우리 biofilm 분석에 유용한 토론 Nobile 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 이 연구는 건강 (NIH) 부여 R21 AI125801 (C.J.N.)의 국가 학회에 의해 지원 되었다. D.L.R.는 멕시코와 미국 (UC-MEXUS)와 Consejo 나시오날 드 많은 y Technologia (CONACYT) 캘리포니아 연구소의 대학에서 박사 과정 장학금에 의해 지원 되었다.

<ol>
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고모 J. Nobile BioSynesis, Inc., 저 해제 및 C. albicans biofilms의 진단 개발 회사의 설립자 이다.

여기에 설명 된 사용자 지정 가능한 미세 biofilm 분석 결과 수에 biofilm 형성의 시각화에 대 한 고정된 속도 층 흐름과 일정 한 온도에 노출 되 면 단일 셀 수준에 실시간으로. 그것은 야생 형 및 돌연변이 체 긴장에 biofilms의 개발 연구에 강력한 수단을 제공 하 고 생리 조건 모방 조건 하에서 biofilms에 항균 성 에이전트 처리의 효과 임상 설정에서 관찰. 대부분 체 외에서 biofilm 분석 실험와 달리이 메서드는 실시간으로 개발 biofilm의 시험에 대 한 수 있습니다 그것은 형성 하는으로.
24 샘플까지 될 수 있는 동시에 biofilm 형성 평가 실행 높은 처리 방식으로이 메서드를 사용할 수 있습니다. 메서드는 정상적인 biofilm 개발에 필요한 유전자를 식별 하기 위해 돌연변이 라이브러리의 유전 스크린을 사용할 수 있습니다 하 고 화합물 라이브러리 화면에 대 한 관심의 항균 성 화합물의 biofilms에 대 한 유효성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는이 미세 소자의 미래 응용 프로그램 같은 화면 포함 됩니다 예상. 그러나 우리는 주의, 그 특정 약물 치료 테스트 제한 됩니다 biofilms에 대 한 성장으로이 미세 소자를 사용 하 여 형성 된 biofilm의 두께 의해 &#62; 16 h 보기 채널을 췄 다 경향이 있다. 따라서, 약물 테스트 실험 수행 될 필요가 있을 것 이다 &#60; 16 h.
전반적으로,이 장치는 매우 사용자 정의 하 고 다양 한, 그리고 왕국, 유량, 온도, 보육 시간, 및 미디어에 걸쳐 종 미생물을 평가 하기 위해 조정 될 수 있다. 설명 하는 방법을 biofilm 형성, 초기 세포 부착, biofilm 성숙, 세포 분산 등의 다양 한 측면의 숫자에 대 한 정보를 제공 합니다. 비록 우리가 단일 종 biofilm 형성 여기에 대 한 결과 보고,이 프로토콜 또한 듀얼 및 혼합 종 biofilm 형성 연구에 적용할 수 있습니다.
두 단계는이 프로토콜을 성공적으로 수행 하려면 중요 합니다. 첫째, 시스템에서 공기 방울 실험 온도에서 미디어를 예 열 하 여 피해 야 한다. 한 일반적인 실수는 하지 preheated은 미디어에서 셀의 희석. 셀 입구 우물에 사용 되는 동일한 미디어에 희석 한다. 둘째, 웰 스는 신중 하 게 모니터링 해야 합니다; 입구에 콘센트에서 셀의 흐름 셀 흐름 너무 멀리, 입구 미디어 오염 되 고 실험 해석할 결과 생성 하지 것입니다. 다른 한편으로, 셀 셀 실험 기간 동안 채널에 표시 됩니다 모든 방법 보기 채널으로 이동 하려면 허용 되지 않는, 경우 빈 이미지를 선도. 마음에 계속 추가 키 포인트는 볼륨 및 미세 플레이트에 웰 스 사이의 움직임 연결 함께 각 열에 대 한 가능한 많은 미디어 일관성을 유지 하는 것이 중요 하다 (유사한 점도와 밀도, 셀 및 구성)와 비슷한 크기의 셀 (가능한 경우), 다른 미디어와 다른 셀 크기 열에서 다른 흐름 율을가지고 것입니다. 실험, 동안 셀의 혈 류 현미경;를 사용 하 여 모니터링은 그러나, 두 개의 채널 (10 X 목표를 사용 하 여) 한 번에 볼 수 있습니다. 따라서, 좋습니다 입구 웰 스 셀을 사용 하 여 콘센트에서 흐름 하는 데 필요한 시간을 측정 하는 모의 실험을 수행 하 고 미디어 실제 실험에 사용 될 계획.
일반적으로 좋습니다이 미세 biofilm 분석 결과의 분석 결과 생체 외에서 vivo에서 동물을 테스트 하기 전에 활용으로 사용을. 그러나 분석 결과,, 아직도 시험관에서 분석 결과, 고 결과 관련 동물 모델에서 유효성을 검사할 필요가 있을 것 이다. 우리의 경험에서이 미세 biofilm 분석 결과의 결과 최고의 예측 값 했다 vivo에서 biofilm 분석 실험 분석 실험 체 외에 다른과 비교에 대 한14를 평가 했습니다.

그러나 그것은 또한는 기회 주의 병원 체, 표면 하 고 심한 곰 팡이 감염1,2를 일으키는 능력이 candida albicans 인간의 microbiota의 공생 회원입니다. C. albicans 의 주요 독성 특성 양식 복구 하는 기능 이며, 약물 내성 biofilms, 세포의 표면에 준수 고 기질 소재1,3에. C. albicans biofilms는 고도로 구조화, 포함 하는 여러 종류의 세포 여러 레이어 (신진 효 모-양식 라운드 셀, 타원형 pseudohyphal 셀 및 관 hyphal 셀)4. C. albicans biofilm 개발 표면에,이 세포의 확산에 의해 따라 (에서 biofilm 시드), 표면에 둥근 효 모 형태의 세포의 부착으로 시작 하 고 다음 미 숙 biofilm의 성숙으로 구조를 완벽 하 게 형성 된 biofilm 기질 소재4에 의해 둘러싸여. 성숙한 biofilm biofilm4건축 안정성을 제공 밀도 연결 네트워크를 형성 하는 길쭉한 hyphal 세포 주로 구성 됩니다. Biofilm 라이프 사이클에 걸쳐 신진 효 모 라운드 세포 성숙 biofilm에서 분산 하 고 전파 감염 시키거나 다른 사이트4,5에서 새로운 biofilms 씨앗 몸의 다른 지역에 여행 수 있습니다. C. albicans 는 biotic 표면, 점 막 표면에와 같은 및 호스트 조직, 전체에 카 테 터, 심장, 틀니, 인공 관절 등의 비 생물 적인 표면에 biofilms를 형성할 수 있다. Biofilms의 고집 불통 속성으로 인해 그들은 매우 어려운 근절, 그리고 많은 경우에서 유일 하 게 효과적인 치료 전략은 감염 된 장치4의 제거. 따라서 조사 임상 설정에서 관찰 된 것과 유사한 조건 하에서 biofilm 형성에 결정적 이다.
몇 가지 중요 한 vivo에서 동물 모델이 C. albicans biofilm 형성6,,78; 공부 하는 데 사용 그러나, 이러한 연구 비용, 시간이 소요 될 수 있으며 긴장 및 한 번에 테스트할 수 있는 항균 성 대리인의 수에 의해 제한 됩니다. 생체 외에서 biofilm 분석 실험, 다른 한편으로, 항진균 성 화합물 및 돌연변이 체 긴장의 급속 한, 높은 처리량 평가 대 한 허용 하 고 훨씬 더 비용 효율적이 고 윤리적인 biofilm 분석 실시 보다는 동물에서 모델9, 10,,1112,,1314. 여기는 생체 외에서 분석 결과 우리가 개발 하 고 사용자 지정 가능한 미세 장치14,15를 사용 하 여 층 류에서 일시적으로 biofilm 형성을 관찰 하도록 최적화에 대해 설명 합니다. 분석 결과 시각화 biofilm 형성, 초기 부착 단계, 세포 증식, biofilm 성숙, 세포 분산 등의 각 단계에 대 한 수 있습니다. 분석 결과 시각화는 biofilm의 개발을 통해 세포 형태학 변화에도 유용 합니다.
일반적으로 체 외에서 biofilm 분석 실험, 높은 처리량을 동안에 대 한 활용 결정 접시 제어 흐름 조건에 대 한 허용 하지 않습니다. 전통적인 층 흐름 전지 시스템 제어 흐름 조건에서 biofilm 형성의 지속적인 평가 대 한 허용 하지만 이러한 시간이 소요를 설정 하 고 동적 범위 컨트롤 및 처리량 제한 하는 경향이 많습니다. 여기 활용 미세 장치 내장 층 류 챔버와 높은 처리량 판 (48 웰 스 포함)를 결합 하 여 이러한 한계를 극복 하 고 매우 재현 하 고 다재 다능 한, 사용자 정의.
우리가 야생-타입 C. albicans 의 biofilm 형성 평가를 상업적으로 사용할 수 있는 자동화 미세 장치 사용에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기, 스트레인, biofilm, biofilm의 개발에 알려진 항진균 제의 효과 두 돌연변이 체 긴장 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ) 이전 biofilm를 보고 된에서 대형 생체 외에서 그리고 vivo에서16,,1718결함. Biofilm의 개발을 통해 biofilm 형성 억제에 항균 성 대리인의 효능을 테스트 하 고 돌연변이 라이브러리를 검사 하 여 정상적인 biofilm 개발에 필요한 유전자를 식별 하는 설명된 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioFlux 1000z</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td></td>
			<td>Automated microfluidic device for live cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate 0-20 dyne</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0047</td>
			<td>Microfluidic plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montage Software</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Version 7.8.4.0</td>
			<td>Visualization analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-Mannitol</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Inoculating Loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and Cuvette Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of biofilm formation in candida albicans using an automated microfluidic device

Candida albicans 인간의 병원 획득 패 혈 증 경우의 약 15%를 일으키는 가장 일반적인 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans 의 주요 독성 특성은 그것의 양식 biofilms 능력, biotic 및 abiotic 표면에 연결 된 세포의 구조적된 커뮤니티. C. albicans biofilms 호스트 조직, 점 막 층, 같은 카 테 터, 심장, 의치, 공동 prostheses 등 의료 기기에 형성할 수 있다. 그들은 물리적, 화학적 물결에 높게 저항 하기 때문에 씨앗에 저수지 전파 감염으로 작동할 수 있다 Biofilms 중요 한 임상 도전 포즈. 분석 실험 체 외에 다양 한 C. albicans biofilm 형성, 결정 플레이트 분석 실험, 건조 중량 측정, 세포 생존 능력 분석 실험, confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 등 공부를 이용 되어 있다. 이 분석 실험의 모두 단일 끝점 분석 실험, biofilm 형성 특정 시간에 평가 됩니다. 여기, 우리 층 흐름 조건 하에서 자동된 미세 장치를 사용 하 여 실시간에 biofilm 형성 연구 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 biofilm 혈관 카 테 터에서 발생 하는 등 호스트의 모방 하는 사용자 지정 조건을 사용 하 여 시간이 지남에 개발로 biofilm 형성의 관찰에 대 한 수 있습니다. 유전 돌연변이의 biofilm 결함 뿐만 아니라 실시간으로 biofilm 개발에 항균 성 대리인의 억제 효과 평가 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

우리 수행 미세 biofilm 분석 결과 설명 여기 야생-타입을 사용 하 여 두 미디어 조건 (RPMI 1640 그리고 거미 미디어) C. albicans 스트레인, 알려진된 항진균 약물 RPMI, 암포 B (16 µ g/mL)의 야생-타입 스트레인 그리고 2 개의 돌연변이 체 긴장 이전 거미 미디어에 biofilm 형성 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ)에서 결함을 보고.
비디오 1 RPMI 1640 매체에 biofilm 형성에 항진균 약물, 암포 B의 효과 야생-타입 biofilm의 개발을 보여 줍니다. 야생-타입 조건 하에서 여러 셀으로 강하게 준수, 셀 형성 시간 진행 되는 동안, 균 고 두꺼운 biofilm 균 intercalating으로 관찰 될 수 있다 효 모 세포. 미세 실험의 끝, 야생-타입 biofilm 완전히 보기 채널을 채웁니다. 그러나 암포 B의 존재는, 감소는 biofilm에 뚜렷한 효과가 있다. 특히, 세포의 부착을 점감 하 고, 치료 조건, 암포 B, 존재와 달리 여러 셀 볼 수 있는 미디어의 전단 흐름 멀리 흐르는. 시간 진행, 양식 균을 세포 실패와는 biofilm 형성 하지 됩니다. 이러한 차이 그림 3, 4 시간-포인트 0 h, 2 시간, 6 h, 12 h에서 분석 결과에서 묘사에 표시 됩니다.
비디오 2 보여줍니다 야생-타입 biofilm의 개발 그리고 2 이전 거미 미디어에 biofilm 결함 돌연변이 (bcr1 Δ/Δ와 Δ/Δ efg1 )을 보고. 두 bcr1 Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ 긴장 심각 하 게 감소 biofilm 형성 isogenic 야생-타입 스트레인에 비해 표시. Efg1 Δ/Δ 스트레인에 대 한 준수 세포 균을 형성 하지 않는다 고 결과 biofilm 심각 결함이 관찰 합니다. Bcr1 Δ/Δ 스트레인에 대 한 우리는 것이 관찰 뿐만 아니라 bcr1 Δ/Δ 스트레인 biofilm 형성, 하지만 그것에 결함이 또한 명확한 준수 결함, 세포를 볼 수 있는 표시에 실패 그들이 전단 흐름의 방향으로 표류는 채널 보기. 이러한 차이 그림 4, 0 h, 2 시간, 6 h, 12 h에서 분석 결과에서 4 시간 포인트 묘사에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig1.jpg"> 
그림 1:이 실험에서 사용 된 미세 기계. 패널 A 미세 악기 사용, B 보여줍니다 인터페이스 플레이트 패널 C 보여줍니다 단일 보기 채널 (단계)와 3 개의 하위 단계, 실험 기간 동안 카메라에 의해 촬영의 도식 개요 패널 표시 및 패널 D 48-잘 미세 판 출구와 입구 우물과 보기 창의 회로도 함께 사용의 도식 개요를 보여 줍니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig2.jpg"> 
그림 2: modulesoftware 및 미세 판 이미징의 선택 스크린샷 제어 시스템. A 패널 제어 모듈 미세 플레이트에 대 한 컨트롤을 포함 하 고 패널 B 이미징 모듈 창, ' 이동 무대 절대 위치 ' (지도) 모듈, ' 다차원 수집 ' (MDA) 모듈 그리고 ' 샘플 로드 조정 ' (SRA) 모듈. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig3.jpg"> 
그림 3: 노출 암포 b biofilm 형성 결함 발생. RPMI-1640 미디어 (열 1), 및 미세 시스템에 12 h 후 준수에 대 한 37 ° C에서 16 µ g/mL에서 동적 흐름 (0.5 다 인/cm2) 암포 B (열 2) 보충 RPMI 1640 미디어 biofilm 형성의 시간 종속 시각화. 대표 오 (후 준수 및 초기 세척), 2 시간, 6 h와 12 h 이미지 (위에서 아래로) 표시 되어 있습니다. isogenic 야생-타입 스트레인 SN250 (열 1 및 2). 스케일 바 각 패널에서 20 µ m입니다. Biofilm 형성의 해당 시간 경과 비디오 비디오 1에 제공 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig4.jpg"> 
그림 4: BCR1 또는 EFG1 의 삭제 biofilm 형성 결함 발생합니다. 미세 시스템에 12 h 후 준수에 대 한 종속 시각화 거미 미디어 (열 1-3) 37 ° C에서 동적 흐름 (0.5 다 인/cm2) 아래에 biofilm 형성의 시간. 대표 오 (후 준수 및 초기 세척), 2 시간, 6 h와 12 h 이미지 (위에서 아래로) 표시 되어 있습니다. isogenic 야생-타입 스트레인 SN250 (열 1), bcr1Δ/Δ 스트레인 (열 2), 및 efg1 Δ/Δ 스트레인 (열 3). 스케일 바 각 패널에서 20 µ m입니다. Biofilm 형성의 해당 시간 경과 비디오 비디오 2에 제공 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
비디오 1: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/Video-1-WT_and_WT_plus_AmpB.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
비디오 2: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/Video-2-WT_bcr1_efg1_Mutants.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device at JoVE.com

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

10.5K 조회수.  University of California, Merced. 이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.

비디오: Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

연구

면역학 및 감염병학

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...