이 작품은 샤론 E. 강사에 게 수 여 하는 NIH 그랜트 GM59354에 의해 지원 되었다. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 앤 Lavanway와 기술 지원에 대 한 제이 에밀리 리드 형광 팔 프로브를 생성 하기 위한 프로토콜을 개발에 도움에 감사 위이 Q. 응웬 하 고. 우리는 또한 유용한 토론 및 조언을 위한 초파리 커뮤니티에서 수많은 동료를 감사합니다.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes.">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li><li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation.">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li><li>Radford, S. J., McKim, K. 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저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

물고기를 사용 하 여 나 고 분열 prometaphase 팔 응집력의 상태를 평가 하기 위해 프로브 나 초파리 oocytes 초파리 감수 분열의 분야에서 중요 한 발전 이다. 역사적으로, 초파리 연구 성숙 oocytes11,,1819팔 응집력의 조 손실 유추를 유전자 검사로 제한 되었습니다. 자, 여기에 제시 된 방법으로 팔 단결력의 상태 수 수 분석 직접 물고기를 사용 하 여. 크게 팔 단결력의 조 손실에 대 한 물리적 증거를 얻을 수 초파리 oocytes에서 팔 응집과 염색체 missegregation의 조 손실 메커니즘 연구에 사용할 수 있는 접근의 레 퍼 토리를 확장 합니다.
중요 한 단계 우리가 하지 염색체 팔 성숙한 초파리 oocytes에 따라 단일 복사본 시퀀스에 hybridizes 형광 프로브의 성공적인 시각화에 필요한 중요 한 매개 변수에 대 한 체계적인 분석을 수행 했습니다, 하지만 우리는 제공 합니다 이 방법의 성공에 기여 할 수 있습니다 요인의 다음 목록. 팔 프로브를 생성 하려면 사용 하는 X에 약 0.8 m b의 간격을 커버 하는 BAC 프로브 겹치는 6의 조합-염색체 팔. 적은 BACs를 더 작은 영역을 사용 하 여 우리의 초기 시도 실패 했다. 또한, 그리고 알 렉 사-647로 끝 레이블 전에 BAC DNA를 증폭 하는 방법을 사용는 우리. 분류 된 제한 조각의 대부분은 100-200 bp 긴 (그림 2), 두꺼운 조직21을 통해 효율적인 보급에 필요한 150 뉴클레오티드의 대상 크기와 잘 동의 했다. 큰 초파리 oocyte의 형태를 유지 하지만 또한 프로브 삽입을 허용 하는 고정 조건 필수적입니다. 우리 실내 온도 헵 37 ° c.에 preheated 수정 솔루션에 추가 하 여 우리의 이전에 사용한 고정 방법23 수정 우리 생각 vitelline 막으로 고정을 위한 낮춘된 온도 통해 침투를 증가 하기 위하여 헵 추가 팔 단결력의 시각화를 위한 성공적인 고정 조건에 기여 가능.
응집력의 조 손실 시 금, 하나 존재 하는 결함의 정량화를 허용 하는 샘플 크기 필요 합니다 낮은 중간 수준에. 성숙한 oocytes의 많은 수를, 다른 믹서 기 장애 성인 여성 26,27체질 결합의 사용 해 왔다. 여기 우리 손에 방법 설명 해 부 20-25 여성에서 난소, 수동 분리 늦게 pipetting으로 oocytes 무대. 믹서 기/체질 방법이 프로토콜도 동작 하는 동안 한 손 해 부의 장점은 그 체질 하 단계 없이 oocytes 적은 시간을 할애 anaphase의 기회를 감소 고정 하기 전에 버퍼에 나 인공적인 계란 인해 발병 활성화입니다. 또한,이 시작 물자로 적은 여성 필요, 시 약의 작은 볼륨을 사용 하 여 메서드와 간단한 워크플로 모두 여러 genotypes 처리 용이 있다.
성숙한 oocytes의 손 해 부 및 수동 분리 chorion 및 vitelline 막 제거 oocytes "롤"의 충분 한 수량을 제공 하 고 교 잡 세척의 끝에 약 75-150 oocytes에서 결과. 수율을 최대화 하기 위해 하나의 트릭 분열 oocytes를 체포 해 부25전에 남성의 부재에 yeasted 튜브에 처녀 여성을 보유 하는. Chorions 및 vitelline 막 제거를 압 연 oocyte oocytes 파괴를 피하기 위하여 부드러운 터치와 함께 수행 되어야 합니다. 그러나,는 oocytes의 100%에서 chorions 및 vitelline 막 제거 현실적인 목표 이며 oocytes의 손실에 결과 과도 한 롤링만. 따라서, 각 회전 주기 중지 되어야 할 때 oocytes 부족 chorions 및 vitelline 막의 약 75-85%.
제한 사항 생성 및 성숙 초파리 oocytes 응집력의 상태를 모니터링 하려면 팔 프로브를 사용 하 여 우리의 성공에도 불구 하 고 절차는 여전히 한계에서 고통. 우리가 거의 pericentromeric 프로브에 대 한 신호를 감지 하지 못했습니다, 동안 팔 프로브 신호는 약한 또는 우리가 몇 군데는 oocytes의 약 15-20%에서 결 석. 하나의 기여 요인이 큰 팔 프로브 (100-200 뉴클레오티드) 대 pericentric oligonucleotide 조사 (22-28 뉴클레오티드)의 차동 침투 수 있습니다. 또한, 큰 반복 시퀀스 pericentric 조사 결과 팔 프로브 보다 밝은 신호에 의해 인식. Oocyte는 oocyte 내 meiotic 염색체의 배치의 방향은 또한 이미징 때 도전을 제시. Meiotic 염색체 셀 피 질에 가까운 상대적으로 있지만는 coverslip에 장착 된 oocyte의 방향을 제어할 수는. 따라서, 일부는 oocytes 분수에 meiotic 염색체는 coverslip와 신호 강도에서 100-200 µ m를 있을 수 있습니다 하 고 품질 수 있습니다 부정적인 영향을 미칠 수는 oocyte의 대량 통해 이미지 하려고 할 때 키를 누릅니다. 이러한 제한은 oocytes 최종 정량 분석에 포함 된 수 oocytes 프로토콜에서 처리의 숫자 보다 상당히 낮은 의미 합니다. 100 oocytes 팔 응집력의 상태 결정 가장 필요 합니다 두 개의 독립적인 준비. 단결력 결함 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여 측정에 추가적인 제한 요소는 전형적인 Z 시리즈 (약 5 분), 포착 하는 데 필요한 시간 캡처된 영역 1024 x 512 픽셀에 국한 됩니다 경우에. 즉, 제어 및 실험 genotypes (각 100 oocytes) 응집력의 비교 이미지 컬렉션 시간 약 16 h 필요한 것입니다.
수정 및 문제 해결 우리 팔 단결력 cytological 위치 6E-7B19 X 염색체를 인식 하는 프로브를 사용 하 여 상태 모니터링을 수 있다. X 염색체에 더 원심 위치에 hybridizes 프로브를 감지 chiasma 유지 보수의 실패에 대 한 더 바람직 있을 수 있습니다. 또한, 다른 연구자는 다른 염색체에 팔 단결력을 분석 하실 수 있습니다. 우리 프로브는 autosomes 시도 하지, 예비 데이터 또한 X 염색체의 2 층-3 C 지역 인식 프로브를 감지 신호에 결과 나타냅니다. 그러나, 제한 된 임시 데이터를 바탕으로, 2 층-3 C 프로브의 신호 수 있습니다 6E-7B 프로브에 대 한 보다 덜 "소형". 물고기 신호는 빡 빡 하 고 일부 oocyte 염색체에 대 한 선명 하 고, 비록 다른 oocytes의 염색체에 교 잡 신호는 상당히 더 확산 이다. 신호에 이러한 차이가 두 cytological 위치 사이 염색체 형태에서 진짜 차이 반영, 두의 교 잡 효율에서 변화 조사, 또는 다른 oocytes 사이 그냥 확률 변화 됩니다. 더 철저 한 분석을 필요로 합니다.
중요 한 것은, 약간 oocytes에 확산 염색체 신호 관찰도 6E-7B 프로브에 대 한 고이 자주 분석에서 그들의 배타를 필요한. 또한, 우리 신호 품질과 6E-7B 프로브의 다른 준비 사이의 밝기에 변화를 발견 했습니다 그리고이 필요한 그 이미지 매개 변수를 적절 하 게 조정 될. 42 ° C에 교 잡 온도 높여 확산 신호와 oocytes의 수를 축소 하지 않았다 그러나 pericentric oligonucleotide 조사에 대 한 신호를 영향 심각 했 어. 더 나은 염색체 형태24를 보존 하기 위해 노력, 우리 또한 낮은 온도 (80 ° C)에서 더 이상 변성 단계 했지만 발견이 치료도 신호 강도 증가와 확산 oocytes의 수를 감소 염색체 물고기 신호입니다. 우리는 또한 cytological 지역 5E-7B를 약 1.5 Mb 간격에 해당 하는 12 겹치는 BACs를 사용 하 여 밝은 팔 신호를 얻기 위해 시도 했다. 12 BAC 프로브를 사용 하는 경우 신호 강도에 변이의 정도 뿐만 아니라 신호 부족 oocytes의 비율 6 BACs 팔 프로브를 확인 하는 데 사용 했다 때 다 했다. 그것은 또한 물고기 신호 했다 더 큰, 더 어려운 개별 chromatids에 해당 하는 관광 명소를 해결 하 고 있기 때문에 12 BAC 프로브를 사용 하 여 응집 결함에 대 한 점수를 더 도전 이었다. 신호가 새로 준비 프로브와 함께 가져온 경우, 연구자는 증폭의 크기를 확인 해야 하 고 제한 소화 BAC DNA 파편 끝 라벨에 사용 되는 100-200 bp 범위 내에서 주로 확인 하. 이 성공적인 조사 준비에서 가장 중요 한 요소 중 하나가 될 것입니다.
미래 방향 이미지 수집으로 immunostaining를 포함 하는 프로토콜을 적응을 향상 시키기 위해 미래의 작업 다른 연구자를 도움이 될 것 이라고 주요 개선 될 것 이다. 이미지 수집, 중 축 차원 뿐만 아니라 빠른 이미지 수집 이미지의 큰 숫자를 수집 것입니다 단결력 결함 측정을 위한 유리한. 레이저 공초점 레이저 스캐닝 이미징 매개 변수 최적화, 우리는 0.25 µ m는 Z 시리즈에 대 한 물고기의 감지할 수 표백 방지 하기 위해 사용 될 수 있는 작은 단계 크기 신호 발견. 그러나, 물고기 Z 스택의 미만 0.25 µ m에 의해 구분 되는 신호에 대 한이 단계 크기는 foci 사이 "공간"을 잡으려고 실패 될 수 있습니다 하 고 따라서 단결력 결함의 수를 과소 평가 수 있습니다. Confocal 회전 디스크의 빠른 이미지 수집 속도 작은 단계 크기 표백 신호 없이 사용할 수 있습니다. 이 것이 축 차원에 보다 정확한 이미지 재건을 제공 뿐 아니라 oocytes 단결력 결함에 대 한 분석의 많은 수를 허용. 또한, 팔 응집 상태의 생선 시각화와 immunostaining을 결합 하는 능력 프로토콜 향상 시킬 크게 것 이다. 다양 한 준비에 대 한 스핀 들 immunostaining 교 잡 절차를 수행 하 여 보았습니다. 그러나, 강력한 스핀 들 얼룩에 oocytes의 극히 일부에 표시 했다. 또한, 명확 하지 않은 이유를 위해 가짜 물고기 신호의 상부 포위 meiotic 염색체 물고기와 immunostaining 결합 했다. 앞 이나 물고기 절차 후 immunostaining를 허용 하는 프로토콜을 최적화 하기 위해 추가 작업이 기술의 기능을 확장 크게 것 이다.

유사 분열, 감수 분열 동안 염색체의 적절 한 분리 필요 그 자매 chromatid 단결력, 유지, 설립 될와 조정된 패션1,2에 발표. 단결력 S 단계 설정 되 고 복잡 한, 자매는 실제 관계를 형성 하는 cohesin에 의해 중재 chromatids 함께. 감수 분열에서 결합 한 크로스 오버를 원심 또한 함께 재조합 homologs를 기능과이 실제 협회를 통해 올바른 방향이는 분열에의 나는 (그림 1)3,4, 스핀 들 5. 팔의 릴리스 anaphase에 응집력 나 반대 스핀 들 극을 분리 하는 homologs 수 있습니다. 그러나, 팔 단결력은 경우 중간, 손실 재조합 homologs 그들의 물리적 연결을 잃게 되며 임의로, 분리는 aneuploid gametes (그림 1)에서 발생할 수 있습니다.
인간의 oocytes에서 염색체 분리에 오류 유산 및 기형 아 출산, 다운 증후군6, 등의 주요 원인이 되며 그들의 발생 산 모 나이7기 하 급수적으로 증가. 자매 chromatid 단결력 태아 oocytes에서 설정 되 고 meiotic 재결합 출생 하기 전에 완료 됩니다. Oocytes 다음 체포 중간 의향에 나 배 란까지 고이 체포 하는 동안, 재조합 homologs의 지속적인된 물리적 협회 의존 자매 chromatid 단결력. 따라서, 감수 분열과 정상 임신 결과 정확한 분리 결합 최대 5 년간 그대로 유지 해야 합니다.
인간의 oocytes의 장기간된 meiotic 체포 중 응집 조 손실 모성 연령 효과에 기여할 제안 되었습니다와 증거의 여러 줄이 가설8,9를 지원 합니다. 그러나,이 현상의 우리의 이해의 대부분 모델 생물5,10,,1112, 를 사용 하 여 의존 인간의 oocytes meiotic 응집력의 과제를 감안할 때, 13,,1415.
초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집과 염색체 분리의 연구에 대 한 수많은 이점을 제공합니다. 간단한 유전자 분석 결과 수 aneuploid gametes에서 자손을 복구 하 고 X의 충실도 측정-대규모11,,1617에 염색체 분리. 또한, 하나 또한 나 팔 단결력11,18, 의 조 손실에 일치 하는 표현 형 감수 분열 시 재조합 homologs missegregate 때문에 염색체 분리 오류 발생 여부를 결정할 수 있습니다 19. 초파리 oocytes meiotic 응집력의 상태 관찰은 또한 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 직접. 비록 반복적인 위성 시퀀스에 교배 하는 형광 oligonucleotides 사용 되었습니다 10 년 이상 모니터링 성숙 초파리 oocytes4,20, 팔의 분석에서에서 pericentromeric 결합 하 단결력은 더욱 어려운 되었습니다. 팔 단결력의 상태 시각화 단일 복사본의 큰 영역에 걸쳐 프로브 시퀀스 이며 충분히 밝은 결과 개별 여동생에 대 한 표시 신호 chromatids 팔 단결력은 결 석 하는 경우 필요 합니다. 또한, oocyte 고정 조건 및 레이블이 지정 된 DNAs의 크기 큰 성숙한 초파리 oocyte (200 µ m 넓은 500 µ m 길이 의해)에 침투21 를 촉진 해야 합니다. 최근, 한 팔 조사는 성공적으로 활용, 하지만 저자 anaphase 동안 초파리 oocyte chromatids를 시각화 하기 위해 명시 된 그들은 prometaphase에 신호를 감지 하지 못했습니다 또는 분열 oocytes22를 체포. 여기 우리는 X의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제공-염색체 팔 물고기 조사 조건과 oocyte 준비 나 하 고 분열 chromatid 응집력 prometaphase 언 니의 조기 상실에 대 한 분석 결과 허용 난 oocytes. Meiotic 단결력의 유지 보수에 필요한 유전자 제품을 사용, 이러한 기술을 동생에 대 한 분석 결과를 다른 수 chromatid 단결력 다른 genotypes의 성숙한 초파리 oocytes에 결함.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Prep BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA2</td>
			<td>Amplify BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21676</td>
			<td>Label BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals &#38; Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Prepare 10% stock 
			Freeze aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C75-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100&#181;g/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 &#176;C. Prepare 1 &#181;g/ml solution in 2X SSCT before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite</td>
			<td>Drierite Company</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15508-013</td>
			<td>Prepare 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP (10 &#181;mol, 100 &#181;l)</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>1277049</td>
			<td>Prepare 1 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>Prepare 250 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (molecular grade, 200 proof)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>18505</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>901393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Boehringer Mannheim</td>
			<td>737-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H350-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HX0603-4</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>438227</td>
			<td>Prepare 3 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.9 M Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>104-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 &#376; 7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 &#376; 2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (0.1mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S209-500</td>
			<td>Prepare 3M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1131</td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28320</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Triton X-100</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28314</td>
			<td>Surfact-Amps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC (Saline Sodium Citrate)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 M NaCl, 300 mM sodium citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X cacodylate fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1X Hybridization buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSBTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSTx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction buffer (PBSTx + Rnase)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 &#181;g/mL RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 0.1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 20% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 40% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT + 50% formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AluI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0137S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaeIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0108S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MseI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0106S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0167S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuCI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0636S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NEB buffer #2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/&#181;l</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>3333566001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT buffer</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology Tools etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#5 INOX, Biologie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#8221; Disposable glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td>Autoclave to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass dissecting dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well dish (3 wells)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7223-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-104</td>
			<td>Used to cover deep well dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted glass slides, 25 x 75 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>48312-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>3405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong GOLD mounting media</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed-air in can</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000, spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at room temperature</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microfuge at 4 &#176;C</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven or incubator with rotator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSi laser scanning confoal</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables etc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;l microfuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l PCR tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic container with tight fitting lid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>To hold Drierite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>disposable wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC purified 5&#39;-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescence in situ hybridization (fish) to monitor the state of arm cohesion in prometaphase and metaphase i drosophila oocytes

인간에서는, oocytes에서 염색체 분리 오류 유산 및 기형 아 출산의 대부분에 대 한 책임이 있습니다. 또한, 여자 나이, 그들 마음속에 aneuploid 태아는 극적으로 증가 하 고이 현상의 위험 모성 연령 효과로 알려져 있다. Meiotic 분열 동안 정확한 염색체 분리에 대 한 요구 사항 중 하나는 자매의 유지 보수 oocytes 경험 확장된 의향 기간 chromatid 단결력. 인간 및 모형 유기 체에서 cytological 증거 meiotic 단결력 노화 과정 동안 악화 나왔다. 또한, 인간의 oocytes에서 분리 오류는 감수 분열 중 가장 널리 퍼진 나 팔 단결력의 조 손실와 일치. 모델 생물의 사용은 기초가 단결력의 연령에 따라 손실 메커니즘을 탈피 중요 합니다. 초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집력의 규칙을 공부에 대 한 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 최근까지, 유전 시험만 팔 응집력 oocytes 다른 genotypes 또는 다른 실험 조건에서의 손실에 대 한 분석 결과를 사용할 수 없었습니다. 여기, 상세한 프로토콜 형광에서 제자리에서 사용 하기 위한 교 잡 (물고기)을 직접 시각화 결함 prometaphase 팔 응집력에 나 고 분열 초파리 oocytes를 체포 하는 제공 됩니다. X 염색체의 원심 팔 hybridizes를 물고기 프로브를 생성 하 여 수집 하는 confocal Z 스택 연구원 수 3 차원에서 개별 물고기 신호의 수를 시각화 하 고 자매 여부 결정 chromatid 무기 분리. 설명한 팔 단결력 결함 초파리 oocytes의 수백에 계량을 가능 하 게. 따라서,이 방법은 단결력 유지 보수 뿐만 아니라 노화 과정의 죽음으로 이어질 요인에 기여 하는 메커니즘을 조사는 중요 한 도구를 제공 합니다.

그림 5 는 X 염색체에 cytological 지역 6E-7B에 hybridizes는 팔 조사로 얻은 이미지를 선물 한다. 공동의 DAPI, localizes 신호에서이 조사 결과 배경에서 쉽게 구별할 수 이며 팔 단결력 결함 다른 genotypes19에 척도를 성공적으로 사용 되었습니다. 단결력 결함의 부 량 제한 되었다 prometaphase에 어 분열 I 단계; 핵 붕괴 이전 oocytes 분석19에서 제외 했다. 그대로 핵 봉투 oocyte 염색체 주변 세포질 보다 개별 원형 지역에 의해 둘러싸여 있을 것입니다 때문에 DAPI 채널에서 스캔할 때 분명 하다.
그림 5B deconvolution 및 대비 향상 후 개별 Z 시리즈의 최대 강도 계획을 보여 줍니다. 단결력 결함의 정량화 물고기의 수 신호는 중복 DAPI 신호를 각 프로브에 대 한 결정이 필요 합니다. 이러한 분석에 대 한 3 차원에 병합 된 이미지의 시각화 필수적입니다. 모든 3 개 차원에서 DAPI 신호에 명확 하 게 연관 된 물고기 명소만 분석에 포함 되어야 합니다.
그대로 동생 chromatid 단결력 팔 및 pericentric 프로브 (그림 5B, 왼쪽)에 대 한 두 개의 물고기 관광 명소로 입증 됩니다. Oocytes 어느 프로브에 대 한 3 개 또는 4 개의 분리 된 물고기 명소를 포함 하는 단결력 결함 (그림 5B, 오른쪽) 간주 됩니다. 개별 관광 명소로 분류 되기 위하여 두 물고기 신호는 작은 반점의 직경에 해당 하는 거리에 의해 모든 3 개 차원에서 최소한 구분 되어야 합니다. 두 물고기 관광 명소를 연결 하는 얇은 희미 한 스레드 흔하지 않습니다. 이러한 신호는 완전히 분리 된 간주 되지 않습니다 하 고 따라서 단결력 결함의 인스턴스로 계산 되지 않습니다.
6E-7B 팔 교 잡 조사, 약 15-20% 몇 군데 oocytes의 완전히 부족 신호 또는 신호 자신 있게 점수 너무 약 했다. 또한, 약 5% 군데 oocytes의 전시 염색체 신호 확산의 큰 영역 고 이러한 분석에서 삭제 했다. 반면, oocytes는 pericentric 교 잡 신호 누락 되었거나 너무 점수에 확산 발생 희귀 했다.
6E-7B 팔 프로브 prometaphase 팔 단결력 결함을 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다과 분열의 초파리 oocytes를 체포 다른 genotypes19. 때 cohesin 소 단위 SMC3는 뜨 중간 의향, 포함 된 분석 성숙한 oocytes의 16.3% 동안 두 개의 관광 명소, 팔 단결력의 조기 상실을 나타내는 팔 보다 큰. 대조적으로, SMC319의 정상적인 수준에 포함 된 oocytes의 5.1%에서 분리 된 팔 명소 관찰 합니다. 흥미롭게도, 비록 팔 단결력의 주파수 결함 여러 최저의 genotypes, 자매 chromatids 거의 그들의 pericentric 지역19에서 분리 되었다에서 상승 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig1.jpg"> 그림 1: 내가 체포 확장된 의향 동안 응집력의 연령에 따라 손실 여성 감수 분열의 계란에 이수성 염색체 분리에 오류에 발생할 수 있습니다. 단결력 자매 사이 검은 막대에 의해 대표 된다 chromatids. 팔 단결력 재조합 homologs를 함께 개최 기능과 anaphase에서 정확한 분리에 필요한 나. 팔 단결력은 분실 된 중간, aneuploid 계란의 결과로 염색체 missegregation 발생할 수 있습니다. 이 그림 참조19에서 적응 시켰다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig2.jpg"> 그림 2: 그리고 3 개의 다른 BACs에 금지 효소 소화 (오른쪽) BAC 조각화 및 증폭 (왼쪽) 후 DNA 분자의 크기. 400 ng 증폭된 DNA 제품의 처음 3 개의 차선에 표시 됩니다. 마지막 3 개의 차선 하룻밤 제한 다이제스트 후 DNA 파편을 표시합니다. 증폭된 DNA 제품 범위 200에서 bp 최대 3 kb. 제한 다이제스트, 대부분 파편 100-200 bp에서 배열 했다 하지만 큰 조각 후 (최대 500 bp) 표시 했다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig3.jpg"> 그림 3: 세포학 도구. 프로토콜에 사용 되는 도구: (1) 쌍 집게 (#5 Dumont); (2) 텅스텐 바늘; (3) 깊은 우물 접시 커버; (4) 얕은 유리 해 부 접시; (5) 가져온된 파스퇴르 피 펫입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig4.jpg"> 그림 4입니다. Oocytes를 압 연에 대 한 슬라이드의 운동과 배치. (A) 슬라이드의 다이어그램 프로토콜에 설명 된 대로 oocytes의 압 연에 대 한 설정. 어두운 영역 슬라이드의 젖 빛된 유리 부분을 나타냅니다. (B) 압 연 oocyte 중 슬라이드 # 2에 대 한 이동 벡터의 방향. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56802/56802fig5.jpg"> 그림 5입니다. 물고기 시험 결과. (A) 회로도 초파리 X 염색체와 2 개의 프로브 (각 6 BACs) 팔 및 프로토콜에 설명 된 22 oligonucleotide pericentromeric 프로브 교배 묘사. 편의상, 6E-7B 프로브 7B 표시 됩니다. 및 C 2 층-3 조사 3 C. 표시 됩니다. (B) 물고기 (6E-7B 프로브)에 대 한 결과 그대로 팔 단결력 (두 팔 프로브 명소, 체 당 하나) 방해 팔 단결력 (3 ~ 4 팔 프로브 명소)에 대 한의 대표 이미지. DNA는 파란색, 팔 프로브 신호 노란색 이며 pericentric 프로브 신호는 빨간색. 이미지는 deconvolution 및 대비 향상 후 Z 시리즈의 최대 강도 계획에 해당합니다. 눈금 막대 2 µ m =. 이 그림 참조19에서 적응 시켰다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56802/56802fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes at JoVE.com

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Developmental Biology

Genetics

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

11.3K 조회수.  Dartmouth College. 이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

비디오: Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

연구

발생학

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...