias del MLN, PP, LP y IEL compartimiento del intestino delgado.
Nos centramos en aislar poblaciones altamente purificadas de los compartimientos del LP y IEL, que son en gran parte libres de contaminantes de otros compartimentos intestinales. Esto ampliamente utilizado protocolo produce un alto rendimiento de linfocitos máximo puros y viables en tiempo aceptable restricciones4,8,9,10,11,12. Este protocolo también asegura el aislamiento de los linfocitos del compartimiento de LP y IEL con mínima contaminación compartimentación, lo que permite una oportunidad buena fe para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos. Los linfocitos aislados pueden ser sometidos a manipulaciones más como análisis cytometric del flujo o análisis funcional. Este protocolo se ha aplicado con éxito para el aislamiento de linfocitos de ratón intestino delgado y colon durante infecciones por bacterias como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis infecciones y afecciones inflamatorias como la colitis inducida por químicos y patógenos. Este protocolo también puede utilizarse para aislar las células inmunes innatas como las células dendríticas, macrófagos, neutrófilos y monocitos de ratón intestino delgado y colon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal mediante la generación de respuestas tolerantes a antígenos dietéticos y bacterias comensales mientras que montar una respuesta inmune efectiva a enteropatógeno microbios. Además, ha quedado claro que la inmunidad local intestinal tiene un profundo impacto en la inmunidad sistémica y distante. Por lo tanto, es importante estudiar cómo se induce una respuesta inmune intestinal y lo que es los resultados inmunológicos de la respuesta. Aquí, se describe un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos del intestino inductivo como de Peyer tejido linfoide asociado a intestino y ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y efectoras como la lámina propia y la epitelio intestinal. Esta técnica asegura el aislamiento de un gran número de linfocitos de los tejidos intestinales pequeñas con óptima pureza, viabilidad y mínima contaminación compartimentación dentro de las limitaciones de tiempo aceptable. La capacidad técnica para aislar los linfocitos y otras células inmunes de los tejidos intestinales permite la comprensión de la respuesta inmune a infecciones gastrointestinales, cánceres y enfermedades inflamatorias.

Se muestra una representación esquemática del Protocolo (figura 1). Los linfocitos de la mucosa intestinal inductiva y sitios efectores se organizan claramente. Peyer de parches (PP) y nodos de linfa mesentéricos (MLN) contienen linfocitos en áreas bien organizadas de células T y folículos de células B, mientras que el epitelio intestinal contiene linfocitos que se distribuyen más difusamente. La lámina propia (LP) contiene linfocitos difusamente dis...

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.3K vistas.  Stony Brook University. Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

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An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;