생체 내 영상은 우리가 종양 미세 환경 내에서 생리적 상호 작용을 관찰 할 수있게합니다. 그리고 이 방법을 사용함으로써, 관찰되는 특정한 동적 거동은 국소 조직 특징을 사용하여 구획화될 수 있다. 이 프로토콜은 TME를 분절하기 위해 콜라겐 섬유 또는 자가형광 대사 산물의 유비쿼터스 라벨 프리 신호만을 사용하여 마우스에 대한 조작량을 최소화합니다.
이 방법은 세포외 매트릭스 구조 또는 혈관 구조에 대한 동적 상호 작용을 이해해야하는 모든 생체 내 시스템에 광범위하게 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 수석 연구 전문가 인 Dave Inman과 실험실의 대학원생 인 Erica Hoffmann입니다. 1.5 12 밀리미터 원형 커버 유리를 100 % 에탄올에 10 분 동안 담가 유방 이미징 창 커버 글라스를 준비하기 시작한 다음 커버 글라스를 열 램프 하에서 건조시키고 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 금속 유방 이미징 윈도우 프레임에 유리를 고정하십시오.
접착제를 밤새 치료하십시오. 다음날, 아세톤에 담근 면봉을 사용하여 유방 이미징 창을 70% 에탄올에 적어도 10분 동안 침수하기 전에 과량의 접착제의 조립된 유방 이미징 창을 청소하여 클렌징을 돕는다. 건조 후, 청소 된 유방 이미징 창을 멸균 된 Petri 접시에 보관하십시오.
창 이식을위한 수술을 시작하기 전에 수술 도구를 오토클레이브하고 70 % 에탄올로 표면을 살균하십시오. 멸균 된 밭으로 덮인 따뜻한 담요로 수술을 위해 소독 된 탁상을 준비하십시오. 멸균 필드 상단에서 측정 된 온도가 섭씨 40도가되도록 온난화 담요를 설정하십시오.
수술 절차를 위해 보조 냉간 조명과 돋보기를 사용하십시오. 멸균 일회용 실험실 코트, 수술용 슬리브, 장갑, 눈 보호 및 안면 마스크로 구성된 PPE를 착용하십시오. 다음으로, 네 번째 사타구니 유선에서 마취 된 마우스의 모피를 제모 크림으로 제거하고 멸균 된 물에 담근 거즈로 수술 부위를 헹구십시오.
그런 다음 세 번의 교대로 베타딘 및 에탄올 스크럽으로 피부 표면을 살균하여 수술을 위해 제모 된 수술 부위를 준비하십시오. 완료되면 포셉을 사용하여 유선의 네 번 위로 피부를 부드럽게 들어 올립니다. 피부가 체벽에서 멀어지면 외과 용 미세 가위로 포셉 끝에있는 진피층의 한 밀리미터 부분을 제거하십시오.
밑샘을 자르지 않고 10 밀리미터 절개를 만든 다음 포셉의 부드러운 움직임으로 진피층에서 유선을 방출하십시오. 노출 된 땀샘을 덮기 위해 PBS를 추가하십시오. 5-0 실크 꼰 봉합사를 사용하여 개구부의 주변을 따라 지갑 끈 봉합사를 만든 다음 유방 이미징 창의 가장자리를 삽입하여 진피층이 유방 이미징 창의 수신 노치에 맞물리도록하십시오.
유방 이미징 창의 반대쪽 끝에서 상피를 스트레칭하면서 금속 유방 이미징 창을 제자리에 밀어 진피층이 전체 유방 이미징 창 둘레 주위에 수신 노치를 완전히 맞 춥니 다. 그런 다음 지갑 끈을 꼬집어 진피 층을 노치에 그리고 레이어를 묶어 창을 고정시킵니다. 유방 이미징 창에서 진피층에 국소 항생제를 적용하고 마우스를 지속적으로 모니터링하십시오.
흉골 재발을 유지하기에 충분한 의식을 회복 한 후, 유방 이미징 창을 새장에 배치 된 이글루와 함께 부드러운 침구에 별도로 이식 한 마우스를 수용하고 마우스가 이미징 전에 48 시간 동안 회복 할 수 있도록하십시오. 이미징의 경우 섭씨 30도로 설정된 강제 공기 시스템을 사용합니다. 추가 대물 히터를 사용하여 Z 초점의 드리프트를 방지하고 이미징 전에 적어도 한 시간 동안 섭씨 30도에서 시스템이 평형을 이룰 수 있도록 하십시오.
그런 다음 현미경 단계에 가열 챔버를 설치하십시오. 발가락 꼬집기 방법으로 마취를 확인한 후 마우스에 눈 연고를 넣으십시오. 적절한 수분 공급을 유지하려면 이미징 세션 기간 동안 두 시간마다 0.5 밀리리터의 PBS를 피하로 주입하십시오.
물 대신 수성 젤을 대물에 바르고 미리 예열 된 현미경 단계로 마우스를 옮기기 전에 면화 도포기와 유리 클리너로 유방 이미징 창 유리의 외부를 청소하십시오. 현미경 스테이지에 마우스를 놓은 후 유방 이미징 창의 칼라를 스테이지 인서트의 14mm 수신 구멍으로 눌러 이미지를 안정화하고 이소플루란 호스에 맞춥니다. 그런 다음 현미경 안구와 Brightfield 조명을 사용하여 이미징 분야에 초점을 맞추고 혈류가있는 혈관 구조를 관찰하십시오.
시야의 안정성을 확인하십시오. 호흡 운동 유물이있는 경우 작은 거품 블록과 팅크 모양의 접착 테이프 조각으로 땀샘 뒷면에 부드러운 압축을 적용하십시오. 압축이 적용된 후, 시야각 전체에 혈류가 유지되는지 확인하십시오.
마우스가 진정되고 거꾸로 된 현미경 단계에 안전하게 배치되면 관심 영역을 찾기 시작하십시오. 유방 이미징 창으로 향하는 광원을 사용하여 현미경의 안구를 사용하여 조사를위한 잠재적 인 영역을 식별하십시오. 초점은 혈관 구조와 혈류를 보는 데 있어야합니다.
소프트웨어에 XY 위치를 추가하고 저장합니다. 적절한 전력 레벨이 설정되면, Z 스택을 설정하고 유방 이미징 윈도우의 유리 표면 아래 20 내지 50 마이크로미터에서 풍부한 콜라겐 섬유의 출현을 관찰한다. 콜라겐은 현미경 절편이 종양으로 깊숙이 들어감에 따라 덜 널리 퍼질 것입니다.
두 번째 고조파 생성 또는 SHG의 공극은 종양 덩어리의 위치를 나타냅니다. 첫 번째 콜라겐 섬유가 50 ~ 100 미크론으로 나타나는 독방 세포 층 아래에 상단 Z 슬라이스를 설정하십시오. 하단 Z 슬라이스를 250마이크로미터로 설정하여 섬유가 페이드아웃되고 불량 신호가 지배적입니다.
그런 다음 저장된 모든 XY 위치에 대해 절차를 반복합니다. Z 스택 범위가 설정되면 유지 시간을 여덟 마이크로초로 늘리고 전력 및 검출기 설정을 최적화합니다. 각 실험에 대해 조직을 흥분시키는 데 필요한 전력 수준을 최적화하고 목표의 후면 조리개에서 750나노미터에서 최대 90밀리와트 또는 890나노미터에서 70밀리와트의 전력을 사용합니다.
다음으로, 대부분의 생체 내 마이그레이션 동영상에 대한 수집 지점 사이의 10분 간격으로 시작하고 실험 목표에 따라 시간 간격을 조정합니다. 세포 출혈 또는 급속하게 증가하는 자기 형광 및 과도한 광표백과 같은 광독성의 징후가 관찰되면 조건이 나타내는 것처럼 레이저 파워를 줄이거나 타임랩스 간격을 늘리십시오. NADPH의 형광 수명 이미징 또는 FLIM의 경우, 프리뷰 스캐닝을 시작하고 정수 분획 판별기 또는 CFD의 판독값이 10 내지 다섯 번째와 10 내지 여섯 번째 사이가 될 때까지 레이저 파워를 조정한다.
CFD가 10을 초과하여 여섯 번째까지 초과하면 광자 더미가 쌓이고 전반적인 결과가 좋지 않습니다. 전력 레벨이 설정되면 통합 시간을 90초에서 120초 사이로 설정하고 FLIM 컬렉션을 시작하여 할당된 시간 동안 시야각에서 광자를 획득합니다. 라벨이 없는 유방 종양 내의 전형적인 시야는 창 근처의 풍부한 콜라겐 섬유와 종양 깊숙한 곳으로의 풍부함의 감소를 입증했다.
형광 수명 또는 NADPH의 사용은 혈관 구조의 확인에 도움이 되었다. 이미지에서 일부 어두운 영역은 종양 주름 또는 인접한 종양 엽의 엉덩이 위로 올라갔습니다. 혈관구조를 확인하기 위해, NDPH FLIM을 사용한 합성 이미지를 형광 덱스트란의 꼬리 정맥 주사 전후의 생체내 스택의 최대 강도 돌출부를 비교함으로써 검증하였다.
대표적인 분석은 네 마리의 생쥐와 시야의 정량화를 보여준다. 표지가 없는 종양 덩어리의 경계를 묘사하기 위해, NADPH 자가형광을 사용하였다. 이미지는 세포의 대사 서명과 혈관의 위치를보고했습니다.
AFD 자가형광은 또한 대식세포를 확인했다. 분절 스킴으로, 라벨이 없는 종양을 SHG 및 NADPH 자가형광만을 사용하여 종양 둥지, 스트로마 및 혈관구조에 대한 구획으로 분절하였다. 추가적으로, 스트로마 및 콜라겐 섬유는 또한 정렬된 섬유의 국소 영역으로 분류될 수 있다.
이 프로토콜에 대해 기억해야 할 가장 중요한 것은 마우스가 제대로 고정되고 억제되어 시야가 이미징을 위해 안정적으로 유지되도록하는 것입니다.
