저자는 유방암 연구 재단 및 고급 의료 연구 재단의 지원을 인정 하는 기꺼이.

여기 설명 하는 모든 방법은 보스턴 어린이 병원 기관 Biosafety 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 세포 준비
<ol><li>
녹고 KHOS-A 및-N 셀
	<ol>
<li>따뜻한 문화 매체, 즉, 최대 Dulbecco의 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FBS)와 1% (vol/vol) 페니실린/스 보충이 글 중간 수정.</li>
		<li>액체 질소 탱크에서 세포의 극저온 튜브를가지고, 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 물에 튜브의 하단을 담가 그리고 부드럽게 녹고 프로세스를 가속 화 하기 위해 극저온 병을 흔들어. 오염을 방지 하기 위하여 물 접촉에서 극저온 튜브의 뚜껑을 유지. 최대한 빨리 셀은 해 동, 70% 에탄올 솔루션을 분사 하 고 유리병을 닦는 여 극저온 유리병을 소독.</li>
		<li>층 류 두건에서 즉시 극저온 유리병에서 세포 현 탁 액을 발음 하 고 부드럽게 따뜻하게 10 mL의 배양 (1.1.1에서 설명)에 일시 중단 합니다. 5-7 분 약 200 x g에서 셀 정지 원심</li>
		<li>예 열 10 mL 문화 매체와 셀 펠 릿 resuspend 그리고 T75 플라스 크로 전송. 부드럽게 균등 하 게 10 mL를 피펫으로 사용 하 여 셀 중단 여러 번 플라스틱.</li>
		<li>5% (vol/vol) CO2 와 습도 분위기 37 ° C 배양 기에 플라스 크를 놓습니다. 셀 12 h 이상에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
		<li>80-100% 합칠 때까지 약 3-7 일에 대 한 셀을 품 어. 2-3 일 마다 문화 매체를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분할 KHOS-A 및-N 셀
	<ol>
<li>플라스 크에서 문화 미디어를 제거 합니다.</li>
		<li>5 mL 살 균 PBS로 세포 세척 (1x) 칼슘과 마그네슘, 비 부착 셀 또는 제거 없이.</li>
		<li>플라스 크에 1 mL 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션을 추가 하 고 간단히 트립 신-EDTA 균등 하 게 분산 되도록 플라스 크를 소용돌이.</li>
		<li>37 ° C 배양 기에서 2-3 분 또는 실 온에서 3-5 분에 대 한 플라스 크를 품 어. 에 셀은 반올림 하 고 분리 되도록 약 400 배 확대 현미경으로 세포를 확인 합니다.</li>
		<li>세포 분리는 일단 10 mL 문화 매체를 추가 하 고 부드럽게 헤어 10ml 피펫으로 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀 집계 여러 번 왔다 갔다 매체 플라스틱.</li>
		<li>셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 2 × 106 세포의 밀도 또는 1: 4의 비율에서 새로운 T75 플라스 크에 세포 현 탁 액을 시드하십시오.</li>
		<li>QPI 실험에 뿌리기 전에 80-100% 합류에 성장 하는 셀 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시드 KHOS-A 및-N QPI 셀
	<ol>
<li>씨 KHOS-A 및-N 셀의 50000-300000 셀/셀 카운터로 계산 후 5 mL 문화 매체와 밀도에서 6 잘 플레이트에 참고: 시드 밀도에 따라 달라 집니다 셀 확산 속도 이미징 기간 하려면 < 이미징 수집 하는 동안 100% 합류.</li>
		<li>첨부 파일을 허용 하도록 적어도 12 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>QPI를 수행 하기 전에 신선한 미디어와 매체를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. QPI 수집
<ol><li>
커버 슬립 설정
	<ol>
<li>커버 슬립 이온 물로 여러 번 헹 궈 서 깨끗 하 고 건조 살 균 층 류 두건으로 커버 슬립을 넣어 15 분에 대 한 침수에 의해 75% 에탄올 용액으로 소독.</li>
		<li>신중 하 게 커버 슬립을 분명 거품을 피하기 위해 6-잘 접시에 놓습니다. 커버 슬립의 하단 문화 미디어 (최소 5 mL/음)에 몰입 됩니다 확인 하십시오.</li>
		<li>(37 ° C, 5% CO2, 그리고 습도 분위기) 적어도 15 분 동안 equilibrate 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 커버 슬립에 안개 형성 하는 경우에 멸 균 면봉을 사용 하 여 그것을 깨끗 하 게 닦아.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경으로 세포 이미징
	<ol>
<li>노출 시간, 패턴 대비 및 홀로그램 잡음의 자기 보정을 포함 하 여 시스템을 초기화 하기 위해 소프트웨어를 엽니다. 값은 허용 (녹색 또는 노란색 범위에 표시 된) 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>6 잘 플레이트 QPI 현미경의 스테이지에 배치 합니다.</li>
		<li>"라이브 캡처," 클릭 하 고 "소프트웨어 초점."에서 "수동"을 선택 개의 "현미경 설정"에서 작업 거리를 조정 하 여 셀의 위상 이미지를 초점 셀 단계 이미지에 대 한 개요를 얻을. "소프트웨어 초점."에서 "자동"으로 변경</li>
		<li>"새로운 실험"를 클릭 하 여 새 실험 만들기를. 숫자 패드에 마우스 또는 화살표 키를 사용 하 여 이미지 수집 위치의 선택으로 시작 합니다. 각 선택 후 "저장"을 클릭 합니다. 일반적으로 3-5 위치 각 샘플에 대 한 선택 됩니다.</li>
		<li>"Timelapse" 섹션에서 이미징 간격 및 기간을 설정 합니다. 참고: 명확 하 게 암 세포를 추적, 간격 이어야 한다 짧은 보다 5 분 48 시간 조합 QPI 분석 기간으로 설정 됩니다.</li>
		<li>자동으로 집중 하 고 설정 시간 지점에서 이미지를 "캡처"를 클릭 하 여 실험을 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>
셀 형태 분석
	<ol>
<li>"셀을 식별 합니다." 클릭 셀 영역 배경 잡음 으로부터 잘 구분 되는 "배경 임계값"에 대 한 숫자 설정을 조정 합니다. "개체 크기"에 대 한 설정을 조정할 각 셀 한 핵에 있는지 확인 합니다. 이 마지막 지역 및 볼륨 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 비교 될 필요가 있는 샘플에 대 한 일치 매개 변수를 유지 합니다. 필요한 경우 수동으로 "수동 변경,"를 사용 하 여 셀 세그먼트 수정 합니다.</li>
		<li>셀을 분석 하는 소프트웨어에서 "데이터 분석" 함수를 사용 합니다. "새로운 분석."를 클릭 하 여 새로운 데이터 분석 시작 선택 된 이미지는 "소스 프레임" 탭 및 세포 형태학 매개 변수 셀 영역 (µ m2), 광학 두께 (µ m), 및 모든 개별 셀에 대 한 볼륨 (µ m3)을 포함 하 여 끕니다. 분산형 플롯 또는 히스토그램 모드 및 내보내기 데이터를 테이블 또는 그림을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 확산 분석
	<ol>
<li>다른 시간 포인트 (예, 초기, 12 h, 24 h, 36 h 및 48 h) 적어도 5 이미지를 선택 합니다. 소프트웨어에 의해 제공 되는 레코드 셀 번호.</li>
		<li>배로 시간을 추정, 초기 숫자 정상화 후 핸드폰 번호를 플롯 하 고 지 수 성장 곡선에 맞게.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 모션 분석
	<ol>
<li>소프트웨어에 "셀 추적" 기능을 사용 합니다. "새로운 분석"을 클릭 하 여 새로운 데이터 분석을 시작 하. 선택한 기간 동안 (예를 들어, 24 h 부 화 후 4 h) "소스 프레임" 탭에는 이미지의 드래그 시리즈는 임의로 "셀 추가" 선택 모드에서 셀을 클릭 하 여 10-30 셀을 선택 합니다. 가장자리와 보기의 필드 밖으로 이동에 셀을 제외 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 이미지의 시리즈에서 추적을 확인 하십시오. 시스템 셀의 트랙을 잃거나 잘못 된 셀을 추적는 수동으로 조정 추적 셀 셀을 식별 하기 위해 "확인"을 클릭 하거나 "위치 수정"을 클릭 하 여 셀 위치를 수정 하려면 "선택" 모드.</li>
		<li>"플롯 운동" 셀 궤적의 장미 줄거리 또는 줄거리는 다른 모션 관련 매개 변수에 대 한 운동 속도 (µ m/h), 운동 (µ m), 마이그레이션 (µ m), 및 마이그레이션 똑 바 름 같은 "플롯 기능"에서 선택 하십시오. 테이블 또는 수치 데이터를 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Harper, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+tumor+angiogenesis:+mechanisms+and+therapeutic+implications.">Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications.</a> EXS. (96), 223-268 (2006).</li><li>Naumov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).</li><li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-2+is+required+for+the+switch+to+the+angiogenic+phenotype+in+a+tumor+model.">Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+switch+of+dormant+tumors+to+fast-growing+angiogenic+phenotype.">Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype.</a> Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signature+for+angiogenic+and+nonangiogenic+non-small-cell+lung+cancer.">Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer.</a> Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).</li><li>Harper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+the+zinc+finger+transcription+factor+ZNF24.">Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24.</a> Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).</li><li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+repression+of+VEGF+by+ZNF24:+mechanistic+studies+and+vascular+consequences+in+vivo.">Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo.</a> Blood. 121 (4), 707-715 (2013).</li><li>Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+zinc+finger+transcription+factor,+ZNF24,+modulates+the+angiogenic+potential+of+human+microvascular+endothelial+cells.">The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+dormancy+of+human+liposarcoma+is+associated+with+impaired+tumor+angiogenesis.">Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+micro+RNAs+governing+the+switch+of+dormant+tumors+to+the+fast-growing+angiogenic+phenotype.">Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype.</a> PloS One. 7 (8), e44001 (2012).</li><li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors.">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PloS One. 7 (9), e44395 (2012).</li><li>Almog, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+induced+by+the+tumor+dormancy-associated+microRNA-190.">Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190.</a> Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).</li><li>Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+control+the+angiogenic+switch+in+mouse+lung+metastasis.">Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis.</a> Science. 319 (5860), 195-198 (2008).</li><li>Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+angiogenesis+during+the+transition+from+hyperplasia+to+neoplasia.">Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.</a> Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).</li><li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Phase+Imaging+Techniques+for+the+Study+of+Cell+Pathophysiology:+From+Principles+to+Applications.">Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications.</a> Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).</li><li>Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Phase+Imaging.">Quantitative Phase Imaging.</a> Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).</li><li>Marrison, J., R&#228;ty, L., Marriott, P., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptychography--a+label+free,+high-contrast+imaging+technique+for+live+cells+using+quantitative+phase+information.">Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information.</a> Scientific Reports. 3, 2369 (2013).</li><li>Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gj&#246;rloff Wingren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+for+non-invasive+monitoring+of+cell+cycle+arrest+in+L929+cells.">Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells.</a> PloS One. 9 (9), e106546 (2014).</li><li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).</li><li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dormant+and+active+human+cancer+cells+by+quantitative+phase+imaging.">Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).</li><li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response.">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PloS One. 9 (2), e89000 (2014).</li><li>Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+testing+at+the+single+cell+level+using+quantitative+phase+and+amplitude+microscopy.">Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+red+blood+cell+mechanics+during+morphological+changes.">Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).</li><li>Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+blood+testing+using+quantitative+phase+imaging.">Real time blood testing using quantitative phase imaging.</a> PloS One. 8 (2), e55676 (2013).</li><li>Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+prostate+cancer+recurrence+using+quantitative+phase+imaging.">Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9976 (2015).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+surface+area+and+deformability+of+individual+human+red+blood+cells+over+blood+storage+using+quantitative+phase+imaging.">Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging.</a> Scientific Reports. 6, 34257 (2016).</li><li>Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical-mechanical+signatures+of+cancer+cells+based+on+fluctuation+profiles+measured+by+interferometry.">Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry.</a> Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

이 연구에서 우리는 생체 외에서비-침략 적, 레이블 없는 방법과 양적 특성 인간 다리 세포의 신생 및 비 신생 고기 QPI를 사용 하 여 설명 합니다. 여러 세포 매개 변수는이 메서드에서 통합, 높은 처리량, 확산 속도, 시간, 마이그레이션 똑 바 름, 운동 속도, 마이그레이션, 및 운동 성을 두 배로, 셀 볼륨, 셀 간격, 셀 영역을 포함 하 여 동시에 분석 되었습니다 했습니다.
셀 형태학 및 세포 행동을 평가 하는 기존의 분석 실험에 비해,이 방법은 뿐만 아니라 저장 시간과 노동, 하지만 또한 더 정확 하 고 자세한 정보를 제공 합니다. 예를 들어 (내부 셀 인큐베이터) QPI 시스템의 위치 주변 환경 (실내 온도 분위기)23에 촬영 하는 등 환경 변화에서 소요를 감소 시킨다. 또한, 광학 셀 두께 볼륨, 위상 변화에서 변환 수으로 얻을 수 QPI, 반면만 셀 영역 전통적인 세포 이미징 프로세스에 의해 측정 됩니다. QPI의이 기능은 다른 셀 고기의 양적 비교에 대 한 자세한 정보를 생성합니다.
관심사의 세포의 적절 한 시드 밀도 현재 방법에 중요 합니다. 영상 수집 단계 셀이 일관 된 QPI 기술 그 수집 이미징만 수행할 수 1 포커스 패널, z에 일부 정보를 잃을 수 있습니다의 제한으로 인해 confluent 단층 보다 작을 것으로 예상 된다 방향 (즉, 중첩된 셀). 또한, characterizations QPI를 사용 하는 세포 외 매트릭스에서 z 방향에서 셀 침공에 대 한 최적의 2D 형식으로 제한 됩니다. 미래 QPI 방법론 개발을 위한 여러 개의 미리 설정 된 초점 길이 필요 합니다.
셀 계산, QPI 이미징 또한 제공 합니다 유익한 이미지를 추가 라벨21,,2324없이 세포 유사 분열을 공부. 세포 분열 셀 영역 및 볼륨의 확실 한 감소에 의해 쉽게 인식 되었다, 하는 동안 능력을 객관적으로 그리고 양적 정의 하 고 단일 셀에 대 한 세포 주기 단계 차별화 아직 설정할 수 있다. 이 기능은 셀 줄기 세포 분화, 약물 반응 및 세포 주기 검거에 대 한 분석에 관하여 연구를 용이 하 게 크게 것 이다.
양적, 레이블, 자유롭고 사용 하기 쉬운의 장점으로 인해이 방법 또한 유용한 임상 응용25,26,,2728,29,30 있을 수 있습니다. . 예를 들어이 시스템 인간의 종양에 휴면 하 고 활성 셀을 포함 하 여 다른 유형의 세포 인구의 특성에 이용 될 수 있습니다. 휴면 및 활성 암 세포 간의 특징이 셀 형태학 및 행동 차이 기본 인간 암에 있는 종양 휴면 하는 분자 메커니즘을 해독 잠재적으로 사용할 수 있습니다.

개발 및 단단한 종양의 진행 초기 검사점 중 신생 표현 형, 암 홀 마크의 인수입니다. 이 진행 포함 다양 한 생 화 학적 및 분자 프로세스1,2,3. 종양 진행이 키 단계 연구에서 기술 도전 도구를 지속적으로 하 고 양적 특성화 고 편견으로 라이브 암 세포의 신생 및 비 신생 고기 구별의 부족 이다. 보통 신생 및 비 신생 세포의 세포질 행동을 조사 하는 데 사용 되는 전통적인 분석 필요 비싼 시 약 및 기기, 예를 들어 셀 확산/마이그레이션 분석4,5, 실험 6,7,,89,10,11,12,13,14 또는 상당한 전문성과 집중을 요구 뿐만 아니라 보완 vivo에서 평가4,5,6,8,,1516, 시간과 노동 소비입니다.
최근, 양적 위상 이미징 (QPI) 다양 한 세포 형태 및 동작 매개 변수17,18,19, 의 시간 경과 및 라벨 무료 평가 가능 하 게 소설 기법으로 떠오르고 있다 20 , 21 , 22. 기존의 광학 현미경과 달리 QPI 단정 위상 변화에 의해 픽셀의 빛 광 개체를 통해 전달 되 고 변환 된 광학 두께와 볼륨, 자필을 재구성 한 후 직접 활성화 라이브 셀 및 다음 기능 분석: (1) 양적 이미징, (2) 비-침략 적 및 시간 경과 영상, (3) 라벨 무료 이미징, 및 (4) 동시 다중 매개 변수 영상. 이러한 기능을 평가 하 고 세포 수준에서 병 적인 프로세스를 이해 하는 강력한 도구 QPI를 확인 합니다.
최근 연구에서 활용 하는 양적 특성 및 신생 구별 QPI KHOS A 및 세포 형태학의 분석을 결합 하 여 체계적이 고 정량적으로 인간의 다리 셀의 비 신생 KHOS N 고기 확산, 그리고 운동 성23. 이미지 분석 소프트웨어, 패널을 사용 하 여 셀 형태학과 행동의 매개 변수가 양적 신생 및 비 신생 인간 다리 셀 사이의 비교 했다 그리고 5 특성 차이이 두 사이 발견 했다 고기입니다. 이 새로운 접근 방식을 다양 한 세포 생물학 관련 특성을 평가 하기 위한 통합 및 양적 플랫폼을 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:227px;">T75 flask</td>
			<td style="width:227px;">Corning, NY, USA</td>
			<td style="width:227px;">353136</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:227px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Corning, NY, USA</td>
			<td style="width:227px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:227px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td style="width:227px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:227px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Atlanta Biologicals, GA, USA</td>
			<td style="width:227px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:227px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td style="width:227px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:227px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:227px;">Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td style="width:227px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:227px;">Beckman Z1 Coulter counter</td>
			<td style="width:227px;">Beckman Coulter, IN, USA</td>
			<td style="width:227px;">Z1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:227px;">HoloMonitor M4</td>
			<td style="width:227px;">Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td>
			<td style="width:227px;">M4</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:227px;">Hololid</td>
			<td style="width:227px;">Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td>
			<td style="width:227px;">PHI 8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:227px;">HStudioM4</td>
			<td style="width:227px;">Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden</td>
			<td style="width:227px;">HStudioM4</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a time-lapse, label-free, quantitative phase imaging study of dormant and active human cancer cells

신생 표현 형의 인수 종양 휴면에서 탈출의 필수적인 구성 요소입니다. 여러 클래식 체 외에서 분석 실험 (예를들면, 확산, 마이그레이션, 등)와 모델 vivo에서 조사 하 고 신생 및 비 신생 셀 고기 특성화 개발 되었습니다 있지만이 메서드는 시간 노동 집약적인, 그리고 종종 필요한 상당한 전문 지식 뿐만 아니라 비싼 시 약 및 악기. 최근 연구에서 우리 신생 및 비 신생 인간 다리 KHOS 셀의 시간 경과 및 라벨 무료 characterizations을 소설 양적 위상 이미징 (QPI) 기법을 사용. 셀 형태, 운동 성, 확산, 등 세포 매개 변수 패널 양적 측정 되었다 고 QPI를 사용 하 여 분석. 이 소설과 양적 접근 지속적으로 및 비 접촉 관련 세포 프로세스, 행동, 그리고 암 세포의 특성 및 다른 세포 유형 간단 하 고 통합 된 방식으로 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 보고서에서는 셀 준비, QPI 수집 및 데이터 분석을 포함 하 여 우리의 실험 프로토콜을 설명 합니다.

그림 1 전형적인 세포 형태학 특성 묘사. 이미지는 holographs (그림 1A-B)와 2D 이미지 (그림 1C-D)로 표시 됩니다. 광 셀 두께 (계산 고 굴절률 광학 경로 길이에서) 라인 프로 파일 또는 전체 셀 측정을 통해 정량은. KHOS-A의 두께 면적의 점도 그림 1E-G,이 두 고기 다른 배포 패턴을 표시 하는 위치에서 KHOS N 셀 전체 셀 측정 표시 했다. 히스토그램 (그림 1 H-M) 또는 내보낸된 파일에서 평균 숫자 KHOS-A 셀 작은 셀 영역 및 KHOS N 셀 보다 큰 두께 설명 했다.
셀 카운터 함수를 사용 하 여 셀 확산 프로 파일 (그림 2)를 획득 했다. 이러한 KHOS-A 사이 상당한 차이가 표시 되지 않았다 및-N 세포. 또한, 시간을 두 배로 셀은 또한 큰 차이가 나타나지 않았다 (즉, 24-26 h), 확산 곡선에서 추정 될 수 있습니다.
그림 3A -D KHOS A의 일반적인 추적을 표시 하 고 비 방향 (무작위)-N 셀 모션 모드, 해당 궤도. 평균 세포 운동 성 (그림 3E-F), 운동 속도 (그림 3G-H), (그림 3I마이그레이션 거리-J), 및 마이그레이션 똑 바 름 (그림 3 K-L) 녹화 시간 대 표시 했다. KHOS-N 셀에 비해, KHOS-A 셀 큰 운동 속도를, 운동 성 및 더 긴 거리의 결과로 나타났다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57035/57035fig1.jpg"> 그림 1: 세포 형태학 특성. (A-B) KHOS-A (A) 와 앤 셀 (B) 양적 대표 holographs 이미징 단계. 스케일 바는 191.4 µ m. 너비 오른쪽 하단 모서리에 이미지에 그려진 파란색 라인에 대 한 광학 두께의 양적 선 프로 파일을 표시 합니다. (C-D) KHOS-A (C) 와 앤 셀 (D)에 대 한 셀 세분화의 대표 QPI 이미지. 눈금 막대는 100 µ m. 셀 가장자리는 정량화에 대 한 제외 했다. (E-G) KHOS-A 및-N (E) 세포 (F)의 개별 셀에 대 한 지역 대 측정된 두께입니다. 각 점 개별 셀을 나타냅니다 (n = 200-300). 오버랩 플롯 (G) KHOS에 대 한 다른 분산 패턴을 보여줍니다-A 및-N 세포. (H-M) 히스토그램 셀 두께의 (H-나), 지역 (J-K), 그리고 볼륨 (L M) 배포 (H, J, L) KHOS-A 및-N (I, K, M)세포. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57035/57035fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57035/57035fig2.jpg"> 그림 2: 세포 확산 특성. 상단 패널 셀 숫자를 계산에 대 한 대표적인 셀 분할을 보여 줍니다. 눈금 막대는 100 µ m. 하단 패널은 해당 계산된 셀 확산 속도를 보여줍니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. 학생의 t 시험 (홀, 양측) 통계 분석을 위해 사용 되었다. 테스트 결과 고려 되었다 중요 한 때 p < 0.05. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57035/57035fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57035/57035fig3.jpg"> 그림 3: 동작 특성을 셀. (A-B) 대표 셀 추적 세포 (B) (A) KHOS-A 및-N에 대 한 이미지. 눈금 막대는 100 µ m. 선택한 셀에 서로 다른 색상으로 개설 된다. 세포 운동 성 기간 4 h에 기록 된 해당 색된 선으로 표시 됩니다. (C-D) KHOS-A 및-N (C) (D) 셀의 셀 궤적 플롯 원점 (0, 0)에서. 각 줄은 개별 셀을 나타냅니다. KHOS-A 셀 KHOS-N 세포에 비해 더 분산된 패턴을 보였다 (n = 10). (E-L) KHOS-A의 셀 동작에 대 한 조사 기간 동안 양적 매개 변수를 기록 (E, G, I, K) -N (F, H, J, L) 포함 하 여 셀 세포 운동 성 (E-F), 운동 속도 (G-H), 이동 거리 (나-J ), 및 마이그레이션 똑 바 름 (K-L). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57035/57035fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells at JoVE.com

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

a-time-lapse-label-free-quantitative-phase-imaging-study-dormant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.3K 조회수.  Boston Children's Hospital. 휴면 및 활성 암 세포 고기 양적 위상 이미징 사용 하 여 특징 이었다. 셀 확산, 마이그레이션, 및 형태 분석 통합 되었고 한 간단한 방법을 분석.

비디오: A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of diagnosis. Metastatic RCC (mRCC) is incurable, with a median survival time of only 18 months. Immune-based interventions (e.g., interferon (IFN) and interleukin (IL)-2) induce durable responses in a fraction of mRCC patients, and multikinase inhibitors (e.g., sunitinib or sorafenib) or anti-VEGF receptor monoclonal antibodies (mAb) are largely palliative, as complete remissions are rare. Such shortcomings in current therapies for mRCC patients provide the rationale for the development of novel treatment protocols. A key component in the preclinical testing of new therapies for mRCC is a suitable animal model. Beneficial features that recapitulate the human condition include a primary renal tumor, renal tumor metastases, and an intact immune system to investigate any therapy-driven immune effector responses and the formation of tumor-induced immunosuppressive factors. This report describes an orthotopic mRCC mouse model that has all of these features. We describe an intrarenal implantation technique using the mouse renal adenocarcinoma cell line Renca, followed by the assessment of tumor growth in the kidney (primary site) and lungs (metastatic site).

Implementation of an orthotopic model of renal cell carcinoma in immunocompetent mice affords the investigator a clinically-relevant system defined by the presence of a primary renal tumor and lung metastases in the same animal. This system can be used to preclinically test a variety of treatments in vivo.

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

연구

암 연구학

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth factors and matrix-associated proteins in the microenvironment in vivo. Furthermore, readily available reagents for the modeling of microenvironments in vitro typically utilize complex mixtures of proteins that are incompletely defined and suffer from batch to batch variability. The microenvironment microarray (MEMA) platform allows for the assessment of thousands of simple combinations of microenvironment proteins for their impact on cellular phenotypes in a single assay. The MEMAs are prepared in well plates, which allows the addition of individual ligands to separate wells containing arrayed extracellular matrix (ECM) proteins. The combination of the soluble ligand with each printed ECM forms a unique combination. A typical MEMA assay contains greater than 2,500 unique combinatorial microenvironments that cells are exposed to in a single assay. As a test case, the breast cancer cell line MCF7 was plated on the MEMA platform. Analysis of this assay identified factors that both enhance and inhibit the growth and proliferation of these cells. The MEMA platform is highly flexible and can be extended for use with other biological questions beyond cancer research.

The purpose of the method presented here is to show how microenvironment microarrays (MEMA) can be fabricated and used to interrogate the impact of thousands of simple combinatorial microenvironments on the phenotype of cultured cells.

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many studies in the last decades. Therefore, it is important to develop methods to investigate the role of key genes involved in cancer cell stemness. Gastric cancer (GC) is one of the most common and mortal types of cancers. Gastric cancer stem cells (GCSCs) are thought to be the root of gastric cancer relapse, metastasis and drug resistance. Understanding GCSCs&#160;biology is needed to advance the development of targeted therapies and eventually to reduce mortality among patients. In this protocol, we present an experimental design using a conditional knockdown system and an adapted sphere formation assay to study the effect of clusterin on the stemness of patient-derived GCSCs. The protocol can be easily adapted to study both in vitro and in vivo function of stemness-associated genes in different types of CSCs.

In this protocol, we present an experimental design using a conditional knockdown system and an adapted sphere formation assay to study the effect of clusterin on the stemness of patient-derived GCSCs. The protocol can be easily adapted to study both in vitro and in vivo function of stemness-associated genes in different types of CSCs.

결합된 조건부 녹다운 및 적응된 구체 형성 분석은 환자 유래 위암 줄기 세포의 줄기 관련 유전자를 연구하기 위하여

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...