이 연구는 교내 연구, 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소, 건강의 국립 연구소의 부서에 의해 지원되었다. S.H.는 일본 공립-민간 파트너십 학생 유학 유학 프로그램의 지원을 받았으며, H.N.과 K.Y.는 용맹및 V.Drug 해외 연수 장학금을 받았습니다.

1. SDS 페이지 및 PVDF 멤브레인으로 전송
<ol><li>SDS-PAGE를 수행하여 상대적인 크기에 따라 단백질을 분리합니다. 참고: 상업용 또는 수제 젤 시스템은 괜찮습니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.</li>
	<li>분리된 단백질을 젤에서 PVDF 멤브레인으로 전달합니다. 참고: 일반적인 전송 방법(반건조 또는 습식 전송)이 적합합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.</li>
</ol>2. PVDF 멤브레인 차단
<ol><li>실온에서 교반하여 1h에 적합한 차단 버퍼로 멤브레인을 배양합니다. 참고: 1차 항체 및 검출 시스템에 따라 적절한 차단 버퍼를 선택해야 합니다. 예를 들어, 가장 일반적인 차단제는 BSA, 무지방 건조 우유, 카제인 및 상업용 합성 폴리머입니다. PBS 및/또는 0.1% Tween20을 사용하는 TBS는 가장 일반적으로 사용되는 버퍼입니다. 이러한 차단 단계는 4°C에서 하룻밤 사이에 수행될 수 있다.</li>
</ol>3. 1 차 항체와 인큐베이션
<ol><li>증류수로 10% 면역반응 강화 제-1 용액(IRE-1)을 준비한다. 소용돌이 잘.</li>
	<li>희석된 1차 항체를 10% IRE-1로 준비한다. 부드럽게 충분히 섞으세요.</li>
	<li>더 큰 멤브레인(4cm x 8cm - 8cm x 8cm)을 사용하는 경우, 항체 용액8mL을 50mL 원심분리관에 넣습니다. 더 작은 멤브레인(2cm x 8cm - 4cm x 8cm)을 사용하는 경우, 항체 용액3mL을 14mL 원형 바닥 폴리프로필렌튜브(재료 표)에넣습니다.</li>
	<li>핀셋으로 PVDF 멤브레인을 집어 들고 블로킹 용액을 간단히 배출하십시오. 장갑을 낀 손가락으로 PVDF 멤브레인을 이 튜브에 삽입하고 전체 멤브레인이 튜브 벽에 부착되도록 합니다. PVDF 멤브레인이 튜브에 삽입되면 원래 안쪽에 겔과 접촉했던 멤브레인의 "단백질 측면"에 직면하십시오. 캡을 단단히 닫습니다.</li>
	<li>50mL 튜브를 유리 병에 삽입하여 혼성화 오븐에 넣습니다. 참고: 이 배양에 14mL 튜브를 사용하면 플라스틱 링 홀더 쌍을 사용하여 50mL 튜브의 중앙에 내부 튜브를 유지하여 50mL 튜브에 14mL 튜브를 삽입하십시오.</li>
	<li>혼성화 오븐을 켭니다.</li>
	<li>6rpm 회전으로 멤브레인을 5분 이상 배양합니다. 참고: 멤브레인이 항상 벽에 부착되어 있고 (내부) 튜브가 수평으로 수평되어 항체 용액으로 멤브레인을 균일하게 덮는지 확인하십시오. 실제 실험 전에 항체 및 배양 시간의 희석을 교정한다.</li>
</ol>4. 멤브레인 워시
<ol><li>회전을 중지합니다.</li>
	<li>핀셋으로 튜브에서 PVDF 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 멤브레인을 PBS-T50mL의 용기에 넣습니다.</li>
	<li>PBS-T로 멤브레인을 간단히 헹구는 다.</li>
	<li>거품이 나타나지 때까지 증류수로 용기에 멤브레인을 헹구는 다. 이것은 항체의 대부분을 제거하는 것입니다.</li>
	<li>PVDF 멤브레인을 용기에서 PBS-T 250mL가 들어 있는 샐러드 스피너로 옮기습니다.</li>
	<li>스피너에 스트레이너 바구니를 놓습니다. 뚜껑을 단단히 고정했는지 확인합니다.</li>
	<li>스피너를 활성화하고 약 20-30 s로 실행합니다.</li>
	<li>용액을 버리고 스피너 내부를 증류수로 간략하게 헹구십시오.</li>
	<li>다시 스피너에 PBS-T의 250 mL을 추가합니다.</li>
	<li>4.6 및 4.7 단계를 반복합니다.</li>
</ol>5. 이차 항체를 가진 배양
<ol><li>증류수로 10% 면역반응 강화 제2용액(IRE-2)을 준비한다. 소용돌이 잘.</li>
	<li>희석된 이차 항체를 10% IRE-2로 준비한다. 부드럽게 충분히 섞으세요.</li>
	<li>3.3 단계에서 명시된 바와 같이 항체 용액 및 튜브의 부피를 선택한다.</li>
	<li>핀셋으로 PVDF 멤브레인을 집어 들고 용액을 간단히 배출하십시오. 3.4 단계에서 명시된 대로 PVDF 멤브레인을 튜브에 삽입합니다.</li>
	<li>50mL 튜브를 유리 병에 삽입하여 혼성화 오븐에 넣습니다.</li>
	<li>혼성화 오븐을 켭니다.</li>
	<li>6rpm 회전으로 멤브레인을 5분 이상 배양합니다. 멤브레인이 항상 벽에 부착되어 있는지 확인하고 (내부) 튜브가 항체 용액으로 멤브레인을 균일하게 덮기 위해 수평인지 확인하십시오. 참고: 실제 실험 전에 인큐베이션 시간을 보정합니다. 이차 항체가 형광으로 수렴되면 어둠 속에서 배양을 수행합니다.</li>
</ol>6. 멤브레인 워시
<ol><li>4.1~ 4.10단계를 따르십시오.</li>
</ol>7. 이미지 수집
<ol><li>화학 발광 검출<ol>
<li>평평한 표면에 반 이식 플렉시블 필름(10cm x 15cm)을 놓습니다.</li>
		<li>5mL 튜브에 화학 발광 기판의 2 성분을 혼합합니다.</li>
		<li>혼합 기판의 1.5mL를 반이식 플렉시블 필름으로 즉시 이송하고 PVDF 멤브레인을 배치한다. 그런 다음 기판 용액의 나머지 부분을 멤브레인으로 이송합니다.</li>
		<li>PVDF 멤브레인을 반투명 플렉시블 필름에 혼합 기판으로 1분 동안 배양합니다.</li>
		<li>핀셋으로 PVDF 멤브레인을 선택하고 기판 용액을 간단히 배출하십시오.</li>
		<li>투명 필름 한 쌍 사이에 멤브레인을 샌드위치.</li>
		<li>화학 발광 모드에서 이미지를 획득합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 검출<ol>
<li>핀셋으로 PVDF 멤브레인을 집어 들고 용액을 간단히 배출하십시오.</li>
		<li>투명 필름 한 쌍 사이에 멤브레인을 샌드위치.</li>
		<li>형광 모드에서 이미지를 획득합니다. 참고: 7.1 단계와 7.2 단계는 최대 감도를 보장하기 위해 이미징 기계와 가까운 곳에서 수행해야합니다.</li>
		<li>배경 신호가 높을 때, PBS-T의 80-100 mL를 가진 용기에서 세척 단계를 수행: 1차 항체에 대해 10 분 헹구고 이차 항체에 대해 6 배 헹구는 다. 참고: 10% IRE 용액으로 희석된 1차 및 이차 항체 는 감도6의손실 없이 최대 8-10회까지 사용할 수 있다. 용액은 최대 1 개월 동안 4 °C로 유지해야합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 이 문서의 내용과 직접적인 관련이 있는 경쟁적 이해관계를 선언하지 않았습니다.

웨스턴 블롯은 40년 전 ~40년 전에 개발된 특정 단백질을 검출하기 위해 널리 사용되는 분석 기법으로7,8. 그이후로, 기술은 기술2,9,10,11,12,13의감도, 속도 및 양을 향상시키는 후속 혁신과 함께 진화를 계속하고있다. 여기에 제시된 향상된 초고속 웨스턴 블로팅 프로토콜은 기존 기술을 몇 가지 크게 향상시킵니다. IRE를 통해 검출 임계값을 낮춤으로써 감도를 희생하지 않고 인큐베이션 시간을 단축합니다. 특수하거나 비싼 장비가 필요하지 않습니다 : 하이브리드 화 오븐에서 튜브를 회전하는 것만으로MTL을 극복하기에 충분합니다. 핵심 혁신은 CDR이 분석의 고갈 계층을 효과적으로 제거한다는 것입니다. 롤러 배양 장치는 일반적으로 용액의 양을 줄이기 위해 사용되지만, MTL을 극복하고 인큐베이션 시간을 줄이는 이 방법의 잠재력은 설명되지 않았다. 전체 절차에 대한 전체 시간의 급격한 감소(도 4)때문에, 차단 된 멤브레인이 하나의 손에있을 때 하루에 서양 얼룩 데이터의 훨씬 더 많은 양을 얻을 수 있습니다, 이는 기존의 서부 블로팅 프로토콜로 그렇게하는 것은 거의 불가능하다. 흔들리는 플랫폼 셰이커에 멤브레인의 인큐베이션은 정적 인큐베이션4,6에해당한다는 점에 유의해야합니다. PVDF 멤브레인을 가정용 상업용 샐러드 스피너에 많은 양의 세척 용액으로 헹구면 절차의 지속 시간이 감소합니다(도4).
이 프로토콜의 성공적인 사용은 IRE 용액 및 인큐베이션 시간으로 항체 희석의 최적화에 의존한다. IRE와 함께 CDR이 감도를 실질적으로 증가하기 때문에 광범위한 항체 적정은 애약의 시작 부분에서 권장된다(도2). 인큐베이션 시간은 고려해야 할 또 다른 요소입니다. 하나는 정전기 조건 하에서 1 차적인 항체를 가진 1 h 배양으로 좋은 서쪽 얼룩 결과가 있을 때, 잠복기 시간은 일반적으로 CDR 조건하에서 5-10 분으로 감소될 수 있었습니다. 예를 들어 1차 항체와 함께 야간 배양이 필요할 때 CDR 잠복기 시간(30분 -6시간)을 약간 더 길게 평가해야 한다. 이차 항체를 가진 희석 및 잠복기 시간 또한 중요합니다. CDR 조건하에서 30 분 이상 인큐베이션은 일반적으로 더 높은 배경을 제공합니다. 따라서, 이차 항체의 주의적 적정은 CDR 인큐베이션의 최대 30분으로 요구된다. 배경 신호가 항체의 신중한 적정 후 높은 경우, 광범위한 세척 단계 (1 차 항체에 대한 10 분 린3 배, 세척 용액80-100 mL을 가진 용기에 이차 항체에 대한 5 분 린스 6 회)를 수행해야합니다.
서양 얼룩 데이터의 품질은 종종 사용되는 항체에 따라 달라집니다. 우리가 서쪽 얼룩에 사용되는 어려운 항체가 있었을 때, 단백질 마커는 때때로 주의 깊은 항체 적정 및 광범위한 세척 후에조차 상당한 신호를 보였습니다. IRE를 이용한 CDR 방법이 비특이적 결합을 증가시키는 경향이 있음을 발견했기 때문에, 항체 희석제에 차단 시약(예: 탈지 우유 등)을 첨가하면 신호 대잡음비(14)를향상시킬 수 있다. 그것은 시간이 많이 걸리는 선별 단계이지만 시도 할 가치가 있습니다.
서부 블롯은 정량적 응용 프로그램2에중요해지고 있다. 화학 발광 검출을 통해 반수량을 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 절차는 이 끝6을제거하고 다시 조사하는 데 적용됩니다. 더 넓은 동적 범위 때문에 형광 검출이 최선의 선택입니다. 이 프로토콜을 사용하면 형광 검출은 정량 적 해석6을위한 선형 동적 범위를 제공합니다. 형광 검출을 가진 CDR 잠복기 시간이 화학 발광 검출을 가진 그 보다는 더 오래 보인다는 것을 언급할 가치가 있습니다.
서부 블롯은 다양한 응용 프로그램을 가지고 있으며 단백질 풍부, 단백질 단백질 상호 작용 및 번역 후 수정을 연구하는 보편적 인 방법으로 남아 있습니다. 예를 들어, 항탄수화물 항체는 이프로토콜(14)을사용하여 서양 블롯에 쉽게 사용될 수 있다. 바이러스성, 세균 및 fugus의 외부 표면에 표현된 다양한 탄수화물 moieties는 병원균에 특정하기 때문에, 감염성 질병의 병원균 인식 및 진단을 위한 귀중한 표적입니다. 따라서, 이 간단한 프로토콜의 적용은 실험뿐만 아니라 서양 블로팅 기술에 의존하는 임상 면역 진단뿐만 아니라 대기 시간의 면도 시간의 많은 조사 영역에 영향을 미칠 수 있습니다.

서양 얼룩 (또한 면역 blot로 알려진) 과학 및 임상 분야의 광범위 에 걸쳐 강력하고 기본적인 기술이다. 이 기술은 단백질1의존재, 상대적 풍부, 상대 분자 질량 및 번역 후 수정을 검사하는 데 사용됩니다. 디지털 이미지 분석과 결합하여, 이 방법은 단백질과 단백질 변형의 풍요로움을 안정적으로 분석할 수있다 2. 서양 얼룩은 일상적으로 수행되지만 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 방법입니다. 막이 있는 항체의 긴 배큐어가 필요합니다. 여기서는 민감도를 희생하지 않고 이러한 제한을 극복하는 인큐베이션 방법의 수정을 설명합니다.
막의 인큐베이션 도중, 항원은 막에 고정되는 동안 항체는 용액에 떠 있습니다. 그들의 높은 친화성 때문에, 항원에 결합하는 항체의 비율은 막에 벌크 용액에서 항체의 확산 보다는 빠릅니다. 이렇게 하면 농도가 낮은 "고갈 층"(그림1)이생성됩니다. 이 기술의 긴 잠복 시간을 담당하는 주요 인자인 수동 확산을 통해 더 먼 항체가 막에 도달하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 효과를 MTL(대량 전송 제한)3이라고합니다. 항체 함유 용액을 반복적으로 배수하고 보충하면 고갈층을 방해하고 MTL4를극복할 수 있다는 것이 제안되었다. 여기서, 우리는 전통적인 서쪽 blotting 프로토콜에서 MTL의 효과를 감소시키고 현저하게 필요한 잠복기를 단축하기 위해이 순환 배수 및 보충 (CDR) 개념을 구현하는 독특한 기술을 고안했다.
짧은 배양 시간으로 검출 감도를 유지하기 위해 항원-항체 반응을 가속화하는 면역 반응 강화 기술을 사용하여 신호 대 잡음 비5를개선하였다. 많은 시판 가능한 면역 반응 향상 제 (IRE)는 2 개의 구성 요소 (솔루션 1 및 2, 재료 표참조)로 구성됩니다. IRE의 독점적 조성 또는 작용 메커니즘은 공개되지 않았지만, 우리는 이전에 IRE가 고체 상 결합 작용에서 항원과 항체 사이의 해리상수를 감소시켰으며, 증가친화도를 나타내는 것은 적어도 부분적으로 IRE6의강화 효과에 책임이 있음을 발견하였다. CDR과 IRE의 조합은 감도를 희생하지 않고 전체 프로시저 시간을 줄이는 초고속 서부 블로팅 프로토콜을 생성합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure Imaging System 600</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure 600</td>
			<td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>NKB-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9310V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9340V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYBAID Micro-4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>seracare</td>
			<td>5430-0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#223; actin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>927-40100</td>
			<td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OXO Salad Spinner</td>
			<td>OXO</td>
			<td>32480V2B</td>
			<td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Sealing Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M PM996</td>
			<td>semi-transparent flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared in a machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

서양 블롯 (또한 면역 blot로 알려진) 생물 의학 연구를 위한 정식 방법. 그것은 일반적으로 특정 단백질의 상대적인 크기와 풍부 뿐만 아니라 번역 후 단백질 수정을 결정 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 풍부한 역사를 가지고 있으며 단순성으로 인해 널리 사용됩니다. 그러나, 서쪽 블로팅 절차는 유명한 처리량을 제한하는 긴 잠복기인 중요한 병목 현상으로 완료하는 데 몇 시간, 심지어 며칠이 걸립니다. 이러한 배양 단계는 막에 고정된 항원에 대한 벌크 용액에서 항체의 느린 확산으로 인해 요구된다: 막 근처의 항체 농도는 벌크 농도보다 훨씬 낮다. 여기서, 우리는 항체 용액의 순환 배수 및 보충 (CDR)을 통해 항원 결합을 개선하여 이러한 배양 간격을 극적으로 감소시키는 혁신을 제시한다. 우리는 또한 분석의 감도를 보존하기 위해 면역 반응 향상 기술을 활용했습니다. CDR 방법과 상용 면역반응 강화제의 조합은 출력 신호를 증폭시키고 항체 인큐베이션 시간을 실질적으로 감소시켰다. 그 결과 초고속 서부 얼룩은 감도 손실 없이 20분 만에 달성할 수 있습니다. 이 방법은 화학 발광 및 형광 검출을 모두 사용하여 서부 얼룩에 적용 될 수있다. 이 간단한 프로토콜은 연구원이 많은 견본에서 단백질 발현의 분석을 더 잘 탐구하는 것을 허용합니다.

이 예는 서쪽 블롯에 면역 강화 기술과 함께 CDR 방법의 효과를 보여줍니다. 정적 배큐베이는 PVDF 멤브레인이 항체 용액으로 배양된 반투명 플렉시블 필름에서 수행되었으며, CDR 인큐베이션은 막과 항체 용액(Movie)을 포함하는 튜브를 회전시켜 혼성화 오븐에 있었다. 도 2는 서쪽 얼룩에 화학 발광 검출에 필요한 각각 항원 및 항체의 양을 보였다. 정적 및 CDR 인큐베이션 모두에서 IRE 용액의 사용은 감도를 증가시켰습니다: IRE는 정적 조건하에서 2.2 μg에서 1.1 μg로 ß-actin을 검출하는 데 필요한 가장 낮은 수량의 세포 용액(항원)을 감소시키고 CDR(그림2A)을사용하여 1.1 μg에서 0.275 μg로 더 감소했습니다. 유사하게, 안티-6x의 최소 농도는 정적인 조건하에서 100 ng/mL에서 50 ng/mL로, CDR 조건하에서 100 ng/mL에서 12.5 ng/mL로 낮췄다(그림2B). CDR 배큐베이션은 5분 또는 10분 동안 정적 인큐베이션(1차 60분, 이차 항체30분)에 비해 검출 한계를 극적으로 낮췄다. 마지막으로, CDR과 IRE의 조합은 이 매우 짧은 배양 기간 내에서도 서변 블롯(0.275 μg 의 세포 용액 검출을 위한 세포 용액의 12.5 μg 및 항-6x 의 12.5 ng/mL)에 우수한 감도를 드러냈다.
두 번째 예는 형광 검출을 가진 서부 블롯에 이 방법의 성공적인 적용을 보여준다(도 3). 형광 검출은 화학 발광 검출과 는 달리, 항체를 제거 / 재 조사하지 않고 동시에 같은 얼룩에 여러 표적을 검출할 수있는 독특한 능력을 가지고 있습니다. (그분) 6 태그된 AP 및 세포 용액에서 의 감액틴은 2색 형광호를 사용하여 동시에 검출되었다. IRE를 가진 CDR 인큐베이션은 검출을 가속화할 뿐만 아니라 감도를 증가시켰으며, 그 결과 (그의)6 태그AP(그림3A)의저하를 해제하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig01.jpg"> 그림 1: 순환 배수 보충(CDR) 방법의 회로도 예시. (A)프로브가 항원에 대한 친화성이 높지만 용액을 통해 확산되는 능력이 제한적일 때 멤브레인 근처의 고갈층은 정적 조건 하에서 빠르게 형성된다. 따라서, 멤브레인으로 프로브의 이동은 속도 제한 단계와 긴 인큐베이션 시간이 질량 전달 제한을 보상한다. (B)막이 벽에 부착되는 동안 튜브를 회전시켜 CDR 방법은 고갈층을 제거하고 멤브레인 근처의 프로브 농도를 일정하게 유지하기 위해 동일한 프로브 용액을 보충한다. 이 수치는 히가시 등에서수정되었습니다. 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61657/61657fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig02.jpg"> 도 2: (A)상이한 양 293셀 리사트(8.8 μg/레인에서 1:2 직렬 희석)는 SDS-PAGE에 의해 분리되었고, 그 다음으로 PVDF 멤브레인으로 이송되고 PBS-T에서 5% 탈지 우유로 차단하였다. 블롯은 마우스 안티-ß-액틴 항체(1:3,000 희석)로 조사되었다. (B)pAPTAG5(GenHunter)를 함유한 293세포로부터 유래된 조건부 물질을 분리한 후, 6태그알칼리인포스파타제(AP, 8 x 10-14 mol/lane)를 함유하고 있으며, 단백질은 PVDF 멤브레인으로 전달되었다. 각 멤브레인은 항-6x 의 상이한 농도의 서쪽 블롯을 실시하였다(400 ng/mL에서 1:2 직렬 희석). 멤브레인은 단일 이미지로 이미지화되었으며 점선은 개별 멤브레인의 경계를 나타냅니다. 이 수치는 히가시 등에서수정되었습니다. 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61657/61657fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig03.jpg"> 그림 3: IRE와 함께 형광 검출 및 CDR을 사용하여 서부 블롯에서 여러 표적을 동시에 검출합니다. pAPTAG5로 감염된 293개의 세포로부터 의 상이한 양의 용액(10 μg/차선에서 1:2 직렬 희석)을 분리하여 PVDF 멤브레인으로 이송하였다. 1h용 형광 검출(BFD)을 위한 블로킹 버퍼로 차단한 후, 블롯은 안티-6X 그의 태그와 안티 ß-actin 항체로 조사되었고, IRDye 800CW 염소 안티래빗 IgG 및 IRDye 680RD 염소 안티 마우스 IgG가 그 뒤를 이었다. A: CDR 조건 하에서 10% IRE 용액으로 희석된 항체, B: 정전기 조건 하에서 0.1% Tween20을 함유하는 BFD로 희석된 항체. CDR 과 IRE 조합으로 높은 감도 때문에 (그의)6 태그 AP의 저하가 보였다. 이 수치는 히가시 등에서수정되었습니다. 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61657/61657fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig04.jpg"> 그림 4: 기존의 정적 방법에 비해 향상된 초고속 CDR 웨스턴 블롯의 회로도 그림입니다. 이 수치는 히가시 등에서수정되었습니다. 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61657/61657fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

초고속 서양 블로팅 기술은 면역 반응 강화 제와 함께 순환 배수 및 보충 (CDR) 기술을 통해 결합하는 항원 항체의 운동성을 개선하여 개발됩니다.

면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.8K 조회수.  National Institutes of Health. 초고속 서양 블로팅 기술은 면역 반응 강화 제와 함께 순환 배수 및 보충 (CDR) 기술을 통해 결합하는 항원 항체의 운동성을 개선하여 개발됩니다.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western blotting protocol was optimized and suitable for the analysis of small numbers of HSCs (500 - 15,000 cells). Phenotypic HSCs were purified, accurately counted, and directly lysed in Laemmli sample buffer. Lysates containing equal numbers of cells were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the blot was prepared and processed following standard Western blotting protocols. Using this protocol, 2,000 - 5,000 HSCs can be routinely analyzed, and in some cases data can be obtained from as few as 500 cells, compared to the 20,000 to 40,000 cells reported in most publications. This protocol should be generally applicable to other hematopoietic cells, and enables the routine analysis of small numbers of cells using standard laboratory procedures.

A standard Western blotting protocol was optimized for analyzing as few as 500 hematopoietic stem or progenitor cells. Optimization involves careful handling of the cell sample, limiting transfers between tubes, and directly lysing the cells in Laemmli sample buffer.

조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and tissue level significantly hampers the progress in proteomic research. Results derived from currently available immunoblot techniques are also relative, preventing any efforts to combine independent studies with a large-scale analysis of protein samples. In this study, we demonstrate the process of quantitative dot blot analysis (QDB) to achieve absolute quantification in a high throughput format. Using a commercially available protein standard, we are able to determine the absolute content of capping actin protein, gelsolin-like (CAPG) in protein samples prepared from three different mouse tissues (kidney, spleen, and prostate) together with a detailed explanation of the experimental details. We propose the QDB analysis as a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method of absolute quantification of individual proteins at the cellular and tissue level. This method will substantially aid biomarker validation and pathway verification in various areas of biological and biomedical research.

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Here we demonstrate a detailed process of quantitative dot blot analysis (QDB) by determining the absolute content of a targeted protein, capping actin protein, gelsolin-like (CAPG), in three different mouse tissues. We demonstrate a high throughput, convenient, quantitative immunoblot technique for biomarker validation at the cellular and tissue level.

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial species, the koala (Phascolarctos cinereus), faces prolonged exposure to anthropogenic-induced stressors and assessment of chronic stress in wild populations is urgently warranted. One of the most effective ways to measure chronic stress is through analyzing the glucocorticoid hormone cortisol in hair or fur, as it supports physiological and behavioral responses. This laboratory validation study aims to test current techniques to validate an optimal hormone extraction method to be used as a non-invasive measure of cortisol in koala fur. It is recognized that using non-invasive techniques to measure stress hormones is preferred over traditional, invasive techniques due to their ideal practical and ethical standpoints. Additionally, it is comparatively easier to acquire fur from koalas than it is to acquire samples of their blood. This study used samples of koala fur acquired from the Adelaide Koala and Wildlife Hospital to run a number of hormone extraction techniques in an attempt to validate an optimal cortisol extraction method. Results showed that 100% methanol provided the most optimal solvent extraction compared to 100% ethanol or 100% isopropanol based on parallelism results. In conclusion, this method of cortisol extraction from koala fur provided a reliable non-invasive assay that could be used to study chronic stress in koalas.

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

We present a protocol to determine the optimal extraction solvent to measure cortisol from koala fur. The solvents used in this protocol are methanol, ethanol and isopropanol. Determining an optimal extraction solvent will aid in reliably measuring fur to determine the impact of chronic stress on koalas.

코알라의 코티솔 측정(파스콜아크토시네레우스)모피

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally identified by harnessing the competitions between amino acids and their analogs. However, this analog-based method is of low accuracy, and proper analogs for specific amino acids are limited. Here, we present an alternative strategy that enables an accurate, sensitive, and high-throughput screening of amino acid overproducers using rare-codon-rich markers. This strategy is inspired by the phenomenon of codon usage bias in protein translation, for which codons are categorized into common or rare ones based on their frequencies of occurrence in the coding DNA. The translation of rare codons depends on their corresponding rare transfer RNAs (tRNAs), which cannot be fully charged by the cognate amino acids under starvation. Theoretically, the rare tRNAs can be charged if there is a surplus of the amino acids after charging the synonymous common isoacceptors. Therefore, retarded translations caused by rare codons could be restored by feeding or intracellular overproductions of the corresponding amino acids. Under this assumption, a selection or screening system for identifying amino acid overproducers is established by replacing the common codons of the targeted amino acids with their synonymous rare alternatives in the antibiotic resistance genes or the genes encoding fluorescent or chromogenic proteins. We show that the protein expressions can be greatly hindered by the incorporation of rare codons and that the levels of proteins correlate positively with the amino acid concentrations. Using this system, overproducers of multiple amino acids can be readily screened out from mutation libraries. This rare-codon-based strategy only requires a single modified gene, and the host is less likely to escape the selection than in other methods. It offers an alternative approach for obtaining amino acid overproducers.

This study presents an alternative strategy to the conventional toxic analog-based method in identifying amino acid overproducers by using rare-codon-rich markers to achieve accuracy, sensitivity, and high-throughput simultaneously.

희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자 식별

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal transduction, metabolism, and development. These metabolites perform this regulatory activity by binding to proteins, thereby changing protein conformation, catalytic activity, and/or interactions. The method described here uses affinity chromatography coupled to mass spectrometry or Western blotting to identify proteins that interact with inositol phosphates or phosphoinositides. Inositol phosphates or phosphoinositides are chemically tagged with biotin, which is then captured via streptavidin conjugated to agarose or magnetic beads. Proteins are isolated by their affinity of binding to the metabolite, then eluted and identified by mass spectrometry or Western blotting. The method has a simple workflow that is sensitive, non-radioactive, liposome-free, and customizable, supporting the analysis of protein and metabolite interaction with precision. This approach can be used in label-free or in amino acid-labelled quantitative mass spectrometry methods to identify protein-metabolite interactions in complex biological samples or using purified proteins. This protocol is optimized for the analysis of proteins from Trypanosoma brucei, but it can be adapted to related protozoan parasites, yeast or mammalian cells.

This protocol focuses on the identification of proteins that bind to inositol phosphates or phosphoinositides. It uses affinity chromatography with biotinylated inositol phosphates or phosphoinositides that are immobilized via streptavidin to agarose or magnetic beads. Inositol phosphate or phosphoinositide binding proteins are identified by Western blotting or mass spectrometry.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular processes. The conserved MEEVD pentapeptide at the C-terminus of Hsp90 is responsible for the interaction with the tetratricopeptide repeat (TPR) motif of co-chaperones. FK506-binding protein (FKBP) 51 and FKBP52 are two similar TPR-motif co-chaperones involved in steroid hormone-dependent diseases with different functions. Therefore, identifying molecules specifically blocking interactions between Hsp90 and FKBP51 or FKBP52 provides a promising therapeutic potential for several human diseases. Here, we describe the protocol for an amplified luminescent proximity homogenous assay to probe interactions between Hsp90 and its partner co-chaperones FKBP51 and FKBP52. First, we have purified the TPR motif-containing proteins FKBP51 and FKBP52 in glutathione S-transferase (GST)-tagged form. Using the glutathione-linked donor beads with GST-fused TPR-motif proteins and the acceptor beads coupled with a 10-mer C-terminal peptide of Hsp90, we have probed protein-protein interactions in a homogeneous environment. We have used this assay to screen small molecules to disrupt Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions and identified potent and selective Hsp90-FKBP51 interaction inhibitors.

This protocol presents a technique for probing protein-protein interactions using glutathione-linked donor beads with GST-fused TPR-motif co-chaperones and acceptor beads coupled with an Hsp90-derived peptide. We have used this technique to screen small molecules to disrupt Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions and identified potent and selective Hsp90-FKBP51 interaction inhibitors.

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...