이 작품은 지원 하 여 대 산 학자 건설 엔지니어링 (gt는), 산동 우수한 젊은 과학자 상 (ZR2016JL026 G. T.), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31771284, 3167070448, 및 81641108), 산동 지방 자연 과학 재단 (ZR2016JL026, 2017GSF18103), 산동 지방 과학 및 기술 (J14LE01와 J15LK03), 옌타이 과학과 기술 plan(2015ZH083) 계획과 Binzhou 의료 대학 과학 연구 기금 (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), 스웨덴 연구 위원회 621-2011-4423 2015-4870을 부여 합니다. 이 작품은 또한 "연대 더블 백 재능 계획" 및 "연대 하이테크 영역 블루 오션 재능 계획" 주최.

모든 동물 절차 Binzhou 의료 대학 동물 사용 지침에 따라 실시 되었고 Binzhou 의과대학의 윤리적 검토 위원회에 의해 승인.
1. 샘플 준비
<ol><li>1.5 mL 튜브에 50mg 마우스 조직 고려. 200 µ L 세포의 용 해 버퍼를 추가 (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 m m NaCl, 5 mM EDTA, 5mm EGTA, 1 mM MgCl2, 10 m m 나2P2O7, 1% 트라이 톤 X-100, 10% 글리세롤), 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 (100 m m NaF, 0.1 m m phenylmethylsulfonyl와 보충 불 소, 5 µ g/mL pepstatin, 10 µ g/mL leupeptin, 5 µ g/mL aprotinin).</li>
	<li>얼음에 1 분 동안 균질 화기로 조직 균질.</li>
	<li>4 ° c.에 8 000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>새로운 튜브 (1.5 mL)에 상쾌한을 수집 하 고 1 µ L BCA 키트 단백질 농도 분석 결과 대 한 밖으로. 참고: 서쪽 오 점 분석 및 점 오 점 분석에 대 한 모든 일반적으로 사용 되 세포의 용 해 버퍼 QDB 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 항 체의 특이성을 결정
<ol><li>1.4 단원의 샘플 lysates (20 µ g)을 준비, 무료 BSA IgG (20 µ g), 서쪽 오 점 분석을 위한 표준 단백질 (600 페이지). 참고: IgG 무료 BSA 부정적인 제어로 사용 되 고 표준 단백질 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 항 체의 특이성은 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 적당 한 크기의 한 밴드를 표시 하 여 보여 줍니다.</li>
</ol>3. QDB 분석의 선형 범위 정의
<ol><li>DdH2O. Dilute 1200 pg / µ L의 농도에 단백질 표준 단백질 분해.</li>
	<li>섹션 4에 1.4 µ g / µ L의 준비 된 샘플에서 집중된 단백질을 희석.</li>
	<li>BSA ddH2O. Dilute 1200 pg / µ L와 4 µ g / µ L의 농도에 단백질 분해.</li>
	<li>표준 단백질 및 준비 샘플의 희석의 시리즈는 표 1 과 표 2의 지도 함께 준비 되었다.</li>
	<li>혼합 10 µ L 희석 표준 단백질 또는 희석 준비 샘플 및 버퍼 로드 x 10 µ L 2 (120 mM Tris HCl pH 6.8, 20% 글리세롤, 4 %SDS, 0.2 %Bromphenol 블루, 200mm DTT) 함께.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg / µ l)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µ l)</td>
			<td>S3 (100pg / µ l)</td>
			<td>S3 (300pg / µ l)</td>
			<td>S5 (600pg / µ l)</td>
			<td>S6 (1200pg / µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 protein(1200pg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>무료 BSA igG (4pg / µ l)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 표준 단백질 곡선에 대 한 희석 체계입니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg / µ l)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µ l)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µ l)</td>
			<td>X4 (1µg / µ l)</td>
			<td>X5 (2µg / µ l)</td>
			<td>X6 (4 µ g / µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>무료 BSA(4µg/µl) igG</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. 준비 된 샘플에 대 한 희석 체계
<ol start="6"><li>5 분 동안 85 ° C에 혼합물이 열.</li>
</ol>4입니다. QDB 분석의 과정
<ol><li>
샘플 응용 프로그램
	<ol>
<li>테이블의 표면을 접시의 바닥을 피하기 위해 QDB 접시를 지원 합니다. 예를 들어, 빈 피 펫 팁 상자를 사용 하 여 지원.</li>
		<li>QDB 플레이트의 개별 단위의 맨 아래에 막의 중심을 샘플의 최대 2 µ L을 로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
접시 건조
	<ol>
<li>룸 온대 (RT)에서 1 시간에 대 한 로드 QDB 접시를 두고 또는 환기가 공간에서 15 분 동안 37 ° C에서 로드 된 접시 안으로 두고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
접시를 차단
	<ol>
<li>전송 버퍼 (0.039 M 글리신, 0.048 M Tris 0.37 %SDS, 20% 메 틸 알콜)에 QDB 접시를 찍어와 부드럽게 흔들어 10 접시 s.</li>
		<li>린스 부드럽게 TBST 가진 QDB 플레이트 (식 염 수, 0.1 %Tris 버퍼 트윈 20) 세 번 및 다음 세척 일정 떨고 아래 TBST에 5 분 동안 접시.</li>
		<li>QDB 플레이트 블로킹 버퍼와 차단 (TBST에 5% 탈지 우유 (100 µ L/잘) 상수 떨고 아래 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차적인 항 체 외피
	<ol>
<li>(1: 1:5 000 500)에서 선택한 농도에서 블로킹 버퍼에 1 차적인 항 체를 희석 하 고 일반 96 잘 접시의 각 개별 음을 100 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시에 QDB 플레이트를 삽입 하 고 결합된 플레이트 RT 또는 하룻밤 상수 떨고 아래 4 ° C에서 2 시간에 대 한 중 하나를 품 어.</li>
		<li>또는 QDB 접시, 상자 안에 놓고 전체 접시 같은 항 체를 사용 하는 경우 블로킹 버퍼 판의 막 부분 위에 2 ~ 3 mm와 상자를 작성 합니다. 선택한 농도에서 1 차적인 항 체를 추가 하 고 접시 RT 또는 하룻밤 상수 떨고 아래 여 4 ° C에서 2 시간에 대 한 중 하나를 품 어.</li>
		<li>세 번, 일정 떨고 아래 5 분 동안 각 시간에 대 한 TBST를 가진 씻어 전에 세 번에 대 한 부드럽게 TBST 가진 접시를 헹 구 십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 차 항 체 외피
	<ol>
<li>2 차 항 체 (1:1, 000 1:50, 000에)에서 선택한 농도 및 중 aliquot 100 µ L/잘 차단 버퍼에 96 잘 접시 또는 4.4.2, 단원의 설명 대로 상자에 희석 하 고 중 하나 내부 QDB 접시를 로드 96 잘 pla 품 어 테 나 상수 떨고 아래 RT에 1 시간에 대 한 상자.</li>
		<li>QDB 플레이트 부드럽게 3 회로 씻어 TBST, 다음 3 시간, 5 분 각 TBST 가진 지속적인 떨고 아래 접시를 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량화
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 향상 된 화학 기판 (ECL)를 준비 합니다.</li>
		<li>96 잘 접시 (100 µ L/잘) 및 삽입 일정 떨고 아래 2 분 96 잘 접시 안에 QDB 플레이트 aliquot ECL 기판.</li>
		<li>96 잘 접시를 짧게 과잉 액체를 제거 하는 쉐이크 QDB 플레이트를 제거 합니다. 흰색 결정 접시에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>켜고 microplate 리더 microplate 리더 정량화에 대 한 내부 결합된 플레이트 (QDB 플레이트 + 화이트 플레이트 어댑터)를 배치 하기 전에 사용자 인터페이스에서 "커버 플레이트"를 선택 합니다. 참고: 사용 하 여 흰색, 투명 하지 않은 결정 플레이트 어댑터로 접시에서 어떤 방해를 피하기 위해 있는지 확인 합니다. "커버 플레이트"를 선택할 수 있는지 확인 기계 결합 될 때 방해를 피하기 위해 번호판 (QDB 플레이트 + 96 잘 접시 어댑터) microplate 리더 안에 배치 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proposal+for+validation+of+antibodies.">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li><li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies.">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li><li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA).+Quantitative+assay+of+immunoglobulin.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li><li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen,+immunoglobulin+G,+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes.">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li><li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front.">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li><li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+array:+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells.">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li><li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations.">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dot+blot+analysis+(QDB),+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method.">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li></ol>

Yunyun 장, 백 장 Jiandi 장 작가이 문서에서 사용 되는 QDB 접시를 생성 하는 Zestern Biotechniques의 직원이 있습니다. 백 장 및 Yunyun 장 관심의 충돌을 선언 하 고 Jiandi 장 특허 출원을 제기 했다. 다른 사람 없는 경쟁 관심사 주장 한다.

모든 현재 사용 가능한 immunoassay의 기술을 ELISA 제외한 단백질 분석, 중 QDB 분석 높은 처리량 형태로 휴대 및 조직 수준에서 특정 단백질의 절대 콘텐츠를 달성 하는 유일한 방법입니다. 안정 동위 원소 분류 표준, 질량 분석은 몇 가지 단백질의 절대 정량화를 얻을 수 있다, 하지만이 메서드는 아직 높은 처리량 성능을 위해 설계 되지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 CAPG 단백질 수준 마우스 조직 신장, 비장, 전립선 등의 절대적인 결정을 달성 하기 위해 QDB 분석의 과정 시연. CAPG 레벨 360을 200 pg/g 마우스 신장 조직에, 460 650 pg/g 마우스 spleens, 및 330 390 pg/g 마우스 전립선 조직에 사이 발견 됐다.
ELISA에 비해, QDB 분석 일반 실험실에서 개발 최소 노력을 요구 한다. 첫째, QDB 격판덮개는 ELISA에 코팅 단계를 제거 하는 니트로 막에 따라 이다. 둘째, QDB 분석만 대신 샌드위치 ELISA에에서 두 개의 특정 항 체 하나가 필요합니다. 셋째, ELISA 격판덮개 표면에 비해 니트로 막의 높은 바인딩 용량 또한 막을 배경 간섭을 줄이기 위해 immunoblot 분석에서 일반적으로 사용 되는 엄격한 세척 단계를 견딜 수 있습니다. 이 기능은 세포와 조직에서 준비 하는 복잡 한 lysates 분석에 매우 유용 합니다. 반면, ELISA 격판덮개의 상대적으로 낮은 바인딩 용량으로 인해 복잡 한 세포와 조직 lysates를 분석할 때 백그라운드의 감소 발달 과정에서 진정한 도전이 된다.
QDB 분석 특정 항 체의 액세스와 모든 실험실에서 쉽게 채택 될 수 있다. 그러나, 그것은 항 체의 특이성 종, 조직 유형 및 종류를 포함 하 여 요인에 의해 제한 된 상대적인 용어는 언급 하는 것이 중요. 그림 1A같이 CAPG 항 체 특정 마우스 신장, 비장, 그리고 전립선, lysate를 분석할 때 이며 아직 때 일반적인 마우스 간 분석. 사실, 우리는 정기적으로 다른 조직 유형 동일한 종에서 특정 한 조직 유형, 하지만 항상 특정 수 한 항 체를 발견. 따라서, 이전 서쪽 오 점 분석은 QDB 분석의 특이성을 확인 해야 합니다. 사실, 상대 특이성 항 체의 제조 회사 보낸 수 있습니다. 얼마나 많은 노력이 아무리 분석 결과, 특이성을 보장 하기 위해 그들은 수 없습니다 배출 가능한 모든으로 종종 ELISA 분석, 연관 false 결과의 원인이 있을 수 있습니다. 샘플 사용자 유형의 분석 ELISA 제품을 사용 하 여 선택할 수 있습니다.
모든 immunoassays과 마찬가지로 QDB 분석 방법으로 잠재적인 문제는 상업 항 체의 품질의 일관성의 부족 이다. 경우에 같은 항 체의 명백한 품질 회사 (동일한 카탈로그 번호, 등) 사용 하는, 일괄 배치 다양성으로 인해 다른 한 구매에서 큰 차이가 있을 수 있습니다. 따라서, 사용할 수 있는 항 체의 질에 완전 한 자신감을 얻을 하지 않는 한 모든 구매 시 항 체를 다시 특성화이 중요 합니다.
요약, 제공 여기 상세한 프로토콜 예를 들어 조직 수준에서 특정 단백질의 절대 양적 결정 달성 하기 위해 QDB 분석 메서드를 사용할 때. 우리는 QDB 분석 방법은 높은 처리량, 양적 immunoblot 분석에에서 관심이 있는 사람에 대 한 편리한 도구 임을 보여줍니다. 셀룰러 및 조직 수준에서 특정 단백질의 내용의 절대 결정을 달성 하는 능력 또한 전통적인 immunoblot 기법에서이 기법을 구별. 이 기능은 여러 분석, 특히 더 큰 인구 연구에에서 필요한 단계를 가까운 장래에 관련 협회 연구는 단백질 수준에서의 실현 결과의 비교와 조합 수 있습니다.

와 함께 최근 몇 년 동안, 게놈 연구에 흥미 진 진한 발전와 생물 의학 연구 분야 또한 증인 proteomic 연구에 중요 한 발전. 둘 다 게놈 생물학 데이터의 축적을 증가 함께 및 proteomic 수준 인지할 미래에 생물 의학 연구의 초점이 되었다 bioinformatic 공구를 사용 하 여 이러한 데이터를 분석. 따라서, bioinformatical 연구의 성공을 점점 더 나은 품질의 생물 학적 및 생물 의학 연구 커뮤니티에서 데이터에 대 한 수요를 제기, 작업 게놈에서 기술 발전을 통해 달성 될 수 있다 및 proteomic 수준.
질량 분석 (MS)와 immunoblot 분석 단백질 분석의 두 가지 일반적인 기술을 현재 있습니다. MS는 동시에 개별 단백질의 수천의 분석을 가능 하 게 최근 몇 년 동안에서 proteomic 연구를 지배 했다. Immunoblot 기반 기술을, 포함 서쪽 오 점 및 점 오 점, 다른 한편으로, 또한 역할 중요 한 단백질 연구에 그것의 발명1,2,,34, 이후도 5. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)5,,67 와 역 위상 단백질 microarray (RPPM)8,9 immunoblot의 높은 처리량 형식으로 간주 될 수 있습니다. 분석입니다. 그러나, ELISA, 제외 하 고 이러한 모든 immunoassay 방법을 특정 단백질의 상대적 식 수준을 측정합니다. 분석 여러 분석을 통해 풀 크기를 증가 시키는 어떤 노력 든 지 방지를 동시에 수행 되어야 합니다 이러한 방법의 상대적인 자연 인구 연구에 대 한 진짜 문제가 될 것입니다. 또한, 이러한 연구에서 파생 된 결과 반 정량, 따라서 데이터 분석에서 어떤 생물 정보학의 노력을 복잡 하 게만. 한편, ELISA는 높은 처리량 절대 분석 단백질 견본을 위한 적합,이 기술은 낮은 바인딩 용량 및 멀티플렉싱10세포 또는 조직 같은 복잡 한 환경에서 과제를 충족 것으로 보인다.
우리 단백질 함량의 절대 측정에 적합 하 고 양적, 편리 하 고, 높은 처리량의 주요 특성을 가진 인구 연구에 적합 한 immunoblot 방법을 개발 하 고 명명 된이 기술은 양적 점 오 점 분석 (QDB)11. 이 연구에서 우리는 QDB 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 특정 단백질의, CAPG, 신장, 비장, 전립선 등 세 가지 다른 마우스 조직에 절대 단백질 함량을 결정 하 여 메서드를 보여 줍니다. 우리가 생각 하는이 상세한 프로토콜을 잘 타당성과이 방법의 설명이 방법의 연습에서 잠재적인 함정을 피하기 위해 하는 방법에 지침을 제공 하 고.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:911px;" width="910">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:220px;">Tecan</td>
			<td style="width:177px;">Tecan Infinite 200 PRO</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:283px;">QDB plate</td>
			<td style="width:220px;">Yantai Zestern Co.Ltd</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:231px;">Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td style="width:220px;">jackson</td>
			<td style="width:177px;">&#160;711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Enhanced chemiluminesence substrate</td>
			<td style="width:220px;">Thermo</td>
			<td style="width:177px;">32134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Rabbit anti-CAPG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-T52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">CAPG protein</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-HNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hepes</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Nacl</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">10461220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Mgcl2</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">20120802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EDTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">BNN1913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Na2P2O7</td>
			<td style="width:220px;">Haituo Chinese medicine test</td>
			<td style="width:177px;">20160914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Glycerol</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepstatin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">Z290033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">leupeptin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aprotinin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">A3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris-Hcl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">SDS</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L5750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">DTT</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Bromphenol Blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">B-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">NaF</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)

세포 및 조직 수준에서 특정 단백질의 내용의 절대 결심을 위한 양적, 높은 처리량 immunoblot 방법은 크게 proteomic 연구에서 진행 지장을 초래할 수는 편리한 부족. 현재 사용 가능한 immunoblot 기법에서 파생 된 결과 상대, 대규모 분석 단백질 견본을 가진 독립적인 연구를 결합 하는 어떤 노력 든 지 방지도 있습니다. 이 연구에서 양적 점 오 점 분석 (QDB) 높은 처리량 형태로 절대 정량화를 달성 하기의 과정을 설명 합니다. 우리는 상한 걸 단백질, 단백질 견본 함께 상세한 3 다른 마우스 조직 (신장, 비장, 그리고 전립선)에서 준비에 gelsolin 같은 (CAPG)의 절대 콘텐츠를 확인할 수 있습니다 상용 단백질 표준을 사용 하 여, 실험 내용을 설명. 우리는 세포와 조직 수준에서 개별 단백질의 절대 정량화의 편리 하 고, 양적, 높은 처리량 immunoblot 방법으로 QDB 분석을 제안합니다. 이 방법은 바이오 마커 검증 및 생물 학적 및 생물 의학 연구의 다양 한 분야에서 경로 확인에 실질적으로 도움이 됩니다.

마우스 조직에서 CAPG 단백질을 포함 하 여 어떤 단백질의 절대 금액의 결정 기준으로 특정 항 체와 순화 된 단백질을 요구 한다. 표준 단백질 및는 lysates의 분석의 선형 범위는 또한 대규모 분석 전에 설립 될 필요가 있다. 선형의 범위 항 체는 항 체에 상당히 의존 라기보다, 고 특정 항 체의 적절 한 희석 범위 각 개별 사용자에 의해 확인 될 필요가 있다.
우리는 먼저 비장 및 전립선 조직 부정적인 제어 (IgG 무료 BSA)와 긍정적인 제어 (상용 CAPG 단백질) 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 마우스 신장에서 CAPG 항 체의 특이성을 결정 (그림 1A). 안티-CAPG 항 체 lysates 마우스 비장, 심장, 근육, 및 전립선 (한 밴드 감지)에 대 한 특정 했다. 비 특정 밴드에서 신장과 간 lysates에서 관찰 되었다. 그러나, lysate 신장, 일반적인 밴드는 항 체는 신장 조직 분석에 적합 제안 특정 밴드 보다 훨씬 약한 했다. 다음, 분석 lysates의 양과 표준 단백질의 선형 범위 두 나란히 복용량 곡선에 의해 결정 되었다. 우리의 과거의 경험, 그리고 조직 lysates의 마우스 신장에 따라 표 1 에 표시 된 대로 상용 CAPG 단백질 희석 직렬로 했다, 비장 및 전립선 결정 lysates의 총 단백질의 금액에 따라 또한 희석 했다 의해 BCA 총 단백질 결정 키트. 2 개의 복용량 연구 병행 하 여 수행 되었고 그림 1B에 함께 꾸몄다. 마우스 신장, 비장 및 전립선의 lysates의 적절 한 금액은 임의의 단위로 microplate 리더에 의해 측정 하는 QDB 신호에 따라 선정 됐다. 이 실험에 대 한 원래 읽기 표 3에 표시 됩니다.
마지막 단계에서 연속적으로 희석된 CAPG 단백질 표준 마우스 신장에서 lysates, 비장 및 전립선 QDB 격판덮개에 로드 되었습니다. 이 경우에, 우리 하기로 부하 0.3 µ g/샘플 lysates 마우스 신장과 비장 및 1 µ g/샘플 마우스 prostates 분석에서 lysates 되면서 이러한 수준 QDB 읽기에 적어도 20-fold 분석의 선형 범위 내에서 잘 동안 배경 위에 lysates의 단백질 표준 복용량 곡선을 기반으로 합니다. 접시는 접시 microplate 리더에 의해 직접 계량은 전에 설명된 QDB 프로토콜을 복종 되었다. 순차적으로 희석된 순화 CAPG 단백질을 사용 하 여, 우리 설정할 수 복용량 응답 곡선, 방정식, 및 R2 사용할 수 있는 소프트웨어 (예: Microsoft office excel)를 사용 하 여 단순 회귀 분석에 의해. Spleens, prostates 설립된 방정식을 사용 하 여 이러한 lysates의 CAPG 단백질의 절대 금액으로 변환 되었습니다 lysates의 마우스 신장에서 신호는 QDB 및 결과 총 단백질 양에 의해,이 경우에, 0.3 µ g에서 lysates에 대 한 수정 했다 마우스 spleens 및 신장, 1 µ g lysates pg / µ g으로 이러한 조직에 CAPG 단백질의 최종 농도 대 한 마우스 prostates에서에 대 한. 결과 그림 1C 에서처럼 원래 읽기와 표시 됩니다 표 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> 그림 1 . 3 마우스 조직 (신장, 비장, 전립선)에 절대 CAPG 수준을 결정 하는 QDB 분석의 대표적인 결과입니다. A. 마우스 조직 lysates 비장에서 준비를 사용 하 여 토끼 안티-CAPG 항 체의 특이성을 검사, 심장, 근육, 신장, 간, 그리고 서 부를 사용 하 여 전립선 오 점 부정적인 제어 (IgG 무료 BSA)와 긍정적인 제어 분석 (상업적으로 사용 가능한 CAPG 단백질)입니다. B. lysates 전립선에서 준비를 사용 하 여 토끼 안티-CAPG 항 체의 선형 QDB 분석 정의 신장, 비장, 그리고를 사용 하 여 재조합 표준 CAPG 단백질 정화. 결과 triplicates의 평균 했다입니다. C. 절대 결정의 CAPG 수준 lysates 마우스 신장, spleens, 및 prostates에서 준비. 각 막대는 개별 마우스에서 한 조직을 나타냅니다. 결과 3 중의 평균 했다입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> 표 3: 복용량 연구 직렬로 희석, 둘 다를 사용 하 여 마우스 spleens, 신장, 그리고 prostates 및 순화 된 재조합 CAPG 단백질에서 풀링된 lysates의 microplate 리더에서 유래한 다.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
표 4: 마우스 신장 (8), spleens (4), prostates (5) 표준으로 재조합 CAPG 단백질을 사용 하 여 절대 CAPG 레벨의 QDB 분석의 microplate 리더에서 결과.

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High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

여기 설명 양적 점 오 점 분석 (QDB)의 상세한 과정 대상된 단백질의 절대 내용을 확인 하 여 상한 걸 단백질, 3 개의 다른 마우스 조직에서 gelsolin 같은 (CAPG), 합니다. 높은 처리량, 세포 및 조직 수준에서 바이오 마커 검증에 대 한 편리 하 고, 양적 immunoblot 기술을 설명합니다.

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

high-throughput-absolute-determination-content-selected-protein-at

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

10.9K 조회수.  Binzhou Medical University. 여기 설명 양적 점 오 점 분석 (QDB)의 상세한 과정 대상된 단백질의 절대 내용을 확인 하 여 상한 걸 단백질, 3 개의 다른 마우스 조직에서 gelsolin 같은 (CAPG), 합니다. 높은 처리량, 세포 및 조직 수준에서 바이오 마커 검증에 대 한 편리 하 고, 양적 immunoblot 기술을 설명합니다.

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) data. The protocol presented here describes in detail how to obtain a near-atomic resolution structure starting from cryo-EM micrograph movies by guiding users through all steps of the single particle structure determination pipeline. These steps are controlled from the new SPHIRE graphical user interface and require minimum user intervention. Using this protocol, a 3.5 &#197; structure of TcdA1, a Tc toxin complex from Photorhabdus luminescens, was derived from only 9500 single particles. This streamlined approach will help novice users without extensive processing experience and a priori structural information, to obtain noise-free and unbiased atomic models of their purified macromolecular complexes in their native state.

This paper presents a protocol for processing cryo-EM images using the software suite SPHIRE. The present protocol can be applied for nearly all single particle EM projects that target near-atomic resolution.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have highlighted complex mechanisms of glycogen metabolism, including the diel cycle of biosynthesis and catabolism, redox regulation, and the involvement of non-coding RNA. At the same time, efforts are being made to redirect carbon from glycogen to desirable products in genetically engineered cyanobacteria to enhance product yields. Several methods are used to determine the glycogen contents in cyanobacteria, with variable accuracies and technical complexities. Here, we provide a detailed protocol for the reliable determination of the glycogen content in cyanobacteria that can be performed in a standard life science laboratory. The protocol entails the selective precipitation of glycogen from the cell lysate and the enzymatic depolymerization of glycogen to generate glucose monomers, which are detected by a glucose oxidase-peroxidase (GOD-POD) enzyme coupled assay. The method has been applied to Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus sp. PCC 7002, two model cyanobacterial species that are widely used in metabolic engineering. Moreover, the method successfully showed differences in the glycogen contents between the wildtype and mutants defective in regulatory elements or glycogen biosynthetic genes.

Here, we present a reliable and easy assay to measure the glycogen content in cyanobacterial cells. The procedure entails precipitation, selectable depolymerization, and the detection of glucose residues. This method is suitable for both wildtype and genetically engineered strains and can facilitate the metabolic engineering of cyanobacteria.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are the most important components of phycobilisomes, the major light-harvesting antennae in cyanobacteria and several algae taxa. The phycobilisomes of Synechocystis contain two phycobiliproteins: phycocyanin and allophycocyanin. This protocol describes a simple, efficient, and reliable method for the quantitative determination of both phycocyanin and allophycocyanin in this model cyanobacterium. We compared several methods of phycobiliprotein extraction and spectrophotometric quantification. The extraction procedure as described in this protocol was also successfully applied to other cyanobacteria strains such as Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., and Nostoc sp., as well as to red algae Porphyridium cruentum. However, the extinction coefficients of specific phycobiliproteins from various taxa can differ and it is, therefore, recommended to validate the spectrophotometric quantification method for every single strain individually. The protocol requires little time and can be performed in any standard life science laboratory since it requires only standard equipment.

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Here, we present a protocol to quantitatively determine phycobiliprotein content in the cyanobacterium Synechocystis using a spectrophotometric method. The extraction procedure was also successfully applied to other cyanobacteria and algae strains; however, due to variations in pigment absorption spectra, it is necessary to test the spectrophotometric equations for each strain individually.

Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be bound by many different RBPs that will regulate its production, stability, activity, and degradation. As such, much has been done to understand the dynamics that exist between these two types of molecules. A particularly important breakthrough came with the emergence of &#8216;cross-linking and immunoprecipitation&#8217; (CLIP). This technique allowed stringent investigation into which RNAs are bound by a particular RBP. In short, the protein of interest is UV cross-linked to its RNA substrates in vivo, purified under highly stringent conditions, and then the RNAs covalently cross-linked to the protein are converted into cDNA libraries and sequenced. Since its conception, many derivative techniques have been developed in order to make CLIP amenable to particular fields of study. However, cross-linking using ultraviolet light is notoriously inefficient. This results in extended exposure times that make the temporal study of RBP-RNA interactions impossible. To overcome this issue, we recently designed and built much-improved UV irradiation and cell harvesting devices. Using these new tools, we developed a protocol for time-resolved analyses of RBP-RNA interactions in living cells at high temporal resolution: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (&#967;CRAC). We recently used this technique to study the role of yeast RBPs in nutrient stress adaptation. This manuscript provides a detailed overview of the &#967;CRAC method and presents recent results obtained with the Nrd1 RBP.

Kinetic cross-linking and analysis of cDNA is a method that allows investigation of the dynamics of protein-RNA interactions in living cells at high temporal resolution. Here the protocol is described in detail, including the growth of yeast cells, UV cross-linking, harvesting, protein purification, and next generation sequencing library preparation steps.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and abundance of specific proteins as well as post-translational protein modifications. This technique has a rich history and remains in widespread use due to its simplicity. However, the western blotting procedure famously takes hours, even days, to complete, with a critical bottleneck being the long incubation times that limit its throughput. These incubation steps are required due to the slow diffusion of antibodies from the bulk solution to the immobilized antigens on the membrane: the antibody concentration near the membrane is much lower than the bulk concentration. Here, we present an innovation that dramatically reduces these incubation intervals by improving antigen binding via cyclic draining and replenishing (CDR) of the antibody solution. We also utilized an immunoreaction enhancing technology to preserve the sensitivity of the assay. A combination of the CDR method with a commercial immunoreaction enhancing agent boosted the output signal and substantially reduced the antibody incubation time. The resulting ultra-high-speed western blot can be accomplished in 20 minutes without any loss in sensitivity. This method can be applied to western blots using both chemiluminescent and fluorescent detection. This simple protocol allows researchers to better explore the analysis of protein expression in many samples.

An ultra-high-speed western blotting technique is developed by improving the kinetics of antigen-antibody binding through cyclic draining and replenishing (CDR) technology in conjunction with an immunoreaction enhancing agent.